本发明涉及一种药物组合物及其在制备治疗癌症药物中的应用，属于生物制药
技术领域：
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背景技术：
：程序性死亡受体1(ProgrammedDeath-1；PD-1)，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员,其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。PD-1主要是在激活的T细胞和B细胞中表达，具有抑制细胞激活的功能，这是免疫系统中一种正常的自稳机制，因为过度的T/B细胞激活会引起自身免疫疾病，所以PD-1相当于人体内的一道护栏。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体PD-L1(细胞程式死亡-配体1或表面抗原分化簇274或B7同源体)。肿瘤细胞上表达的PD-L1和T细胞表面的PD-1相互作用，导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活，T细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞。PD-1单克隆抗体可以通过阻断这一通路，部分恢复T细胞的功能，进而利用激活的T细胞和相应的细胞因子杀伤肿瘤细胞，从而其成为癌症免疫疗法的重要治疗手段。研究表明，双歧杆菌在抗肿瘤方面也具有重要的作用。双歧杆菌是从母乳营养儿的粪便中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性杆菌，其可以通过调整肠道正常菌群，抑制肠道许多腐生菌生长，从而减少一些致癌物质产生，双歧杆菌具有激活机体巨噬细胞或LAK细胞的吞噬活性，并产生一定量的细胞因子如TNF—aINF—V等可直接杀死肿瘤细胞。抑制肿瘤内血管形成，破坏肿瘤组织微血管，最终导致出血、坏死。由于PD-1单克隆抗体和双歧杆菌，一种属于生物大分子物质，一种属于益生菌，现有技术中往往将两者分开使用，一种直接作为药物使用，另一种则作为益生元添加保健食品或发酵制备乳制品，现有技术中尚没有将二者混用的报道。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种药物组合物以及该药物组合物在制备治疗癌症药物中的用途，所采取的技术方案如下：本发明的目的在于提供一种药物组合物，该药物由PD-1单克隆抗体与双歧杆菌菌液两种成分组成。优选地，所述PD-1单克隆抗体的质量(mg)与双歧杆菌的体积(ml)组合配比为1～2:1～2。更优选地，所述PD-1单克隆抗体的质量(mg)与双歧杆菌的体积(ml)组合配比为1:1。更优选地，所述PD-1单克隆抗体的使用含量为2mg/kg；所述双歧杆菌的活菌数为1×107cfu/mL。以上任一所述的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。优选地，所述癌症为肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、宫颈癌、血癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌。优选地，所述癌症为黑色素瘤。本发明获得的有益效果：PD-1单克隆抗体是人或动物中一种免疫抑制分子，而双歧杆菌是一种用于奶制品加工中的益生菌。发明人创造性的将两者结合使用，通过实验验证，发现两者联合使用能够十分有效的抑制肿瘤的增长，二者的具有协同作用，能够明显地提高PD-1单克隆抗体治疗癌症的功效。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。实施例1PD-1单克隆抗体和双歧杆菌联合治疗对小鼠黑色瘤的抑制作用(1)小鼠黑色素瘤模型的建立采用皮下抑制模型，便于观察肿瘤生长情况。无菌操作下抽取腹腔积液型B16黑色素瘤鼠的腹腔积液，台盼蓝染色检查癌细胞成活率，成活率大于95％的腹腔积液瘤细胞用无血清培养基调至1×107/mL。取正常6周龄裸鼠25只，每只老鼠体重约为20g，在每只裸鼠右侧鼠鼠鼷处皮下注射0.2mL细胞悬液，10d于接种出长出2～3mm瘤时，小鼠黑色素瘤模型制作成功。(2)分组及处理造模后小鼠随机分成5组，每组5只，双歧杆菌和PD-1抗体用PBS溶解，分别包括PBS对照组(腹腔注射灭菌PBS1mL/d)，PD-1单抗处理组(腹腔注射1mL2mg/kg/d)，PD-1单抗和双歧杆菌联合处理组(PD-1单抗腹腔注射1mL2mg/kg/d和双歧杆菌1×107cfu/mL)，双歧杆菌处理组(1mL双歧杆菌1×107cfu/mL)，CTX(化疗药环磷酰胺)(腹腔注射CTX15mg/kg/d)，与接种瘤细胞后次日开始给药，连续给药12d。(3)对小鼠黑色素瘤抑制作用的研究停药次日并称重处死小鼠，解剖剥离肿瘤块，称瘤重，按平均瘤重计算抑瘤率。抑瘤率＝[(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积]×100％。(4)实验结果结果显示，处理组与PBS对照组相比，前者明显抑制了小鼠B16黑色素瘤的生长，PD-1单抗处理组、PD-1单抗和双歧杆菌联合处理组和双歧杆菌处理组的抑瘤率分别为35.83％、31.33％、55.31％。其中，PD-1单抗和双歧杆菌联合处理组和其他两组相比，有显著差异(P<0.05).说明，PD-1单抗和双歧杆菌联合使用抑制黑色素瘤效果要高于其他各组(见表1)。表1各组对小鼠黑色素瘤的抑制效果实施例2PD-1单克隆抗体和双歧杆菌联合治疗对肿瘤中血管生成的影响以及细胞周期和凋亡的变化。(1)小鼠黑色素瘤模型的建立采用皮下抑制模型，便于观察肿瘤生长情况。无菌操作下抽取腹腔积液型B16黑色素瘤鼠的腹腔积液，台盼蓝染色检查癌细胞成活率，成活率大于95％的腹腔积液瘤细胞用无血清培养基调至1×107/mL。取正常6周龄裸鼠25只，每只老鼠体重约为20g，在每只裸鼠右侧鼠鼠鼷处皮下注射0.2mL细胞悬液，10d于接种出长出2～3mm瘤时，小鼠黑色素瘤模型制作成功。(2)分组及处理造模后小鼠随机分成5组，每组5只，双歧杆菌和PD-1抗体用PBS溶解，PBS对照组(腹腔注射灭菌PBS1mL/d)，PD-1单抗处理组(腹腔注射1mL2mg/kg/d)，PD-1单抗和双歧杆菌联合处理组(PD-1单抗腹腔注射1mL2mg/kg/d和双歧杆菌1×107cfu/mL)，双歧杆菌处理组(1mL双歧杆菌1×107cfu/mL)，CTX(化疗药环磷酰胺)(腹腔注射CTX15mg/kg/d)，与接种瘤细胞后次日开始给药，连续给药12d。(3)Ⅷ-RAg免疫组化和流式细胞仪检测小鼠黑色素瘤血管形成、细胞周期及凋亡率按免疫组化试剂盒检测小鼠黑色素瘤血管的形成:常规脱蜡至水；质量分数为3％的H2O2孵育以消除内源性过氧化氢酶活性；先后用枸橼酸盐缓冲液、质量分数为0.1％的胰蛋白酶修复抗原；标本经封闭液作用后,依次滴加适当比例稀释的一抗(Ⅷ-RAg多克隆抗体)、生物素标记的二抗和辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素；DAB显色,苏木素复染核；梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。光镜下观察血管内皮细胞染色情况。细胞周期及凋亡率检测：将新鲜的肿瘤制成单细胞悬浮液1×107/L，离心弃上清，加入DNAPrepLRP210μl，DNA-PrepStain2.2ml，混匀，避光，染色，室温30min。用流式细胞仪进行检测(Cellquese软件获取)，获得DNA直方图，据所测得的DNA直方分布图，用细胞周期分析软件modfit进行细胞周期各时相分布及凋亡率的分析。(4)实验结果结果显示，处理组与PBS对照组相比，处理组明显抑制了小鼠B16黑色素瘤的血管形成，PD-1单抗处理组、PD-1单抗和双歧杆菌联合处理组和双歧杆菌处理组的平均每个视野的微血管数分别为61、42、77。利用SPSS10软件分析，PD-1单抗和双歧杆菌联合用药微血管数少于其他各组，并且达到差异显著性P<0.05。对细胞周期和凋亡率分析的结果显示，处理组与PBS对照组相比，可使细胞周期阻滞在S期，抑制肿瘤DNA合成，进而抑制肿瘤细胞增殖。PD-1单抗和双歧杆菌联合用药组的阻滞作用高于其他各组，其中对照组、PD-1单抗处理组、双歧杆菌处理组、PD-1单抗和双歧杆菌联合处理组和CTX处理组S期细胞比率分别为13.23％、17.81％、18.74％、21.66％、15.37％。肿瘤细胞凋亡率从大到小依次为PD-1单抗和双歧杆菌联合处理组>PD-1单抗处理组>双歧杆菌处理组>CTX处理组>对照组。实验结果见表2和表3。表2各组药物对B12黑色素瘤细胞周期的影响表3各组药物对B12黑色素瘤细胞凋亡率的影响使用药品肿瘤细胞凋亡率PBS(对照)(0.77±0，031)％PD-1单抗(12.87±2.37)％双歧杆菌(1.87±0.04)％PD-1单抗&双歧杆菌(22.76±1.57)％CTX(1.53+0.38)％实施例3PD-1单克隆抗体和双歧杆菌联合治疗小鼠黑色瘤的最佳比例。(1)小鼠黑色素瘤模型的建立采用皮下抑制模型，便于观察肿瘤生长情况。无菌操作下抽取腹腔积液型B16黑色素瘤鼠的腹腔积液，台盼蓝染色检查癌细胞成活率，成活率大于95％的腹腔积液瘤细胞用无血清培养基调至1×107/mL。取正常6周龄裸鼠25只，每只老鼠体重约为20g，在每只裸鼠右侧鼠鼠鼷处皮下注射0.2mL细胞悬液，10d于接种出长出2～3mm瘤时，小鼠黑色素瘤模型制作成功。(2)分组及处理造模后小鼠随机分成9组，每组5只，分别命名为1～9组，每组PD-1抗体的使用质量(mg)与双歧杆菌的体积(ml)比分别为：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、5:1、4:1、3:1、2:1，其中PD-1单抗腹腔注射的剂量为2mg/kg/d，双歧杆菌的使用浓度为1×107cfu/mL。与接种瘤细胞后次日开始给药，连续给药12d。(3)对小鼠黑色素瘤抑制作用的研究停药次日并称重处死小鼠，解剖剥离肿瘤块，称瘤重，按平均瘤重计算抑瘤率。抑瘤率＝[(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积]×100％。(4)实验结果结果显示，实验1～9组的抑瘤率分别为55.31％、53.27％、46.71％、45.33％、29.35％、38.11％、42.32％、44.06％、49.16％。其中，PD-1抗体的使用质量(mg)与双歧杆菌的体积(ml)比为1:1和1:2时，抑瘤效果最佳。说明，PD-1单抗和双歧杆菌联合使用最优比例为1:1～2。2:1的比例次之。实验结果件表4。表4各组对小鼠黑色素瘤的抑制效果虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页1 2 3