一种具有提高动物免疫机能的药物制剂地黄粉的制作方法

本发明涉及到一种兽药制剂，具体为一种具有提高动物免疫机能的药物制剂地黄粉及其制备方法。

背景技术：

近年来，食品安全事件频发，从2006年的苏丹红鸭蛋到2008年的三聚氰胺奶粉，到2011年的瘦肉精，再到后来的速生鸡，药鸡门事件，这些食品安全问题的矛头直指畜牧养殖行业，国家对食品安全的重视也达到空前的高度，某些抗生素及抗病毒药物的使用在畜牧养殖行业被明令禁止。而另一方面，随着畜禽养殖业迅速发展，猪鸡的疫病流行也越来越复杂，传染性疾病呈现非典型性或变异性表现，免疫后的动物由于抗体水平参差不齐依然发病，一些新的疫病的大范围出现并流行。养殖企业为了生存必须寻求改变，逐渐向大型集约化生产集中，养殖安全深入人心，饲养管理理念也随之向生物安全控制和动物保健方向转型，同时绿色环保无残留的保健产品也逐渐走进了养殖企业的眼中。

说到绿色安全无污染保健品，不得不说的就是具有悠久历史的中兽医和中兽药。“治未病”作为传统中兽医学的一个重要理论思想由来已久，《黄帝内经》中“圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱；上工治未病，不治已病”即完整地体现了这一思想。中兽医学擅长调理，即通过提前药物干预，调整动物机体状态，进而达到预防疾病的目的。中兽医理论认为：中药保健产品的适当应用能够提高畜禽机体抵抗力，增强疫苗保护力，平行原本参差不齐的免疫滴度，从而使畜禽少发病，少用药，减少经济损失。

地黄是诸多中兽药中较为重要的一味药材，它是玄参科植物地黄的新鲜或干燥块根，秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，鲜用；或将地黄缓缓烘焙至约八成干。前者习称“鲜地黄”，后者习称“生地黄”。鲜地黄味甘、苦，性寒。归心、肝、肾经，具清热生津，凉血，止血之功效，主治热病伤阴，高热口渴，热性出血。生地黄味甘，性寒；归心、肝、肾经；具滋阴生津，清热凉血之功效，主治阴虚发热，鼻衄，尿血，咽喉肿痛。

地黄是一种常用中药，具有滋阴补血，填精生髓之功效，为临床补血之要药。始载于《神农本草经》，列为上品。《本草纲目》言其“填骨髓，益精血，长肌肉，补五脏内伤不足，通血脉，利耳目，黑须发，男子五劳七伤，女子伤中胞漏，经候不调，胎产百病。”现代药理研究表明，以地黄多糖为主要成分的中药材地黄可通过多种途径对机体的免疫系统起到调控作用，具有增强免疫功能、抗肿瘤、抗衰老等多种药理作用。然而，药用价值如此高的药材地黄在兽药中却很少被应用，即使是被用到，也是在散剂或者合剂中作为一味辅助药材出现，至今未见作为单方制剂应用的报道。

在中国兽药典中，中兽药制剂多以传统的散剂、合剂的形式记录在册，暂无粉剂的记载。而散剂一般为一种或几种中药材直接粉碎混合制成，合剂也一般只是经过水提或醇提制成的口服液剂。散剂是传统剂型，生产工艺简单，但因其本身的缺陷严重阻碍了其临床应用，对于不能充分消化纤维素的动物而言，散剂适口性差，生物利用度低，且在大规模集约化饲养条件下，产业动物特别是猪、鸡的给药途径受到多重限制；而传统的合剂存在稳定性差，运输不便等不足，也限制了其临床应用。

附图说明

图1-1地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后白细胞总数的影响；

图1-2地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后血清中溶菌酶含量的影响；

图1-3地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后血清中IFN-α含量的影响；

图1-4地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后血清中TNF-α含量的影响；

图1-5地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后对脾脏指数的影响；

图1-6地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后对法氏囊指数的影响；

图1-7地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后对抗体效价的影响；

图1-8地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后ANAE阳性率的影响；

图2-1地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后白细胞总数的影响；

图2-2地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后血清溶菌酶含量的影响；

图2-3地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后血清中IFN-α含量的影响；

图2-4地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后血清中TNF-α含量的影响；

图2-5地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后脾脏指数的影响；

图2-6地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后法氏囊指数的影响；

图2-7地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后抗体效价的影响；

图2-8地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后ANAE阳性率的影响。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有提高动物免疫机能的药物制剂地黄粉，其将中药材地黄经过水提取浓缩成密度适当的清膏后经喷雾干燥制成的粉剂，生产工艺先进，水提工艺最大限度的保留了其水溶性有效成分，而后经过喷雾干燥制成粉剂，便于保存，运输及临床应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种具有提高动物免疫机能的药物制剂地黄粉，取生地黄药材，加8-12倍重量的水，浸泡1-2h，然后75～85℃真空煎煮1-2h，然后常压55-105℃回流提取1-4h，然后减压浓缩至料液比为1:1～2的清膏，最后在进风温度为140～150℃，出风温度为80～90℃的条件中进行喷雾干燥，得本发明的地黄粉。

进一步的，所述真空煎煮过程中的真空度为-0.02～-0.04MPa。

进一步的，所述真空煎煮时间为1.5h，温度为80℃。

进一步的，所述回流提取温度为75～85℃。

进一步的，所述减压浓缩过程的压力为-0.02～-0.04MPa。

进一步的，所述回流提取的温度为80℃，时间为3h。

进一步的，减压浓缩至所述料液比为1:1.5的清膏。

进一步的，所述料液在60℃的相对密度为1.10～1.15。

进一步的，减压浓缩至料液比为1:1的清膏，所述料液在60℃的相对密度为1.15～1.20。

进一步的，减压浓缩至料液比为1:2的清膏，所述料液在60℃的相对密度为1.05～1.10。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

粉剂应用更加灵活方便，可用于饮水，避免了拌料过程，更加适用于大型规模化养殖场，另一方面，地黄粉经过水提喷雾干燥工艺提取了其有效成分，去除了原药材中的纤维素成分，动物服用后易于吸收，生物利用度明显优于散剂，而且粉剂性质更加稳定，不会产生酸败胀气等现象，更便于保存，运输及临床应用。

具体实施方式

地黄作为常用的补益类中药，疗效确切，应用也比较广泛，但是一般都在复方制剂作为辅助药材，作为单方制剂应用的至今未见报道。而本发明第一次应用生地黄药材制成单方制剂，质量稳定，且可控性优于以往的复方制剂，同时最大程度的发挥了地黄的药理作用。

在制备工艺方面，应用了水提工艺，最大程度的保留了生地黄中的水溶性有效成分，而后用喷雾干燥工艺制得了地黄粉。中药粉剂的剂型在现行的中兽药标准中并不多见，粉剂在兽药临床应用上明显优于传统剂型：相对散剂而言，粉剂应用更加灵活方便，可用于饮水，避免了拌料过程，更加适用于大型规模化养殖场，另一方面，地黄粉经过水提喷雾干燥工艺提取了其有效成分，去除了原药材中的纤维素成分，动物服用后易于吸收，生物利用度明显优于散剂。相对于口服液而言，粉剂性质更加稳定，不会产生酸败胀气等现象，更便于保存，运输及临床应用。

目前市场上，具有免疫增强作用的中药提取物产品鱼龙混杂，质量参差不齐，绝大多数都是作为三无产品来销售，产品质量难以得到保证。目前具有正规批号生产的仅有北京生泰尔的黄芪多糖粉、无锡正大的参芪粉以及齐鲁动保的紫锥菊制剂。但是上述几种产品也有其局限性，黄芪多糖粉是通过水提醇沉工艺得到的比较精制的黄芪多糖组分，而经过临床试验证实具有提高免疫作用的水溶性成份大部分被除去，无端的浪费，同时也增加了成本，另外大量试验证明，中药发挥较高疗效的作用很可能不是单一成分，而是多组分的一类或几类化合物的共同作用。参芪粉虽然考虑到了水溶成份的作用，保留了水溶成份，但是原料价格尤其是党参却过于昂贵并不适用于大规模畜禽用药，目前由于中药价格的持续增长，生产厂家要保证产品质量，就必须选用好饮片生产提取，势必造成产品价格高昂，这会给使用方增加成本负担，在价格上会失去竞争优势；紫锥菊制剂目前仅有紫锥菊末和紫锥菊口服液两种剂型，紫锥菊末属于散剂，既有体积大，使用贮存不方便的缺点，又有不易吸收适口性差等缺点，其使用无疑会受到限制。

实施例1

一种具有提高动物免疫机能的药物制剂地黄粉，其制备方法如下：

取生地黄药材1kg，加10kg的水，浸泡1.5h，然后在80℃真空(-0.02～-0.04MPa)条件下，煎煮1.5h，然后常压80℃回流提取3h，然后减压(-0.02～-0.04MPa)浓缩至料液比为1:1.5的清膏(该料液在60℃的相对密度为1.12)，最后在进风温度为145℃，出风温度为85℃的条件中进行喷雾干燥，得本发明的地黄粉。

其中每3.5h喷雾干燥150L清膏。大约每小时喷雾干燥43L清膏。

实施例2

一种具有提高动物免疫机能的药物制剂地黄粉，其制备方法如下：

取生地黄药材1kg，加8kg的水，浸泡1h，然后在80℃真空(-0.02～-0.04MPa)条件下，煎煮2h，然后常压80℃回流提取2h，然后减压(-0.02～-0.04MPa)浓缩至料液比为1:1的清膏(该料液在60℃的相对密度为1.15)，最后在进风温度为145℃，出风温度为85℃的条件中进行喷雾干燥，得本发明的地黄粉。

其中每3.5h喷雾干燥150L清膏。大约每小时喷雾干燥43L清膏。

实施例3

一种具有提高动物免疫机能的药物制剂地黄粉，其制备方法如下：

取生地黄药材1kg，加12kg的水，浸泡2h，然后在80℃真空(-0.02～-0.04MPa)条件下，煎煮2h，然后常压80℃回流提取4h，然后减压(-0.02～-0.04MPa)浓缩至料液比为1:2的清膏(该料液在60℃的相对密度为1.09)，最后在进风温度为145℃，出风温度为85℃的条件中进行喷雾干燥，得本发明的地黄粉。

其中每3.5h喷雾干燥150L清膏。大约每小时喷雾干燥43L清膏。

地黄粉试制完成后，我们取质量稳定的中试试验产品进行了以鸡为靶动物的临床试验来验证其临床疗效是否确切。临床试验分两部分分别考察了地黄粉与新城疫疫苗或禽流感疫苗同时使用的增免效果。

1.地黄粉对鸡ND疫苗免疫效果的影响，评价其有效性和安全性的临床研究

1.1试验动物、分组与处理

900只1日龄海兰灰蛋鸡雏，公母雏各半，购于河北华裕家禽育种有限公司，随机选取30只1日龄雏鸡，采血制备血清，用于母源抗体测定。饲养至7日龄，淘汰弱雏后随机分6组，每组135只。

(1)“地黄粉”试验组设Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个剂量组，分别用低、中、高剂量的“地黄粉”混饮(每1L水，0.5g、1g、1.5g)，每日1次，于7日龄首次免疫新城疫活疫苗(La Sota株)后饮水饲喂，连续饲喂7天。

(2)药物对照组即Ⅳ组，为黄芪多糖粉组，以临床推荐剂量使用(每1L水，200mg)，于7日龄首次免疫新城疫活疫苗(La Sota株)后饮水饲喂，连续饲喂7天。

(3)阴性对照组即Ⅴ组，鸡只免疫后不添加任何药物。

(4)空白对照组即Ⅵ组，该组鸡既不免疫也不添加任何药物。

以上各组鸡，于7日龄分别滴鼻、点眼接种鸡新城疫活疫苗(La Sota株)，1羽份/只，颈部皮下注射新城疫灭活疫苗(La Sota株)，0.2ml/只；28日龄滴鼻、点眼接种鸡新城疫活疫苗((La Sota株)，1羽份/只。

1.2试验方法

各组鸡只分别于7日龄、14日龄、21日龄、28日龄、35日龄、42日龄、49日龄和56日龄时随机选取15只采血(采血后淘汰)，将血液分为2份，1份加抗凝剂，备用；1份制备血清，备用。

1.2.1白细胞计数：采用直接染色法进行鸡白细胞计数。

1.2.2血清中酶活力的测定：严格按照溶菌酶(LZM)试剂盒说明书操作，测定鸡血清中的酶活力。

1.2.3血清中IFN-α和TNF-α含量的测定：严格按照鸡干扰素-α(IFN-Α)酶联免疫检测试剂盒及鸡肿瘤坏死因子-α(TNF-Α)酶联免疫检测试剂盒使用说明书中方法进行操作，测定鸡血清中IFN-α和TNF-α的含量。

1.2.4脾脏指数和法氏囊指数的测定：将采血后淘汰的鸡只剖杀，取脾和法氏囊，剥离多余组织用滤纸吸水后称重，按公式计算脾指数和法氏囊指数：

脾指数(mg/g)＝脾重(mg)/体重(g)

法氏囊指数(mg/g)＝法氏囊重(mg)/体重(g)

1.2.5血清新城疫抗体的测定：用HI试验测定各组各日龄鸡只血清新城疫抗体效价，采用微量板法。

1.2.6外周血液酸性-醋酸萘酯酶阳性淋巴细胞值的测定：按照鸡外周血淋巴细胞分离液KIT说明书操作，计算出ANAE染色阳性率的比值。

1.3数据分析

数据统计分析采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析和多重比较。

1.4试验结果

1.4.1地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后白细胞总数的影响

各组鸡免疫新城疫疫苗后的白细胞总数结果变化如表1-1和图1-1所示，7日龄时，各组鸡的白细胞总数均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组及阳性对照黄芪多糖粉组较对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)均可不同程度的提高机体白细胞总数。对整个试验结果统计分析表明，地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的效果最好，在免疫后的各个检测日龄，白细胞总数显著高于对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)(P<0.05)，并且高于地黄粉的低剂量组，表明中、高剂量地黄粉与新城疫疫苗配合使用，能够更好地增强机体的非特异性免疫机能，进一步显著提高机体的抵抗力。

1.4..2地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后血清中酶活力的影响

结果如表1-2和图1-2所示，7日龄时，各组鸡的血清中溶菌酶含量均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)均能不同程度提高血清中溶菌酶含量，除56日龄地黄粉低剂量组外，四个给药组与两个对照组相比均呈显著性差异(P＜0.05)。统计分析表明，从整个试验结果来看地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的效果最好，这表明中、高剂量地黄粉与ND疫苗配合使用，能够更好地增强机体的非特异性免疫机能，进一步显著提高机体的抵抗力。

表1-1地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后白细胞总数(×10⁹/L)的影响(X±SD)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

表1-2地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后血清中溶菌酶含量的影响(μg/ml)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

1.4.3地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后血清中IFN-α含量的影响

由表1-3和图1-3可以看出，7日龄时，各组鸡的血清中IFN-α含量均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组的血清IFN-α含量较对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)均高，且均呈显著性差异(P＜0.05)；其中，14日龄时，地黄粉高剂量组和黄芪多糖粉组的血清中IFN-α含量最高；21日龄、28日龄、35日龄、42日龄、49日龄和56日龄时，地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的血清中IFN-α含量最高；从整个试验结果来看地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的效果最好，这表明地黄粉与新城疫疫苗配合使用，能够增强机体的的非特异性免疫机能。

表1-3地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后血清中IFN-α含量的影响(ng/L)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

1.4.4地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后血清中TNF-α含量的影响

地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后血清中TNF-α含量的影响结果如表1-4和图1-4所示。7日龄，各组鸡的血清中TNF-α含量均无显著性差异(P>0.05)。给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和阳性对照黄芪多糖粉组较对照组和空白对照组均能不同程度提高血清TNF-α含量；14日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组的血清TNF-α含量均高于对照组和空白对照组，其中四个用药组与空白对照组差异显著(P＜0.05)；21日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组的血清TNF-α含量均高于对照组和空白对照组，其中四个用药组与空白对照组差异显著(P＜0.05)，地黄粉高、中两个剂量组和黄芪多糖粉组与对照组差异显著(P＜0.05)；28日龄、35日龄、42日龄、49日龄和56日龄时，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组的血清TNF-α含量与对照组和空白对照组相比差异显著(P＜0.05)；这表明地黄粉与新城疫疫苗配合使用，能够增强机体的的非特异性免疫机能。

表1-4地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后血清中TNF-α含量的影响(ng/L)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

1.4.5地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后脾脏指数的影响

各组试验动物免疫新城疫疫苗并按计划给药后，分别于各个监测日龄测定了其脾脏指数，结果如表1-5和图1-5所示，7日龄时，各组鸡的脾脏指数均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组和空白对照组均能不同程度的提高机体脾脏指数，其中，地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的效果都比较好，在免疫后的各个检测日龄，脾脏指数显著高于对照组和空白对照组(P<0.05)，49日龄的脾指数的检测结果更表明地黄粉高剂量组显著高于其他各组，这表明中、高剂量地黄粉与ND疫苗配合使用，能够更好地促进鸡的脾脏发育，提高机体脾脏指数，从而进一步显著提高机体的抵抗力。

表1-5地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后对脾脏指数的影响(X±SD)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

1.4.6地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后法氏囊指数的影响

各组试验动物免疫新城疫疫苗并按计划给药后，分别于7日龄，14日龄，21日龄，28日龄，35日龄，42日龄，49日龄及56日龄测定了其法氏囊指数，各组法氏囊指数结果如表1-6和图1-6所示，7日龄时，各组鸡的法氏囊指数均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组和空白对照组均能不同程度的提高机体法氏囊指数。其中，地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的效果最好，在免疫后的各个检测日龄，法氏囊指数显著高于对照组和空白对照组(P<0.05)，这表明中、高剂量地黄粉与ND疫苗配合使用，能够更好地促进鸡的法氏囊发育，提高机体法氏囊指数，从而进一步显著提高机体的抵抗力。

表1-6地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后对法氏囊指数的影响(X±SD)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

1.4.7鸡新城疫抗体效价测定结果

各组各日龄动物的新城疫抗体结果如表1-7和图1-7所示，7日龄时雏鸡的新城疫母源抗体水平已转为阴性，说明此时进行免疫较为合理。14日龄时，地黄粉低剂量组、对照组和空白对照组的新城疫抗体滴度较7日龄相比，均有不同程度降低；但地黄粉中剂量组和黄芪多糖粉组的新城疫抗体水平略有提高。21日龄、28日龄、35日龄、42日龄、49日龄和56日龄时，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组和空白对照组均能不同程度的提高新城疫抗体水平；其中，地黄粉中剂量组和黄芪多糖粉组的效果最好且二者之间并无显著差异，新城疫抗体水平不仅显著高于对照组和空白对照组(P<0.05)，也高于地黄粉的高剂量组和低剂量组，这表明中剂量地黄粉与新城疫疫苗配合使用，能够更好地增强机体的体液免疫机能，进一步显著提高机体的抵抗力。

表1-7地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后对抗体效价(log2)的影响(X±SD)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

1.4.8地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后ANAE阳性率的影响

试验结果如表1-8和图1-8所示：7日龄时，6个试验组的外周血液酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)阳性淋巴细胞值均无显著性差异(P>0.05)；之后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组和空白对照组ANAE阳性率均有不同程度的提高；统计分析结果表明，地黄粉中、高剂量组与阳性对照黄芪多糖粉组的效果相当，在免疫后的各个检测日龄，ANAE阳性率不仅显著高于对照组和空白对照组(P<0.05)，亦高于地黄粉的低剂量组，这表明中、高剂量地黄粉与新城疫疫苗配合使用，能够更好地提高外周血液酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)阳性淋巴细胞值，从而进一步显著提高机体的抵抗力。

表1-8地黄粉对鸡免疫新城疫疫苗后ANAE阳性率(％)的影响(X±SD)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

2.地黄粉药对H9禽流感疫苗免疫效果的影响，评价其有效性和安全性的临床研究

2.1试验动物、分组与处理

900只1日龄海兰灰蛋鸡雏，公母雏各半，购于河北华裕家禽育种有限公司，随机选取30只1日龄雏鸡，采血制备血清，用于母源抗体测定。饲养至14日龄，淘汰弱雏后随机分6组，每组135只。

(1)“地黄粉”试验组设A、B、C三个剂量组，分别用低、中、高剂量的“地黄粉”混饮(每1L水，0.5g、1g、1.5g)，每天1次，于14日龄免疫禽流感灭活疫苗后饮水饲喂，连续饲喂7天。

(2)药物对照组即D组，为黄芪多糖粉组，以临床推荐剂量使用(每1L水，200mg)，于14日龄免疫禽流感灭活疫苗后饮水饲喂，连续饲喂7天。

(3)阴性对照组即E组，鸡只免疫后不添加任何药物。以上各组鸡，于14日龄分别颈部皮下注射禽流感灭活疫苗(H9亚型)，0.3ml/只。

(4)空白对照组即F组，该组鸡既不免疫也不添加任何药物。

所有试验鸡只饲喂无任何抗生素的全价日粮，自由采食和饮水。

2.2试验方法

各组鸡只分别于14日龄、21日龄、28日龄、35日龄、42日龄、49日龄和56日龄时随机选取15只采血(采血后淘汰)，将血液分为2份，1份加抗凝剂，备用；1份制备血清，备用。

2.2.1白细胞计数：采用直接染色法进行鸡白细胞计数。

2.2.2血清中酶活力的测定：严格按照溶菌酶(LZM)试剂盒说明书操作，测定鸡血清中的酶活力。

2.2.3血清中IFN-α和TNF-α含量的测定：严格按照鸡干扰素-α(IFN-Α)酶联免疫检测试剂盒及鸡肿瘤坏死因子-α(TNF-Α)酶联免疫检测试剂盒使用说明书中方法进行操作，测定鸡血清中IFN-α和TNF-α的含量。

2.2.4脾脏指数和法氏囊指数的测定：将采血后淘汰的鸡只剖杀，取脾和法氏囊，剥离多余组织用滤纸吸水后称重，按公式计算脾指数和法氏囊指数：

脾指数(mg/g)＝脾重(mg)/体重(g)

法氏囊指数(mg/g)＝法氏囊重(mg)/体重(g)

2.2.5血清新城疫抗体的测定：用HI试验测定各组各日龄鸡只血清禽流感H9亚型抗体效价，采用微量板法。

2.2.6外周血液酸性-醋酸萘酯酶阳性淋巴细胞值的测定：按照鸡外周血淋巴细胞分离液KIT说明书操作，计算出ANAE染色阳性率的比值。

2.3数据分析

数据统计分析采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析和多重比较。

2.4试验结果与分析

2.4.1地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后白细胞总数的影响

试验对各组别各日龄试验动物免疫禽流感H9疫苗后的白细胞总数进行了统计分析，结果如表2-1和图2-1所示，14日龄时，各组鸡的白细胞总数均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组和空白对照组均能不同程度的提高机体白细胞总数。统计分析表明，地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的效果相当，在用药后的各个检测日龄，白细胞总数显著高于对照组(E组)和空白对照组(F组)(P<0.05)，且高于地黄粉的低剂量组，这表明中、高剂量地黄粉与禽流感H9亚型疫苗配合使用，能够更好地增强机体的的非特异性免疫机能。

表2-1地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后白细胞总数的影响(×10⁹个/L)(X±SD)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

2.4.2地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后血清溶菌酶活性的影响

结果见表2-2和图2-2，在14日龄时，各组鸡的血清溶菌酶含量均无显著性差异(P>0.05)。给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组(Ⅴ组)和空白对照组(Ⅵ组)均能不同程度的提高机体的血清溶菌酶含量。对整个试验结果的统计分析表明，地黄粉中剂量组和黄芪多糖粉组的效果最好，在用药后的各个检测日龄，血清溶菌酶含量显著高于对照组(E组)和空白对照组(F组)(P<0.05)，亦高于地黄粉的高剂量组和低剂量组(P<0.05)，这表明中剂量地黄粉与禽流感H9亚型疫苗配合使用，能够更好地增强机体的的非特异性免疫机能。

表2-2地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后血清溶菌酶含量的影响(ug/ml)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

2.4.3地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后血清中IFN-α含量的影响

从表2-3和图2-3可以看出，在14日龄时，各组鸡的血清中IFN-α含量均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组(E组)和空白对照组(F组)均能不同程度的提高机体血清IFN-α浓度。统计分析表明，从整个试验结果来看地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的效果最好，在给药后的各个检测日龄，血清IFN-α浓度显著高于对照组(E组)和空白对照组(F组)(P<0.05)，且效果好于地黄粉的低剂量组(P<0.05)，这表明地黄粉与禽流感H9亚型疫苗配合使用，能够增强机体的的非特异性免疫机能。

表2-3地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后血清中IFN-α含量的影响(ng/L)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

2.4.4地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后血清中TNF-α含量的影响

地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后血清中TNF-α含量的影响实验结果见表2-4和图2-4，在14日龄时，各组鸡的血清中TNF-α含量均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组和空白对照组均能不同程度的提高机体血清TNF-α浓度。统计分析表明，地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的效果最好，在给药后的各个检测日龄，血清TNF-α浓度显著高于对照组和空白对照组(P<0.05)，且还高于地黄粉的低剂量组并呈显著性差异，这表明地黄粉与禽流感H9亚型疫苗配合使用，能够增强机体的的非特异性免疫机能。

表2-4地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后血清中TNF-α含量的影响(ng/L)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

2.4.5地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后脾脏指数的影响

各组试验动物免疫禽流感H9疫苗并按计划给药后，分别于14日龄，21日龄，28日龄，35日龄，42日龄，49日龄及56日龄测定了其脾脏指数，结果如表2-5和图2-5所示，在14日龄时，各组鸡的脾脏指数均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组和空白对照组均能不同程度的提高脾脏指数。其中，地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的效果为最优，在免疫后的各个检测日龄，脾脏指数不仅显著高于对照组和空白对照组(P<0.05)，也优于地黄粉的低剂量组，这表明中、高剂量地黄粉与禽流感H9亚型疫苗配合使用，能够更好地促进鸡的脾脏发育，提高机体脾脏指数，从而进一步显著提高机体的抵抗力。

表2-5地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后脾脏指数的影响(X±SD)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

2.4.6地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后法氏囊指数的影响

各组试验动物免疫禽流感H9疫苗并按计划给药后，分别于14日龄，21日龄，28日龄，35日龄，42日龄，49日龄及56日龄测定了其法氏囊指数，结果见表2-6和图2-6，在14日龄时，各组鸡的法氏囊指数均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组和空白对照组均能不同程度的提高法氏囊指数，其中地黄粉中剂量组和黄芪多糖粉组的效果最好，在免疫后的各个检测日龄，法氏囊指数不仅显著高于对照组和空白对照组(P<0.05)，还高于地黄粉的高剂量组和低剂量组，这表明中剂量地黄粉与禽流感H9亚型疫苗配合使用，能够更好地促进鸡的法氏囊发育，提高机体法氏囊指数，从而进一步显著提高机体的抵抗力。

表2-6地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后法氏囊指数的影响(X±SD)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

2.4.7鸡禽流感H9亚型抗体效价测定结果

试验中对各组别各日龄的鸡进行了禽流感H9抗体效价的测定，结果如表2-7和图2-7所示，14日龄时雏鸡的H9亚型禽流感母源抗体水平在4.87log2～5.13log2之间，说明此时进行免疫较为合理。21日龄、28日龄时，各试验组的H9亚型禽流感抗体较14日龄相比，均呈下降趋势。21日龄、28日龄、35日龄、42日龄、49日龄、56日龄时，空白对照组的H9亚型禽流感抗体一直处于阴性范围内。统计分析结果表明，35日龄、42日龄、49日龄、56日龄时，地黄粉低剂量组、地黄粉中剂量组和黄芪多糖粉组较对照组均能不同程度的提高H9亚型禽流感抗体水平，且呈显著性差异(P＜0.05)。35日龄、42日龄、49日龄、56日龄时，地黄粉高剂量组较对照组均能不同程度的提高H9亚型禽流感抗体水平，其中在35日龄、42日龄和49日龄时呈显著性差异(P＜0.05)；这表明中剂量地黄粉与禽流感H9亚型疫苗配合使用，能够更好地增强机体的体液免疫机能，进一步显著提高机体的抵抗力。

表2-7地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后抗体效价(log2)的影响(X±SD)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

2.4.8地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后ANAE阳性率的影响

试验结果见表2-8和图2-8，在14日龄时，6个试验组的外周血液酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)阳性淋巴细胞值均无显著性差异(P>0.05)；给药后的各个检测日龄，地黄粉高、中、低三个剂量组和黄芪多糖粉组较对照组和空白对照组均能不同程度的提高外周血液酸性-醋酸萘酯酶(ANAE)阳性淋巴细胞值；统计分析结果表明，地黄粉中、高剂量组和黄芪多糖粉组的效果最好，在免疫后的各个检测日龄，ANAE不仅显著高于对照组和空白对照组(P<0.05)，还高于地黄粉的低剂量组；这表明中剂量地黄粉与禽流感H9型疫苗配合使用，能够更好地提高外周血液酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)阳性淋巴细胞值，从而进一步显著提高机体的抵抗力。

表2-8地黄粉对鸡免疫禽流感H9亚型疫苗后ANAE阳性率(％)的影响(X±SD)

注：同一列标记不同小写字母的代表差异显著(P<0.05)，标记相同字母的或未标记字母的代表差异不显著(P>0.05)。下表同。

3.结论

综合以上试验结果表明，新兽药地黄粉对靶动物鸡有确切的免疫增强作用，与鸡的新城疫疫苗及禽流感H9疫苗共同使用可提高其抗体滴度。不同剂量的地黄粉均可提高鸡的特异性及非特异性免疫功能，且以中剂量效果最为显著。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。