本发明涉及疫苗组合物，具体涉及以核酸水凝胶作为载体的疫苗组合物。
背景技术：
：：水凝胶是一种由亲水性大分子通过化学或物理方法交联形成的含水量极高的三维网络结构。水凝胶具有制备简单、设计灵活、生物相容性好以及来源广泛等优点，已经被广泛应用于细胞培养、药物递送、组织修复等生物医学领域。水凝胶具有很好的渗透性，因此可以作为免疫治疗药物的优良载体；水凝胶载药体系在体内具有很好的缓释效果，因此能使机体产生长时间的治疗效果。d.j.mooney等人设计了一种基于海藻酸钠的水凝胶体系(参加非专利文献1)。他们将rgd多肽序列共价连接到海藻酸钠侧链上，用于增强细胞与水凝胶的作用；将经辐射处理过的b16细胞以及免疫刺激剂cpg、gm-csf引入到水凝胶中。该体系在体外实验显示出很好的缓释效果以及免疫刺激效果，在小鼠模型实验显示出很好的抗肿瘤效果，能够有效地抑制肿瘤细胞生长，提升小鼠的存活率。但由于天然高分子形成的水凝胶在刺激响应性、触变性、自愈合性等方面还存在一定的不足，此外，这类水凝胶形成的时间较长，不易功能化，力学强度较低，产物难降解、异体的免疫原性以及作用机理不清楚限制了其在生物医学的进一步应用。非专利文献1：bencherifsa,warrensandsr,alioa,liwa,lewinsa,braschlertm,shihty,verbekecs,bhattad,dranoffg,andmooneydj.injectablecryogel-basedwhole-cellcancervaccines,nat.commun.,2015,6,7556-7568.技术实现要素：鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于核酸水凝胶的疫苗组合物。即，本发明如下。1.一种疫苗组合物，其包含：作为载体的水凝胶，以及分布于所述水凝胶中的抗原；其中，所述水凝胶包含：支架单元，该支架单元具备至少三个互补的粘性末端，交联单元，该交联单元具备至少两个互补的粘性末端，以及水性介质，所述支架单元和所述交联单元均由核酸以碱基互补配对的方式形成，所述支架单元与所述交联单元通过所述支架粘性末端与所述交联粘性末端以碱基互补配对的方式交联，从而形成三维空间网络结构；所述抗原分布在所述三维空间网络结构中。2.根据项1所述的疫苗组合物，其中，所述支架单元与所述交联单元在生理条件下(37℃，ph7.2～7.4,0.9wt％nacl，等渗)处于稳定交联状态。3.根据项1或2所述的疫苗组合物，其中，所述支架粘性末端或交联粘性末端的长度为4nt以上。4.根据项1～3中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述支架单元由三条单链核酸以碱基互补配对的方式形成，且每一条单链核酸具有一个所述支架粘性末端。5.根据项1～4中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述交联单元由两条单链核酸以碱基互补配对的方式形成，且每一条单链核酸具有一个所述交联粘性末端。6.根据项1～5中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述支架单元或所述交联单元包含cpg序列。7.根据项1～6中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述抗原是多肽。8.根据项7中所述的疫苗组合物，其中，所述多肽包含多聚赖氨酸序列。9.一种制备项1～8中任一项所述的疫苗组合物的方法，其包括：将所述交联单元的水性介质溶液与所述抗原的水性介质溶液混合，使所述交联单元与所述抗原通过静电作用结合，得到交联单元-抗原复合物的水性介质溶液的步骤；以及将所述交联单元-抗原复合物的水性介质溶液与所述支架单元的水性介质溶液混合，使所述支架单元与所述交联单元交联形成三维空间网络结构，得到所述疫苗组合物的步骤。10.下述水凝胶在制备项1～8中任一项所述的疫苗组合物中的用途，其中，所述水凝胶包含：支架单元，该支架单元具备至少三个互补的粘性末端，交联单元，该交联单元具备至少两个互补的粘性末端，以及水性介质，所述支架单元和所述交联单元均由核酸以碱基互补配对的方式形成，所述支架单元与所述交联单元通过所述支架粘性末端与所述交联粘性末端以碱基互补配对的方式交联，从而形成三维空间网络结构。11.用于制备项1～8中任一项所述的疫苗组合物的试剂盒，所述试剂盒包括：用于形成所述支架单元的核酸；用于形成所述交联单元的核酸；以及抗原。12.一种试剂盒在制备项1～8中任一项所述的疫苗组合物中的用途，其中，所述试剂盒用于制备水凝胶，所述水凝胶包括：支架单元，该支架单元具备至少三个互补的粘性末端，交联单元，该交联单元具备至少两个互补的粘性末端，以及水性介质；所述支架单元和所述交联单元均由核酸以碱基互补配对的方式形成，所述支架单元与所述交联单元通过所述支架粘性末端与所述交联粘性末端以碱基互补配对的方式交联，从而形成三维空间网络结构；所述试剂盒包括：用于形成所述支架单元的核酸；以及用于形成所述交联单元的核酸。发明的效果根据本发明，提供一种基于核酸水凝胶的疫苗组合物，其优势在于：1、利用dna自组装以及静电相互作用策略构筑了基于核酸水凝胶的自组装疫苗；2、该疫苗组合物具有良好的可注射性；3、抗原在水凝胶中的分布均匀；4、免疫细胞能够在该疫苗组合物中正常生长且分布均匀；5、该疫苗组合物能够招募免疫细胞进入核酸水凝胶中，且能够对免疫细胞产生有效的刺激；6、该疫苗组合物能够在动物体内产生高滴度的抗体，所产生的抗体能够有效结合肿瘤细胞并介导cdc作用杀伤肿瘤细胞；7、该疫苗组合物能够有效地抑制肿瘤细胞生长，提高荷瘤动物的存活率，具有明显的抗肿瘤效果。附图说明图1a.本发明实施例1的简要流程图；b化合物36的分子结构。图2显示raw264.7细胞在dna水凝胶自组装疫苗中的分布的图。图3显示raw264.7分泌细胞因子情况的图。图4疫苗的抗体滴度统计图。图5疫苗v18和v19的抗体亚型图。图6v18血清和v19血清中抗体结合mcf-7细胞的facs图。图7v18血清和v19血清中抗体介导杀伤mcf-7细胞图。图8dna水凝胶自组装疫苗的抗肿瘤效果图。a为肿瘤体积曲线，b为存活率曲线；箭头表示进行免疫，pbs用作空白对照。发明的具体实施方式本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。首先，在一个方面中，本发明提供一种疫苗组合物(本发明的疫苗组合物)，其包含：作为载体的水凝胶，以及分布于所述水凝胶中的抗原。其中，所述水凝胶包含：支架单元，该支架单元具备至少三个互补的粘性末端；交联单元，该交联单元具备至少两个互补的粘性末端；以及水性介质。所述支架单元和所述交联单元均由核酸以碱基互补配对的方式形成，所述支架单元与所述交联单元通过所述支架粘性末端与所述交联粘性末端以碱基互补配对的方式交联，从而形成三维空间网络结构。所述抗原分布在所述三维空间网络结构中。本说明书中，水凝胶也称核酸水凝胶，这样的水凝胶可以参照现有技术中已知的那些，例如参见y.xing,e.cheng,y.yang,p.chen,z.yang,d.liu.adv.mater.,2011,23,1117以及j.jin,y.xing,y.xi,x.liu,z.yang,s.wang,d.liu.adv.mater.,2013,257,4714，但现有技术的水凝胶并不包含cpg序列。所述水凝胶包括：支架单元，该支架单元具备至少三个互补的粘性末端；交联单元，该交联单元具备至少两个互补的粘性末端，以及水性介质；所述支架单元和所述交联单元均由核酸以碱基互补配对的方式形成，所述支架单元与所述交联单元通过所述支架粘性末端与所述交联粘性末端以碱基互补配对的方式交联，从而形成三维空间网络结构。在本说明书中，核酸是指由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸形成的聚合物，优选为脱氧核糖核酸(dna)。在本说明书中，水性介质是指水或水溶液。作为所述水溶液，优选包含缓冲盐的缓冲液。所述水溶液优选能够形成与干细胞的体内微环境相似的环境，例如生理条件(37℃，ph7.2～7.4,0.9wt％nacl,等渗)。所述支架单元可以例如由三条单链核酸形成，且每一条单链核酸具有一个所述支架粘性末端。这三条核酸之间两两通过碱基互补配对的方式结合，形成“y”字型结构，所述支架粘性末端分别处于“y”字的三个顶点。所述三条核酸之间两两形成有互补配对区，该互补配对区的长度可以是4～150bp、优选5～50bp、更优选6～30bp、更优选8～20bp。所述交联单元可以例如由两条单链核酸形成，这两条核酸之间通过碱基互补配对的方式结合，且各具有一个交联粘性末端。所述两条核酸之间形成有互补配对区，该互补配对区的长度可以是4～150bp、优选5～100bp、更优选8～80bp、更优选10～60bp、更优选15～50bp、更优选20～40bp。而且，在所述交联单元能够具有所述互补配对区和所述交联粘性末端的前提下，所述两条单链核酸中的任意一条可以被断开成两条以上的单链核酸。所述支架单元与所述交联单元通过所述支架粘性末端与所述交联粘性末端以碱基互补配对的方式交联，从而形成三维空间网络结构。优选地，所述支架单元、所述交联单元以及所述三维空间网络结构在生理条件下(37℃，ph7.2～7.4,0.9wt％nacl,等渗)处于稳定交联状态。优选地，所述支架粘性末端或交联粘性末端的长度为4nt以上，这样有利于其在生理条件下处于稳定交联状态。优选地，所述支架粘性末端或交联粘性末端的长度为150nt以下、优选50nt以下、更优选30nt以下、更优选20nt以下。优选地，所述水凝胶可以具有适宜的机械强度，例如其机械强度可以为0.1pa以上、优选1pa以上、更优选10pa以上，优选为10000pa以下，更优选为1000pa以下。优选地，本发明的疫苗组合物中，所述支架单元或所述交联单元包含cpg序列。cpg序列是以胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cpg)为核心的回文序列，5’端为2个嘌呤，3’端为2个嘧啶，即5’-purpur-cg-pyrpyr-3’。cpg序列可被哺乳动物细胞识别，从而触发一系列机体防御机制，包括补体激活、吞噬作用和致炎细胞因子基因的表达等。目前已知具有较强免疫刺激作用的cpg序列有例如5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’等。在非专利文献1的基于海藻酸钠的水凝胶体系中，cpg序列需要作为免疫刺激剂额外添加到水凝胶中。而在本发明的的疫苗组合物中，cpg序列能够设计在构成所述支架单元或所述交联单元的核酸序列中，从而获得更强的免疫刺激作用。在本说明书中，抗原是指可诱发免疫反应的物质，例如是多肽(这里多肽也包括蛋白质)或多糖。在所述抗原为多肽的情况下，该多肽的末端优选具有多聚赖氨酸结构，因为这样可以利用静电相互作用容易地将其引入水凝胶中。本发明的疫苗组合物中，为了提高所述抗原的免疫原性，还可以包含载体蛋白。载体蛋白一般是结合于因分子量小而不具有免疫原性的分子、赋予其免疫原性的物质，在本
技术领域：
：是公知的。作为载体蛋白的例子，可以列举出牛血清白蛋白(bsa)、兔血清白蛋白(rsa)、卵清白蛋白(ova)、钥孔戚血蓝蛋白(klh)、甲状腺球蛋白(tg)、免疫球蛋白等。此外，本发明的疫苗组合物还可以包含制药上可接受的、且活性成分相容性的佐剂。佐剂一般是非特异性增强宿主的免疫应答的物质，许多种类的佐剂是本
技术领域：
：公知的。作为佐剂的例子，可以列举如下，但不限于此:弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝、n-乙酰基-胞壁酰-l-苏氨酰-d-异谷氨酰胺(thr-mdp)、n-乙酰基-正胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺(nor-mdp)、n-乙酰基胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺酰-l-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(mtp-pe)、quilla(注册商标)、溶血卵磷脂、皂苷衍生物、pluronicpolyols、montanideisa-50(seppic，paris，france)、bayol(注册商标)以及markol(注册商标)。本发明的疫苗组合物可口服或非口服施用于哺乳动物，优选非口服施用。作为适于非口服施用(例如皮下注射、肌肉注射、局部注入、腹腔内施用等)的制剂，有水性和非水性的等渗无菌注射液剂，这其中还可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、等渗化剂等。此外，可以列举出水性以及非水性的无菌混悬液剂，其中还可以包含混悬剂、增溶剂、增粘剂、稳定化剂、防腐剂等。该制剂可以按单位施用量或者多次施用量封入容器，像安瓿、小药瓶那样。此外，也可以将有效成分以及医药可接受的载体冻干，以将要使用时溶解或混悬于适当的无菌媒介物即可的状态保存。疫苗组合物中的抗原的含量可以为疫苗组合物总体的约0.1～50重量％、优选约0.5～10重量％、更优选约1～10重量％左右。本发明的疫苗组合物的施用量因施用对象、施用方法、施用方式等而异，以抗原的量计，通常对于1个成人，在每一次1μg～1000μg的范围、优选20μg～100μg的范围，通常4周～12周施用2次～3次，在抗体效价降低时，每次追加施用1次。对本发明的疫苗组合物的制备方法没有特殊限制，例如可以分别制备所述支架单元、所述交联单元以及所述抗原的水性介质溶液，然后将三者混合，得到本发明的疫苗组合物；也可以先将所述支架单元的水性介质溶液与所述抗原的水性介质溶液混合，使其通过静电作用结合，得到支架单元-抗原复合物的水性介质溶液，然后再将所述支架单元-抗原复合物的水性介质溶液与所述交联单元的水性介质溶液混合，使所述支架单元与所述交联单元交联形成三维空间网络结构，得到本发明的疫苗组合物；还可以先将所述交联单元的水性介质溶液与所述抗原的水性介质溶液混合，使其通过静电作用结合，得到交联单元-抗原复合物的水性介质溶液，然后再将所述交联单元-抗原复合物的水性介质溶液与所述支架单元的水性介质溶液混合，使所述支架单元与所述交联单元交联形成三维空间网络结构，得到本发明的疫苗组合物。用于制备本发明的疫苗组合物的各个组合可以分别准备，但优选将其中的一些组分或全部组分预制成试剂盒，以方便本发明的疫苗组合物的制备。因此，在另一方面中，本发明提供用于制备本发明的疫苗组合物的试剂盒，所述试剂盒包括：用于形成所述支架单元的核酸；用于形成所述交联单元的核酸；以及所述抗原。在所述试剂盒中，所述用于形成所述支架单元的核酸与所述用于形成所述交联单元的核酸可以包装在同一容器中，也可以分别包装在不同的容器中。若所述支架单元或交联单元由多种核酸形成，在它们可以包装在同一容器中，也可以分别包装在不同的容器中。所述抗原优选包装在独立的容器中。所述水凝胶或用于制备所述水凝胶的试剂盒可以用于制备本发明的疫苗组合物。用于制备所述水凝胶的试剂盒可以包含用于形成所述支架单元的核酸、以及用于形成所述交联单元的核酸。实施例以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限制。实施例1dna水凝胶自组装疫苗的构筑1.1多肽的合成合成了n端延伸七个支链状赖氨酸的含辅助t细胞表位tt947-967的muc1糖肽(其中只有9位苏氨酸进行tn糖基化修饰，以下简称化合物36。参见cai,h.etal.variationoftheglycosylationpatterninmuc1glycopeptidebsavaccinesanditsinfluenceontheimmuneresponse.angew.chem.int.ed.51,1719-1723(2012)以及cai,h.etal.self-adjuvantingsyntheticantitumorvaccinesfrommuc1glycopeptidesconjugatedtot-cellepitopesfromtetanustoxoid.angew.chem.int.ed.52,6106-6110(2013))作为抗原，可利用静电相互作用将其引入dna水凝胶。1.2dna的合成实施例所用到的dna分子(y1、y2、y3、l1、l2(含cpg)以及l3)均由美国mermade12dna合成仪合成并经反相高效液相色谱纯化得到。1.3dna水凝胶自组装疫苗的构筑具体而言，对于疫苗v18，首先将y1、y2和y3等物质的量混合，加入200μlpbs制备成1.0mm溶液，95℃加热5min，退火至室温，4℃孵育2h，得到1.0mm的y型骨架。l1、l2(含cpg)和l3经过相同方法处理得到3.0mm的连接臂组装体100μl。将100μl连接臂组装体与100μl的0.7mm化合物36混合，4℃孵育过夜，然后将200μl的y型骨架加入其中，搅拌即可得到抗原浓度为175.0μm的dna水凝胶自组装疫苗v18。对于疫苗v19，用pbs溶解化合物36，将其制备成浓度为175.0μm的溶液，即可得到疫苗v19。对于疫苗v20，其制备方法与v18一致，用化合物37代替化合物36即可。表1.构建dna水凝胶所用的dna序列信息序列y1,y2,y3形成y-支架单元；序列l1，l2和l3形成交联单元；下划线表示dna序列的粘性末端，粗体表示ecori限制性内切酶识别序列；斜体表示通过免疫刺激单元cpg序列。本实施例的简要流程如图1a所示。化合物36的分子结构如图1b所示。实施例2荧光极化测定dna与糖肽结合力通过荧光极化实验测定了dna与muc1糖肽的结合力。首先合成了含有羧基荧光素(fam)的muc1糖肽(化合物37)，将其配制成pbs溶液，并加入96孔板中，然后将不同浓度的dna连接臂组装体溶液加入其中，在4℃的条件下孵育过夜，在酶标仪上测量荧光极化率p，激发光选用440nm，发射光选用485nm。平行光数值为i∥，垂直光数值为i⊥。p值计算公式见式(4-1)。通过grafit7.0软件拟合出解离常数kd值。实验结果显示，化合物37与dna连接臂组装体之间相互作用的解离常数(kd)为3.0μm，表明它们之间存在较强的结合力。实施例3流变仪测定dna水凝胶自组装疫苗的成胶性质将构筑的dna水凝胶自组装疫苗在arg2流变仪(美国ta公司)上进行流变学性质表征。实验结果表明，dna水凝胶自组装疫苗在低剪切力下为凝胶态，高剪切力下为流体态，说明其具有可注射性。实施例4共聚焦显微镜观测muc1糖肽在dna水凝胶中的分布首先利用化合物37构筑含荧光fam标记的dna水凝胶自组装疫苗v20，用dapi染料对其进行染色，在共聚焦显微镜lsm780(德国zeiss公司)上进行观测。实验结果显示，化合物37在疫苗v20中的分布非常均匀。实施例5荧光显微镜观测免疫细胞在dna水凝胶自组装疫苗中的分布为了研究细胞在dna水凝胶自组装疫苗中的分布情况，选用raw264.7细胞，将其与dna连接臂组装体以及化合物36混合孵育，再与y型骨架混合，搅拌后形成含有raw264.7细胞的dna水凝胶自组装疫苗。培养24h后，将其用钙黄绿素染色，在共聚焦显微镜下观察。实验结果显示(图2)，免疫细胞能够在dna水凝胶自组装疫苗中正常生长，并且呈现均一分布。实施例6dna水凝胶自组装疫苗对免疫细胞的招募为了研究dna水凝胶自组装疫苗对于免疫细胞的招募过程，先将raw264.7用活细胞染色剂cm-dil进行染色并加入到共聚焦培养皿的底部。然后将含fam标记的dna水凝胶自组装疫苗v20加到细胞培养液上部，在转盘共聚焦成像仪cv1000(英国andor公司)上观测细胞运动情况。实验结果显示，随着时间变化，水凝胶下面的细胞能够被招募到水凝胶中，并且能在水凝胶中运动。实施例7dna水凝胶自组装疫苗对免疫细胞刺激的研究为了研究dna水凝胶自组装疫苗v18对免疫细胞的刺激，按照实施例5所述的方法制备了含有raw264.7细胞的dna水凝胶自组装疫苗，培养36h后，用pbs稀释水凝胶，离心，测量上清液中细胞分泌的细胞因子的量。选取lps(脂多糖)作为阳性对照，选pbs作为空白对照，同时设计其它对照组：v19、不含cpg的dna水凝胶、含cpg的dna水凝胶以及cpg。实验结果显示(图3)，v18以及含cpg的dna水凝胶能够对raw264.7细胞产生很强的刺激，使其分泌较多的il-6和il-12。实施例8dna水凝胶自组装疫苗对小鼠的免疫为了研究所构筑疫苗的免疫学性质，我们将所得疫苗在小鼠体内进行免疫。将疫苗通过腹腔注射的方法免疫到6-8周的balb/c小鼠体内。每组4只小鼠，每只小鼠注射含12μgmuc1糖肽的疫苗，每隔两周进行一次免疫，共进行5次免疫。免疫结束后一周对小鼠进行取血，分离得到小鼠血清。实施例9muc1糖肽抗体滴度的测定通过elisa方法测定小鼠免疫后血清中muc1糖肽抗体的滴度。图4表示疫苗v18和v19抗体滴度统计图，我们发现，v18的抗体滴度相对于v19有较大提升，说明含cpg的dna水凝胶能够有效地提高抗原的免疫原性，增强疫苗的免疫效果。实施例10muc1糖肽抗体亚型分析通过分析v18和v19所产生的抗体亚型来研究小鼠体内发生的免疫反应。从实验结果看(图5)，v18所产生的igm的量相对减少，同时igg1和igg2a的量都较高，说明免疫v18的小鼠体内产生了较强的体液免疫反应和细胞免疫反应。实施例11疫苗血清中抗体与肿瘤细胞结合分析通过facs分析研究疫苗v18和v19血清中抗体对肿瘤细胞的结合情况。实验结果表明(图6)，疫苗v18血清中的抗体对于mcf-7细胞具有更强的结合能力。实施例12疫苗血清中抗体介导肿瘤细胞杀伤分析通过cdc作用来测定疫苗v18和v19血清中抗体对mcf-7细胞的杀伤。实验结果表明(图7)，疫苗v18血清中的抗体能够引起有效的cdc作用，从而杀伤mcf-7细胞。疫苗v19血清中抗体对肿瘤细胞杀伤效果不明显，原因可能是由于v19血清中的抗体对肿瘤细胞的结合能力不够强，不足以产生有效的cdc作用。实施例13小鼠肿瘤模型实验为了研究所构筑疫苗的抗肿瘤效果，我们构建了过表达人源muc1蛋白的小鼠黑素瘤(b16)细胞系，并将该细胞移植到c57bl/6小鼠体内。待肿瘤形成后，将疫苗通过皮下瘤旁注射的方法免疫到小鼠体内，每隔三天进行一次免疫，共进行3次免疫，对小鼠肿瘤体积进行测量，并观察小鼠存活情况。实验结果显示(图8)，dna水凝胶自组装疫苗v18具有最好的抗肿瘤效果，小鼠肿瘤体积最小，小鼠存活率最高。疫苗v19没有明显的抗肿瘤效果。此外，我们看到只含cpg的dna水凝胶也产生一定的抗肿瘤效果，原因可能是dna水凝胶中的cpg激活了进入水凝胶的apc细胞，从而活化了机体的免疫反应，产生一定的抗肿瘤效果。还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。以上通过具体实施方式和实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应该理解的是，这些并非意图对本发明的范围进行限定，本发明的范围应由权利要求书确定。工业实用性根据本发明，能够提供一种性能优异的基于核酸水凝胶的疫苗组合物。当前第1页12当前第1页12