本发明涉及一种人源化抗PD-1单克隆抗体的水针制剂。
背景技术：
：PD-1是CD28家族成员，参与T细胞的免疫调节。配体PD-L1/L2，通常表达在抗原呈递细胞(APC)上，和PD-1结合后下调T细胞作用。大多数实体瘤(例如非小细胞肺癌，肝癌，胃癌，霍奇森淋巴瘤，肾细胞癌和黑色素瘤)细胞表面表达PD-L1，从而抑制T细胞活性。人源化抗PD-1单克隆抗体JS001产品由本公司自主研发(专利：201310258289.2)，JS001能够特异性与PD-1结合并阻断其与受体的相互作用，从而切断肿瘤细胞表面表达的PD-L1与T细胞PD-1的结合抑制，增强机体免疫力，达到抗癌目的。抗体制剂在用于受试者之前必须预先制备，并经过贮存及运输的过程。而抗体在贮存及运输过程中可能会发生多聚或修饰改变、活性降低等变化，这些变化会使受试者出现免疫毒性或效用降低，因此需要一种稳定的制剂来保证抗体到达受试者体内前仍具有其治疗所需的生物活性。这种制剂适合药物长期贮存及运输中的稳定性。目前市场上尚无最适合于我们抗体稳定的制剂存在。技术实现要素：本发明提供一种工艺简单合理，成本低廉，稳定性强的制剂。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种稳定的抗PD-1单克隆抗体制剂，制剂由人源化抗PD-1单克隆抗体JS001、缓冲液、等渗调节剂和表面活性剂组成。本发明公开的制剂为水针制剂。本发明制剂配方简单，蛋白体系稳定。便于大规模生产、贮存和运输。枸橼酸缓冲液、组氨酸缓冲液和乙酸缓冲液具有很强的缓冲能力和对蛋白的保护能力。缓冲pH范围5.0～6.5，更优选5.5～6.5。抗PD-1单克隆抗体水针制剂蛋白含量为10-60mg/mL，更优选为25-50mg/mL。本发明等渗调节剂选择氯化钠、蔗糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖之一或其组合，更优化为125mMNaCl、250mM蔗糖、250mM甘露醇、250mM山梨醇、250mM海藻糖、200mM蔗糖与氯化钠(两者比例在1∶1到3∶1范围内)、200mM甘露醇与氯化钠(两者比例在1∶1到3∶1范围内)、200mM山梨醇与氯化钠(两者比例在1∶1到3∶1范围内)、200mM海藻糖与氯化钠(两者比例在1∶1到3∶1范围内)之一。在本发明抗PD-1单克隆抗体制剂中，等渗调节剂更优选150mM蔗糖+50mM氯化钠、150mM甘露醇+50mM氯化钠、150mM山梨醇+50mM氯化钠、150mM海藻糖+50mM氯化钠。本发明表面活性剂选择0.01％-0.2％聚山梨酯20、0.01-0.2％聚山梨酯80或两者组合。在本发明抗PD-1单克隆抗体制剂中，表面活性剂更优选为0.01％～0.02％聚山梨酯20或0.01％～0.02％聚山梨酯80。具体实施方式下面结合实施例对本发明进一步说明。实施例一：抗体制剂筛选实验抗体制剂制备方法：通过透析作用将抗体换液到目的缓冲液中，样品为三步纯化后的单克隆抗体。置于4℃冰箱中透析换液3次。透析后的样品进行分装后取一份样品冻存于-80℃冰箱中，同时放置于4℃和40℃的样品分别在第2周第4周取出进行分析检测，检测项目包括活性、SEC-HPLC和CEX-HPLC。缓冲液组成：枸橼酸缓冲液：枸橼酸缓冲液0.5M枸橼酸0.5M枸橼酸钠pH5.036.5％63.4％pH5.526.5％73.5％pH6.015.0％85.0％组氨酸缓冲液：组氨酸缓冲液0.5M组氨酸0.5M组氨酸盐酸pH5.522.5％77.5％pH6.050.0％50.0％pH6.570.0％30.0％乙酸缓冲液：乙酸缓冲液0.5M乙酸0.5M乙酸钠pH5.029.6％70.4％pH5.513.6％86.4％pH6.02.4％97.6％分析检测方法：浓度检测：用紫外吸收法测定。纯度检测：分子尺寸排阻高效液相色谱法分析。活性检测：抗体与PD-1结合ELISA实验及与PD-L1竞争抑制ELISA实验电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异质体主峰含量。缓冲液pH值选择依据：通过SEC-HPLC方法考察JS001在40℃条件下放置2周和4周后的单体含量，从而确定抗体稳定的最佳pH。以试验起始(0W)、放置两周(2W)和放置四周(4W)的单体含量，拟合直线并计算下降斜率(％/周)；平均下降斜率为JS001在两种不同抗体浓度(10mg/mL和60mg/mL)下降斜率的平均值；筛选标准为两个浓度下单体平均下降速率≤0.25％/周；同时初步考察等渗条件下不同辅料(7.3g/L氯化钠，25.0g/L蔗糖或45.5g/L甘露醇)对抗体稳定性的影响。枸橼酸缓冲液中JS001在不同pH值下单体含量汇总见表1-1所示；组氨酸缓冲液中JS001在不同pH值下单体含量汇总见表1-2所示；乙酸缓冲液中JS001在不同pH值下单体含量汇总见表1-3所示。表1-1JS001在枸橼酸缓冲液中不同pH值下单体含量(SEC-HPLC)表1-2JS001在组氨酸缓冲液中不同pH值下单体含量(SEC-HPLC)表1-3JS001在乙酸缓冲液中不同pH值下单体含量(SEC-HPLC)从表1-1、1-2和1-3可以看出，无论是在枸橼酸缓冲液、乙酸缓冲液还是在组氨酸缓冲液中，抗体制剂在pH5.0～6.5范围内均可保持相对稳定，最佳的pH条件为5.5～6.5。缓冲体系选择依据：在最佳pH条件下，我们进一步对缓冲体系选择进行研究比较，从而选出可使抗体最为稳定性的缓冲液成份及浓度。分别配制枸橼酸缓冲液和组氨酸缓冲液，通过CEX-HPLC检测电荷异构体主峰含量，并对电荷异构体主峰基础值的影响进行分析。结果见表1-4所示：表1-4枸橼酸缓冲液和组氨酸缓冲液中抗体电荷异构体主峰含量(0W)从表1-4可以看出，抗体在三种制剂缓冲液中电荷异构体主峰含量均相对稳定，且不同浓度下无显著差异。由于枸橼酸缓冲液更优，我们进一步选择枸橼酸缓冲液进行辅料添加物筛选。辅料选择依据：在最佳pH和缓冲液组成确定条件后，我们进一步对添加辅料进行研究比较，从而选出可使抗体最为稳定性的辅料添加物，同时考察不同辅料之间有无协同作用。在枸橼酸缓冲液中分别添加125mM氯化钠、250mM蔗糖、250mM甘露醇、250mM山梨醇、250mM海藻糖、100mM蔗糖+100mM氯化钠、100mM甘露醇+100mM氯化钠、100mM山梨醇+100mM氯化钠、100mM海藻糖+100mM氯化钠、150mM蔗糖+50mM氯化钠、150mM甘露醇+50mM氯化钠、150mM山梨醇+50mM氯化钠、150mM海藻糖+50mM氯化钠，40℃放置4周后进行活性及纯度检测。从表1-5中SEC-HPLC纯度数据可以看出，在枸橼酸缓冲液中添加各种辅料以调节渗透压对JS001有显著的稳定作用，单体平均下降速率均≤0.3％/周。表1-5在枸橼酸缓冲液pH6.0下辅料对单体含量(SEC-HPLC)的影响进一步试验我们利用PD-1抗原结合Elisa方法检测起始(0W)、放置两周(2W)和放置四周(4W)后JS001的生物活性。以起始值为参比，JS001生物学活性计算公式为：从表1-6活性数据可以看出，4周后JS001在两个不同浓度(10mg/mL和60mg/mL)下活性的下降均小于30％。在枸橼酸缓冲液pH6.0的条件下满足稳定性考察的要求。表1-6在枸橼酸缓冲液pH6.0下辅料对抗体活性(结合Elisa方法)的影响我们通过CEX-HPLC检测JS001稳定性考察后电荷异构体主峰的含量，筛选标准为40℃放置4周后JS001电荷异构体的主峰含量值：含量越高，稳定性越好。结果如表1-7所示，在枸橼酸缓冲液中(pH6.0)添加不同的辅料，JS001电荷异构体的主峰含量均较高，显示了良好的稳定性。表1-7在枸橼酸缓冲液pH6.0下辅料对抗体电荷异构体主峰含量的影响综合SEC-HPLC、结合Elisa活性和CEX-HPLC的结果，在枸橼酸缓冲液条件下(pH6.0)，添加125mM氯化钠、250mM蔗糖、250mM甘露醇、250mM山梨醇、250mM海藻糖、200mM蔗糖与氯化钠(两者比例1∶1或3∶1)、200mM甘露醇与氯化钠(两者比例1∶1或3∶1)、200mM山梨醇与氯化钠(两者比例1∶1或3∶1)、200mM海藻糖与氯化钠(两者比例1∶1或3∶1)，不同的制剂中抗体均相对稳定。我们选择单体含量、生物活性与电荷异构体主峰含量均为最佳的辅料添加物：50mM氯化钠+150mM甘露醇进行表面活性剂研究。表面活性剂选择依据：在确定抗体溶液的pH值、缓冲体系和辅料添加物后，我们进一步研究添加表面活性剂聚山梨酯20或聚山梨酯80对抗体稳定性的影响。在枸橼酸缓冲液pH6.0+氯化钠(2.92g/L)+甘露醇(25.00g/L)条件下，比较聚山梨酯20(0.001％、0.01％、0.20％、0.2％)、聚山梨酯80(0.001％、0.01％、0.20％、0.2％)、0.001％聚山梨酯20+0.20％聚山梨酯80、0.02％聚山梨酯20+0.02％聚山梨酯80、0.20％聚山梨酯20+0.001％聚山梨酯80对JS001(40mg/mL)40℃放置4周后关键质量属性的影响，具体结果见表1-8。表1-8添加表面活性剂对JS001稳定性的影响从表1-8可以看出，在添加不同浓度聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚山梨酯20和聚山梨酯80组合后，抗体制剂单体含量和电荷异构体主峰含量均具有很好的稳定性。通过对抗体活性(结合Elisa)、单体纯度(SEC-HPLC)及电荷异构体主峰纯度(CEX-HPLC)三个关键质量属性进行检查，我们最终选择抗体制剂处方为在pH6.0枸橼酸缓冲液中，添加2.92g/L氯化钠、25.00g/L甘露醇和0.20％聚山梨酯80。但仍需进一步对此优选处方下设计稳定性试验，验证抗体制剂的稳定性，具体参见实施例二。实施例二：处方验证实验处方验证试验包括冻融稳定性试验和25℃振摇稳定性试验，考察JS001储存在最终处方的稳定性。振摇稳定性实验：试验所用JS001蛋白来源于工作参比品，用优选的抗体制剂处方浓缩至所需浓度，进行振摇稳定性试验，分别水平振摇和圆周振摇3天。我们重点考察JS001单体含量(SEC-HPLC)、电荷异构体主峰含量(CEX-HPLC)和抗体活性(结合Elisa)，结果汇总见表2-1。表2-1抗体制剂振摇稳定性结果汇总冻融稳定性实验：试验所用JS001蛋白来源于工作参比品，用优选的抗体制剂处方浓缩至所需浓度，进行冻融稳定性试验，分别冻融1、3、5、6次。我们重点考察JS001单体含量(SEC-HPLC)、电荷异构体主峰含量(CEX-HPLC)和抗体活性(结合Elisa)，结果汇总见表2-2。表2-2抗体制剂冻融稳定性结果汇总综上所述，我们通过对不同缓冲体系，不同pH条件、不同抗体浓度以及不同等渗调节剂和表面活性剂组成进行考察，探索研究重组人源化抗PD-1单克隆抗体JS001的稳定性，并确定最佳水针制剂配方。以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。当前第1页1 2 3