二甲双胍作为治疗椎间盘退行性病药物中活性成分的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种二甲双胍作为治疗椎间盘退行性病药物中活性成分的应用。

背景技术：

二甲双胍是当前全球应用最广泛的口服降糖药之一，应用于临床已有５０多年的历史。二甲双胍具有良好的单药／联合治疗的疗效和安全性证据，以及良好的卫生经济学效益证据。无论对于血糖控制，还是糖尿病心血管并发症的预防，其都有明确的临床证据。因此，该药已成为全球控制糖尿病的核心药物。在我国，二甲双胍也已经有近２０年的使用经验。１９９５年，ＦＤＡ正式批准二甲双胍用于治疗II型糖尿病（Ｔ２ＤＭ），２００４年欧盟正式批准二甲双胍用于治疗１０岁以上的儿童Ｔ２ＤＭ。

目前，二甲双胍的医药用途主要集中在II型糖尿病上，虽然在抗肿瘤、抗癌方面也有发现，但并没有运用到对治疗椎间盘退行性病变的治疗上。

技术实现要素：

针对现行对二甲双胍了解认知不全面，本发明提供一种二甲双胍作为治疗椎间盘退行性病药物中活性成分的应用，系二甲双胍作为药物的新用途，说明二甲双胍对治疗椎间盘退行性病变具有良好效果。

本发明提供一种二甲双胍作为治疗椎间盘退行性病药物中活性成分的应用，即二甲双胍在治疗及延缓动物椎间盘退行性病变产品中的应用，二甲双胍分子结构式为：

。

所述二甲双胍的作用目标为椎间盘髓核细胞。

所述二甲双胍的使用方式为将二甲双胍溶于生理盐水制备为溶液，所述二甲双胍用量为50mg/kg/day。

本发明提供一种实现二甲双胍作为治疗椎间盘退行性病药物中活性成分的应用的药物，所述药物以二甲双胍为主要活性成分，并配合生物材料对二甲双胍进行包载形成的复合制剂，所述生物材料为并聚已酸内酯、聚乳酸-聚乙二醇、聚乙烯醇中任意一种。

所述药物活性成分为二甲双胍与抗退变药物相互配伍形成的主药，所述抗退变类药物包括：葡萄糖胺、雌激素、白藜芦醇、姜黄素中任一一种或几种。

本发明发现二甲双胍可以有效治疗及延缓动物椎间盘退行性病变，为治疗及延缓动物椎间盘退行性病药物制备奠定了基础，可以有效治疗和延缓动物椎间盘退行性病。

附图说明

图1为大鼠尾椎磁共振T2像对照图；

图2为priffmann分级评分对照图；

图3为椎间盘快绿番红SO对照图；

图4为椎间盘组织学评分对照图；

图5为髓核细胞凋亡相关蛋白印迹试验的对照图1；

图6为髓核细胞凋亡相关蛋白印迹试验的对照图2；

图7为Tunel试验检测细胞凋亡的对比图；

图8为用半乳糖苷酶试验（SAβ-gal）检测细胞衰老的对照图；

图9为衰老相关蛋白印迹试验的对照图1；

图10为衰老相关蛋白印迹试验的对照图2；

图11为实时定量PCR检测退变相关基因改变的对比图；

图12为免疫荧光检测退变相关基因的对比图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

试验例

新的适应症：

用于延缓及治疗动物椎间盘退行性病变。

实验证据支持新适应症

实验步骤如下：

（1）造模方法：取8周龄SD大鼠，每只重量在200-250g之间，使用4%水合氯醛麻醉后，经碘伏消毒，取大鼠第7、8节尾椎（Co7/8），27g穿刺针刺入，刺入长度为4mm，维持1min。

（2）将60只SD大鼠分成3组：依次为对照组、单纯椎间盘退变组和椎间盘退变后二甲双胍治疗组，椎间盘退变后二甲双胍治疗组在造模成功后每天腹腔注射二甲双胍治疗，所述二甲双胍为于北京索莱宝科技有限公司购置的盐酸二甲双胍，将二甲双胍溶于生理盐水，二甲双胍注射量为50mg/Kg/day。

（3）分别在损伤后第8周及第16周，进行大鼠尾椎磁共振检测，并用priffmann分级法评估椎间盘退变情况。

（4）在第8周及第16周取椎间盘组织进行快绿-番红SO染色，观察椎间盘髓核组织的退变及胶原改变。

（5）取大鼠的椎间盘髓核细胞给予过氧化氢（100µM）处理2小时模拟退变环境，再用二甲双胍(100µM)处理24小时，通过蛋白印迹方法以及凋亡检测试剂盒，检测各组的大鼠髓核细胞凋亡水平。

（6）在大鼠体外髓核细胞上通过蛋白印迹方法以及半乳糖苷酶检测试剂盒，检测各组的大鼠髓核细胞衰老水平。

（7）在大鼠体外髓核细胞上通过实时定量PCR及免疫荧光，检测各组的大鼠髓核细胞退变相关基因的改变。

实验结果：

（1）如图1、图2所示单纯椎间盘退变组的磁共振T2像显示，退变的椎间盘呈现明显的低信号，priffmann评分也相比对照组更低，而二甲双胍治疗后，椎间盘的低信号相对于疾病组有明显的提升，priffmann评分也升高了，这些结果证明了二甲双胍能显著延缓椎间盘退变程度。

（2）如图3、图4所示，对8周及16周的退变椎间盘进行番红-快绿染色，进行组织病理学观察，发现单纯椎间盘退变组退变后，椎间盘的组织结构紊乱，髓核细胞分布零散混乱，纤维环排列紊乱，细胞外基质胶原流失严重。而二甲双胍治疗后的模型动物的椎间盘，组织结构更加接近正常，髓核细胞分布相对规则，纤维环结构仍相对完整，细胞外基质保留更多。通过组织学评分后分析，二甲双胍治疗组的评分显著大于单纯退变组。

（3）如图5、图6和图7所示，通过蛋白印迹试验，我们发现髓核细胞在过氧化氢处理后凋亡蛋白表达显著提高，提示细胞发生凋亡，而二甲双胍治疗后可以明显抑制凋亡蛋白的表达，提示有效抑制了髓核细胞的凋亡。同时，我们对大鼠髓核细胞进行了TUNEL凋亡试剂盒的检测，得到相同的结果。

（4）参照图8、图9和图10可知，通过半乳糖苷酶试验，我们发现过氧化氢损伤能够促进增加髓核细胞的衰老，而二甲双胍治疗可以减轻细胞的衰老程度。对衰老相关蛋白p16INK4A的蛋白印迹分析，也证明了过氧化氢促进了衰老蛋白的表达，而二甲双胍可以下调该蛋白。

（5）由图11、图12可以看出，对细胞退变相关基因如Col2a1、aggrecan,MMP3, Adamts5等进行实时定量PCR检测后，发现过氧化氢能够抑制细胞外基质如Col2a1、aggrecan 基因的表达，而增加了MMP3, Adamts5 等降解酶基因的表达。而二甲双胍处理后，可以相对促进细胞外基质基因的表达，而抑制降解酶相关基因。对Col2a1 以及MMP3 的免疫荧光，也证实了相同的结果。

另外，本实施例作为已知结构的二甲双胍，可直接从市场采购或者化学合成，含二甲双胍的药物组合物可以是一些长效或者局部缓释制剂，例如，可以利用现代医学的一些生物材料，包括聚已酸内酯，聚乳酸-聚乙二醇，聚乙烯醇等等，包载二甲双胍，形成复合制剂。同时，二甲双胍也可以与一些已被证明有抗退变作用的药物相互配伍，形成新的复合制剂，这些抗退变类药物包括：维生素类如维生素C、E，雌激素类，中药类如白藜芦醇、姜黄素等。