本发明涉及医药，特别是苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒的制备及应用。
背景技术：
糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是目前病因和发病机理尚未完全认识的常见的内分泌代谢疾病。由于胰岛素分泌不足或作用缺陷所引起的以慢性高血糖为主,合并脂肪和蛋白质代谢紊乱为特征的综合征。胰岛素治疗糖尿病始于1922年，至今仍为治疗1型糖尿病的首选药物具有不可替代的作用。胰岛素的给药途径为皮下注射，每天注射胰岛素维持血糖水平，这在一定程度上反映糖尿病的控制情况，但这和正常生理条件下胰腺对血糖水平的调节和维持还相差很远，有可能会导致心血管疾病，肾病，白内障等。虽然近年来开发和研制了多种胰岛素的给药途径，但还不能根本克服血糖波动对患者的身体危害。因此发明一种“自调节”“可控式”“开-关”的根据体内葡萄糖浓度的变化释放胰岛素系统迫在眉睫。
介孔二氧化硅纳米粒子(mesoporous silica nanoparticles，MSN)具有在2～50nm 范围内可连续调节的均一介孔孔径、规则的孔道、稳定的骨架结构、易于修饰的内外表面和无生理毒性等特点，非常适合用作药物分子的载体。同时，MSN具有巨大的比表面积（＞900m2/g）和比孔容（＞0.9cm3/g），可以在孔道内负载各种药物，并可对药物起到缓释作用，提高药效的持久性。因此，近年来MSN在可控药物传输系统方面的应用日益得到重视，Chiyoung Park 等利用3- 氨基丙基三乙氧基硅烷先对介孔二氧化硅纳米粒子进行表面改性，使其表面带有氨基，进而再利用含端羧基的聚合物与氨基修饰介孔二氧化硅反应，在介孔二氧化硅表面修饰一层pH响应性聚合物，可控释放介孔二氧化硅孔道内的药物分子。虽然介孔二氧化硅作为药物载体已有很多研究，但做为可逆的“开-关”式药物载体系统却鲜见报道。
苯硼酸基团（phenylboronic acid, PBA）可以与含有邻二醇的化合物（如葡萄糖、聚乙烯醇）可逆结合五元或六元环可逆酯成为近年来的研究热点，因此，Kitano等将PBA引入聚（N-乙烯基-2-吡咯烷酮）中作为葡萄糖敏感分子形成聚（NVP-co-PBA）。PVA由于含有二羟基而与聚（NVP- co- PBA）形成复合物，将胰岛素加入该体系中，复合物的形成和解离可以引起黏度的变化，复合物形成时为凝胶状态，加入葡萄糖后与PVA竞争硼酸基团，随着葡萄糖浓度的增加，凝胶交联密度降低，变为溶胶态，胰岛素的释放增加，从而可得到响应于葡萄糖浓度变化的释放。但该类载体系统只能对药物进行一次装载和释放，不能循环进行，因此本发明致力于开发一种可逆的负载胰岛素系统。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒的制备及应用，可有效解决传统药物载体单向释放药物的问题。
本发明解决的技术方案是，首先合成介孔二氧化硅纳米粒，在其表面修饰氨基，然后通过物理吸附，在介孔结构内部负载药物胰岛素，再进一步修饰苯硼酸及多糖，得基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒；
包括以下步骤：
（1）制备介孔二氧化硅纳米粒：将摩尔浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液3.0-4.0mL 与400-500mL 蒸馏水混合，在75-85℃条件下搅拌加入1.0-1.2g 十六烷基三甲基溴化铵，再滴加5.0-5.8mL正硅酸四乙酯，搅拌1.5-2.5h，过滤，真空干燥，500-600℃煅烧3.5-4.5h ，得介孔二氧化硅纳米粒；
（2）介孔二氧化硅纳米粒的氨化：将400-600mg 介孔二氧化硅纳米粒分散于40-60mL 无水甲苯中，室温下搅拌，滴加1.0-2.0mL 3-氨丙基三甲氨基硅烷，搅拌25-35min ，加热升温至100-120℃，回流24h，抽滤，得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒；
（3）将40-60mg 氨基化介孔二氧化硅纳米粒和20-30mg 胰岛素溶解于40-60mL 盐酸溶液中，8-12℃ 避光搅拌24h，得到介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒；
（4）将步骤（3）所得的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒20-40mg 溶解到20-40mL 有机溶剂中得溶液A，将6.0-8.0mg 苯硼酸与10-14mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶解到5-10mL 有机溶剂中，搅拌30min得溶液B，将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌24h，得基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒；
所述的有机溶剂为乙醇，二甲基亚砜，二甲基甲酰胺或二氯甲烷中的一种。
所制备的苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒的粒径为150-170nm。
所述的苯硼酸具有葡萄糖响应性，多糖具有邻二醇结构，生物相容性好。
所述的胰岛素的载药量为23%-27%。苯硼酸与二氧化硅的质量比为1:3-5。
所制备的苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒在制备糖尿病治疗药物中的应用。
本发明方法制备的苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒可用于糖尿病药物的制备，能够自动感知患者体内的葡萄糖浓度变化，能够可逆的开放与关闭胰岛素的释放阀门，调控药物的释放与否，维持患者平稳的血糖水平，避免血糖波动诱发并发症。
本发明合成工艺简单，制备的纳米粒具有良好的生物相容性，能够反复开关药物的释放阀门，对于药物的释放具有缓控释作用，在体内能够长循环，减少给药次数，是糖尿病治疗药物上的创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
（1）制备介孔二氧化硅纳米粒：将摩尔浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液3.0mL 与400mL 蒸馏水混合，在75℃条件下搅拌加入1.0g 十六烷基三甲基溴化铵，再滴加5.0mL正硅酸四乙酯，搅拌1.5h，过滤，真空干燥，500℃煅烧3.5h ，得介孔二氧化硅纳米粒；
（2）介孔二氧化硅纳米粒的氨化：将400mg 介孔二氧化硅纳米粒分散于40mL 无水甲苯中，室温下搅拌，滴加1.0mL 3-氨丙基三甲氨基硅烷，搅拌25min ，加热升温至100℃，回流24h，抽滤，得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒；
（3）将40mg 氨基化介孔二氧化硅纳米粒和20mg 胰岛素溶解于40mL 盐酸溶液中，8℃ 避光搅拌24h，得到介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒；
（4）将步骤（3）所得的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒20mg 溶解到20mL 乙醇中得溶液A，将6.0mg 苯硼酸与10mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶解到5mL乙醇中，搅拌30min得溶液B，将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌24h，得基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒。
实施例2
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
（1）制备介孔二氧化硅纳米粒：将摩尔浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液4.0mL 与500mL 蒸馏水混合，在85℃条件下搅拌加入1.2g 十六烷基三甲基溴化铵，再滴加5.8mL正硅酸四乙酯，搅拌2.5h，过滤，真空干燥，600℃煅烧4.5h ，得介孔二氧化硅纳米粒；
（2）介孔二氧化硅纳米粒的氨化：将600mg 介孔二氧化硅纳米粒分散于60mL 无水甲苯中，室温下搅拌，滴加2.0mL 3-氨丙基三甲氨基硅烷，搅拌35min ，加热升温至120℃，回流24h，抽滤，得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒；
（3）将60mg 氨基化介孔二氧化硅纳米粒和30mg 胰岛素溶解于60mL 盐酸溶液中，12℃ 避光搅拌24h，得到介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒；
（4）将步骤（3）所得的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒40mg 溶解到40mL 二甲基亚砜中得溶液A，将8.0mg 苯硼酸与14mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶解到10mL二甲基亚砜中，搅拌30min得溶液B，将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌24h，得基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒。
实施例3
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
（1）制备介孔二氧化硅纳米粒：将摩尔浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液3.5mL 与450mL 蒸馏水混合，在80℃条件下搅拌加入1.1g 十六烷基三甲基溴化铵，再滴加5.2mL正硅酸四乙酯，搅拌2h，过滤，真空干燥，550℃煅烧4h ，得介孔二氧化硅纳米粒；
（2）介孔二氧化硅纳米粒的氨化：将500mg 介孔二氧化硅纳米粒分散于45mL 无水甲苯中，室温下搅拌，滴加1.2mL 3-氨丙基三甲氨基硅烷，搅拌30min ，加热升温至110℃，回流24h，抽滤，得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒；
（3）将50mg 氨基化介孔二氧化硅纳米粒和25mg 胰岛素溶解于45mL 盐酸溶液中，10℃ 避光搅拌24h，得到介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒；
（4）将步骤（3）所得的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒30mg 溶解到30mL 二甲基甲酰胺中得溶液A，将6.5mg 苯硼酸与12mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶解到7mL 二甲基甲酰胺中，搅拌30min得溶液B，将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌24h，得基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒。
实施例4
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
（1）制备介孔二氧化硅纳米粒：将摩尔浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液3.2mL 与470mL 蒸馏水混合，在80℃条件下搅拌加入1.1g 十六烷基三甲基溴化铵，再滴加5.5mL正硅酸四乙酯，搅拌2h，过滤，真空干燥，550℃煅烧4h ，得介孔二氧化硅纳米粒；
（2）介孔二氧化硅纳米粒的氨化：将450mg 介孔二氧化硅纳米粒分散于50mL 无水甲苯中，室温下搅拌，滴加1.5mL 3-氨丙基三甲氨基硅烷，搅拌30min ，加热升温至110℃，回流24h，抽滤，得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒；
（3）将50mg 氨基化介孔二氧化硅纳米粒和25mg 胰岛素溶解于50mL 盐酸溶液中，10℃ 避光搅拌24h，得到介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒；
（4）将步骤（3）所得的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒35mg 溶解到35mL 二氯甲烷中得溶液A，将7.0mg 苯硼酸与11mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶解到8mL 二氯甲烷中，搅拌30min得溶液B，将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌24h，得基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒。
本发明在介孔二氧化硅纳米粒表面修饰苯硼酸及含有邻二醇的多糖，利用苯硼酸的葡萄糖敏感性以及多糖的邻二醇基与葡萄糖竞争苯硼酸的结合位点，建立葡萄糖敏感的可逆的胰岛素释放系统，不仅克服可传统药物传递系统单向释放药物的弊端，而且该系统具有缓控释的特性，在体内能够长循环，减少给药次数，所用材料均具有良好的生物相容性，避免了一系列化学反应对机体的副作应。相关实验资料如下：
一、基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒扫谱分析：
对本发明基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒进行傅里叶红外图谱分析可知：当苯硼酸与介孔二氧化硅纳米粒偶联后，1645cm-1处出现了酰胺键的伸缩振动峰，在1325cm-1处出现了硼-氧键的峰，证明苯硼酸有效地连接到介孔二氧化硅纳米粒上。
二、基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒的表征：
1、基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒中胰岛素含量的测定
采用紫外分光光度计，于276nm波长处测定胰岛素的含量，以式（1）计算样品的载药量，载药量达到25%左右：
载药量（%）=载入的药物量/（载入的药物量+载体量）×100 式（1）
2、基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒粒径和电位的测定
取适量基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒分散于水中，用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为150~170nm和18.2±2.5mV。
三、基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒的药物释放实验
取1mL 已知药物含量的多糖/PBA-MSN/INS溶液置于透析袋里（MWCO=25000），分别浸入50mL 含不同浓度的葡萄糖溶液（0，3，5，10mg/mL）的pH7.4的PBS溶液中，在恒温摇床中震荡，固定恒温摇床温度37.0±0.5℃，转速为100r/min。于0，5，1，2，4，8，12，24，36，48h 取样，每次取样同时补充同体积的释药介质，采用HPLC法测定INS含量，计算累积释药量，计算累积释放百分率。对释药数据进行拟合，探讨其在不同葡萄糖浓度下的释药机制。数据结果表明，在36h 时，胰岛素在0，3，5，10mg/mL 的葡萄糖溶液中的累积释放率为10%，50%，65%，92%，表明该制剂有明显的葡萄糖浓度依懒性。
四、基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒的细胞增殖抑制实验
采用SRB法，选择对数生长期的HeLa细胞，调整细胞数为1×104/mL 接种于96孔培养板，每孔100μL （边缘孔用无菌PBS填充），细胞贴壁生长24h 后加入不同的样品溶液，分别为：空白组，多糖/PBA-MSN组，多糖/PBA-MSN/INS组。样品溶液与细胞培养24h 后加入，每孔加入50μL 4℃ 预冷的50％三氯乙酸（TCA）固定细胞，固定10min 后移入4℃ 冰箱固定1h，取出弃去固定液，用去离子水洗5遍，甩干，室温自然干燥。室温晾干后，每孔加入SRB染液50μL，室温避光放置15～30min 染色，弃染液，用1％的冰醋酸洗5遍，室温干燥。之后，用150μL 非缓冲Tris碱液（10mM，pH＝10.5）溶解与细胞蛋白结合的染料，摇床微振荡（37℃，100rpm，10min）于酶标仪515nm 波长处测每个小孔的OD值，计算细胞生长抑制率（％）＝（1-实验组OD值/对照组OD值）×100％，计算得到多糖/PBA-MSN组，多糖/PBA-MSN/INS组的细胞生长抑制率分别为3.8%，4.5%。结果表明，载体多糖/PBA-MSN及制剂多糖/PBA-MSN/INS在实验剂量下对细胞无明显毒性。
五、基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒的体内应答式行为评价
采用正常大鼠为动物模型，分别于设定时间点（如0，3，5，10，12，24，36，48h）静脉注射葡萄糖溶液（0.3g/kg），并于0时刻静脉注射INS溶液剂（0.5IU/kg）、多糖/PBA-MSN/INS（INS 0.5IU/kg）和PBA-MSN/INS（INS 0.5IU/kg），INS溶液组分别于0和1h 给药两次；于一定时间间隔采血，通过血糖仪测定血糖水平。将所得血糖值对时间进行拟合，评价制剂的自调节释放能力。结果表明，与INS溶液剂组和PBA-MSN/INS组对比，多糖/PBA-MSN/INS组能够更长时间的维持血液中较低的葡萄糖水平，说明该纳米粒在体内对葡萄糖浓度具有敏感性，能够有效的释放胰岛素。
通过以上实验表明：本发明具有以下突出的有益技术效果：
（1）本发明通过多糖与体内葡萄糖竞争性结合苯硼酸的结合位点，能够根据体内的葡萄糖浓度可逆的开启与关闭胰岛素的释放阀门，实现智能可控的药物释放系统，在体内能够长循环，减少给药次数，维持平稳的血糖水平，大大避免由于血糖波动引发的并发症。
（2）MSN粒径小，表面易修饰，使得该体系能够稳定持久的存在于生理环境中，巨大的比表面积（＞900m2/g）和比孔容（＞0.9cm3/g），可以在孔道内负载各种药物，并可对药物起到缓释作用，提高药效的持久性。
（3）本发明所用材料均具有良好的生物相容性，体系简单、安全，避免了一系列化学反应带来的问题，并且基于苯硼酸修饰的介孔二氧化硅/胰岛素纳米粒的制备方法简单，成本低廉，易于大规模制备，经济和社会效益巨大，是糖尿病治疗药物上的创新。