本发明涉及疫苗
技术领域：
，同时涉及基因工程技术，具体涉及一种重组鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎三联灭活疫苗的制备方法。
背景技术：
：禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus，AIV)属于正黏病毒科中的A型流感病毒属，基因组由8个单股负链的RNA片段组成，片段1～8由大到小依次命名为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因，根据其表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同划分亚型，迄今已发现16种HA和9种NA亚型，该病毒感染禽类从轻度上呼吸道疾病、产蛋量降低，直至急性全身致死性疾病，对公共卫生也造成了威胁。IBV属冠状病毒科冠状病毒属，基因组全长大小约为27.4kb～27.7kb，为不分节段的单股正链RNA。编码4种结构蛋白；其中，纤突蛋白(S)位于病毒粒子表层囊膜上，是构成IBV表面纤突的主要成分，能够诱导机体产生保护性抗体及血凝抑制抗体，并能够与细胞受体结合并引起病毒和细胞膜的融合。新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)为副粘病毒科、腮腺炎病毒属、禽副粘病毒1型病毒，为单股负链不分节段的RNA病毒，基因组长约15kb，其结构为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′。NDV的反向遗传操作系统是Peeters等在1999年建立的，该技术是通过在体外构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒。该操作系统的核心是构建基因组全长感染性cDNA克隆，可通过中间过程人为加入DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工改造，如基因突变、基因插入、基因敲除、基因置换等，为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路。现有技术中AIV、IBV、NDV三联疫苗多为三种抗原的混合苗，需要分别制备三种抗原，这一方面加大了制备难度，同时，由于三种抗原均属于全病毒抗原，因此免疫效果容易相互影响。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种重组鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎三联灭活疫苗的制备方法，以解决现有技术中缺乏一种上述疫苗的技术问题。本发明要解决的另一技术问题是现有技术中上述三联疫苗的制备过程中需要分别制备三种抗原。本发明要解决的再一技术问题是现有技术中上述三联疫苗的滴度较低。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种重组鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入至新城疫病毒基因组的F-HN之间，得到重组新城疫病毒rLaSota/S1，而后将禽流感病毒HA基因插入至重组新城疫病毒rLaSota/S1基因组的P-M之间，即得到重组新城疫病毒rLaSota/S1-HA；利用所述重组新城疫病毒rLaSota/S1-HA表达抗原，而后制备疫苗。作为优选，所述rLaSota/S1是通过以下方法制备的：1)将新城疫病毒的NP、P、L三个基因通过RT-PCR进行扩增，而后将三者分别克隆到表达质粒载体pTM1，分别得到重组质粒pTM-NP、pTM-P、pTM-L；2)通过特异性引物使TOPOTACloning载体线性化，利用IBV-M41株为模板，通过特异性引物扩增S1基因，得到rLaSota/S1重组亚克隆；而后将rLaSota/S1亚克隆线性化后连接到LaSota全长cDNA质粒中，将其转化到Stbl2感受态细胞，30℃培养24小时再通过DNA核苷酸序列分析鉴定筛选出阳性克隆，再将阳性克隆株纯化，即得到重组质粒pLaSota/S1；3)在细胞板上以每孔106个的加入量铺入HEp-2细胞，预先用MVA/T7A感染；通过转染试剂，将pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1质粒共转染到HEp-2细胞上，转染后6小时后去掉转染培养基，并加入新鲜的5％FBS的DMEM培养基；72小时，通过将转染细胞反复冻融3次收获重组病毒rLaSota/S1。作为优选，所述rLaSota/S1-HA是通过以下方法制备的：A)将新城疫病毒的NP、P、L三个基因通过RT-PCR进行扩增，而后将三者分别克隆到表达质粒载体pTM1，分别得到重组质粒pTM-NP、pTM-P、pTM-L；B)通过特异性引物使TOPOTACloning载体线性化，利用禽流感病毒为模板，通过特异性引物扩增S1基因，得到rLaSota/HA重组亚克隆；而后将rLaSota/HA重组亚克隆线性化后连接到rLaSota/S1的全长cDNA质粒中，将其转化到Stbl2感受态细胞，30℃培养24小时再通过DNA核苷酸序列分析鉴定筛选出阳性克隆，再将阳性克隆株纯化，命名为pLaSota/S1-HA，即得到重组质粒pLaSota/S1-HA；C)在细胞板上以每孔106个的加入量铺入HEp-2细胞，预先用MVA/T7A感染；通过转染试剂，将pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1-HA质粒共转染到HEp-2细胞上，转染后6小时后去掉转染培养基，并加入新鲜的5％FBS的DMEM培养基；72小时，通过将转染细胞反复冻融3次收获重组病毒rLaSota/S1-HA。作为优选，所述表达抗原包括以下步骤：将重组新城疫病毒rLaSota/S1-HA株以1:8000倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置相对湿度60～65％，温度33～35℃条件下孵育，收集120～144h死亡胚的尿囊液，即得到抗原溶液。作为优选，所述抗原溶液中EID50≥108.7/0.1ml。作为优选，所述制备疫苗包括以下步骤：抗原溶液灭活后作为水相，与疫苗油相以1:3的比例混合，乳化，即得到所述重组鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎三联灭活疫苗。作为优选，所述抗原溶液灭活包括以下步骤：按0.2％(v/v)的终浓度为加入甲醛，混合后于2～8℃条件下下灭活24小时，期间每6小时搅拌1次，而后于37℃保持2小时。本发明提供了一种重组鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎三联灭活疫苗的制备方法，该技术方案通过对鸡新城疫病毒LaSota株的基因改造而实现。以重组NDV弱毒株rLaSota株为载体，首先将鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因插入F-HN之间，经利用反向遗传技术构建表达S1蛋白的重组新城疫病毒rLaSota/S1,结果表明，rLaSota可作为活载体稳定表达S1蛋白。而后构建表达HA基因的重组新城疫病毒rLaSota/S1-HA,即在重组新城疫病毒rLaSota/S1的P-M之间插入HA基因。对其进行免疫原性评估。结果表明通过常规灭活疫苗工艺制备出的重组鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎三联灭活疫苗其新城疫、禽流感和传染性支气管炎均有较强的保护作用。该构建重组疫苗策略可增强重组子的表达，最大程度减少其位于序列后部蛋白表达损失量。该重组疫苗具有载体病毒繁殖滴度高，易于生产；免疫一次可有效预防三种动物疫病；注射简单；填补了活载体疫苗类基因工程疫苗的空白，具有广泛的应用前景。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。实施例1(重组鸡新城疫病毒的构建)1、辅助性质粒NP、P、L基因的构建将NP、P、L三个基因通过RT-PCR进行扩增，然后分别将三个基因克隆到表达质粒载体pTM1,所构建的辅助质粒经DNA序列分析鉴定，将阳性质粒命名为pTM-NP、pTM-P、pTM-L。2、表达S1蛋白的重组新城疫病毒的构建通过一对特异性引物pM-s和pM-r使和TOPOTACloning载体线性化，利用IBV-M41株为模板，用一对特异性引物S1-F和S1-R扩增S1基因，，得到rLaSota/S1重组亚克隆。最后通过In-fusionPCRCloningKit将rLaSota/S1亚克隆线性化后连接到LaSota全长cDNA质粒中，将其转化到Stbl2感受态细胞，30℃培养24小时再通过DNA核苷酸序列分析鉴定筛选出阳性克隆，再将阳性克隆株用QIAprepSpinMiniprepKit纯化，命名为pLaSota/S1。3、重组rLaSota/S1病毒的拯救铺约1*106个HEp-2细胞至每孔细胞板中，预先用MVA/T7A感染。通过转染试剂，按说明书将pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1质粒共转染到HEp-2细胞上，转染后6小时，去掉转染培养基，并加入新鲜的5％FBS的DMEM培养基。72小时，通过将转染细胞反复冻融3次收获重组病毒，将重组病毒命名为rLaSota/S1，在10日龄SPF胚上增殖三代后保存在-80℃冰箱中。4、S1蛋白表达鉴定及病毒生物学特性检测首先通过RT-PCR方法用一对特异性引物检查插入片段的大小，同时送测序进行序列分析。然后利用红细胞凝集试验、半数鸡胚感染量试验、鸡胚平均死亡时间及脑内致病指数试验和生长曲线试验，对rLaSota/S1重组病毒的滴度及生物学特性进行分析鉴定，结果如表1所示。其结果表明，该重组病毒的鸡胚平均死亡时间有所增加和脑内致病指数为0.1，以上两项指标表明其病毒已被致弱，但对鸡胚仍有较强的感染能力。表1rLaSota/S1重组病毒的滴度及致病作用检测结果MDTICPIEID50HALaSota96h0.15109EID50/0.1ml29rLaSota/S1120h0.1108.7EID50/0.1ml295、表达HA蛋白的重组新城疫病毒的构建此处插入的HA基因序列来自禽流感病毒H9亚型。通过一对特异性引物pNP-s和pNP-r使和TOPOTACloning载体线性化，用一对特异性引物HA1和HA2扩增HA基因，得到rLaSota/HA重组亚克隆。最后通过In-fusionPCRCloningKit将rLaSota/HA亚克隆线性化后连接到rLaSota/S1的全长cDNA质粒中，将其转化到Stbl2感受态细胞，30℃培养24小时再通过DNA核苷酸序列分析鉴定筛选出阳性克隆，再将阳性克隆株用QIAprepSpinMiniprepKit纯化，命名为pLaSota/S1-HA。6、重组rLaSota/S1-HA病毒的拯救铺约1*106个HEp-2细胞至每孔细胞板中，预先用MVA/T7A感染。通过转染试剂，按说明书将pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1-HA质粒共转染到HEp-2细胞上，转染后6小时，去掉转染培养基，并加入新鲜的5％FBS的DMEM培养基。72小时，通过将转染细胞反复冻融3次收获重组病毒，将重组病毒命名为rLaSota/S1-HA，在10日龄SPF胚上增殖三代后保存在-80℃冰箱中。7、S1蛋白表达鉴定及病毒生物学特性检测首先通过RT-PCR方法用一对特异性引物检查插入片段的大小，同时送测序进行序列分析。然后利用半数鸡胚感染量试验、鸡胚平均死亡时间及脑内致病指数试验和生长曲线试验，对rLaSota/S1-HA重组病毒的滴度及生物学特性进行分析鉴定，结果如表2所示。其结果表明，该重组病毒的鸡胚平均死亡时间有所增加和脑内致病指数为0，以上两项指标表明其病毒已被致弱，但对鸡胚仍有较强的感染能力。表2rLaSota/S1-HA重组病毒的滴度及致病作用检测结果MDTICPIEID50LaSota96h0.15109EID50/0.1mlrLaSota/S1120h0.1108.7EID50/0.1mlrLaSota/S1-HA1200108.5EID50/0.1ml实施例2(重组新城疫病毒的繁殖及三联灭活疫苗的制备)1、病毒繁殖鸡胚的选用来自饲养管理良好的健康鸡群所产的鸡蛋，每批鸡胚要经过严格筛选。外检共4项：白壳、大小、破损及脏胚，内检共9项：去除沙壳、偏气室、游气室、倒置胚、无精蛋、终止胚、弱胚、污染胚、裂缝胚。检验合格的鸡胚可以作为制苗材料。将重组新城疫病毒rLaSota/S1-HA株，以1:8000倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置相对湿度60％～65％，温度33～35℃条件下孵育，不必翻蛋，收集120-144h死亡胚的尿囊液，气室向上直立，4℃冷胚24h，收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，以无菌剥除气室部位囊膜壳，在收获胚液前，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者弃去不用，收获鸡胚尿囊液于灭菌容器中，测得EID50可达到108.7/0.1ml。检测：对收获的病毒样品进行无菌检验、红细胞凝集试验和病毒含量测定，应无菌生长，HA效价≥9lg2，每0.1ml病毒含量应≥108.5EID50。对检验合格的样品注明名称、收获日期、代次等。收获的胚液灭活前置4℃保存。2、灭活灭活经浓缩检验合格后的两种病毒鸡胚尿囊液分别注入灭活罐，按0.2％的终浓度为加入甲醛(或其他灭活剂)溶液，边加边搅拌，使其充分混合，置2～8℃下灭活24小时，期间6小时搅拌1次，再取出置于37℃作用2小时。灭活完成后取样做灭活检验及无菌检验，置2～8℃下保存过夜，保存时间应不超过7日。3、灭活检验取灭活的病毒液接种10日龄易感鸡胚10枚，每胚0.1ml，置33～35℃培养96小时。24小时内死亡的不计数，收获鸡胚液，测定HA价，应为阴性，并盲传1代，测定HA价，如为阴性，即灭活完全。4、二联苗的制备取注射用白油94份，加司盘-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加热随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。。取吐温-804份装入带玻璃珠的瓶中灭菌，冷却后加入混合的灭活病毒液96份，充分振摇，至吐温-80完全溶解为止。使油相与水相的比例为3:1乳化程序为：取油相置胶体磨内，开动电机慢速搅拌，同时分别缓慢加入水相，加完后再以10000r/min搅拌2min～5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％以下。5、分装、检验将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，并贴上标签。其性状呈乳白色均匀乳状液。剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，呈现团状，不扩散。吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层现象、管底析出水相应不多于0.5ml。黏度按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。实施例3(重组鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎三联灭活疫苗的免疫效果)将60只21日龄SPF鸡随机分为2大组，其中A组30只为接种重组鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎三联灭活疫苗组，B组30只为空白对照组。免疫后14天分别肌肉注射北京株1ml(含104ELD50)、传染性支气管炎M41株攻毒剂量为104.0EID50、测AIV-HI抗体效价。攻毒组观察10天，观察其发病情况和死亡情况。采血组只测定抗体效价。具体结果如表3所示：表3二联疫苗免疫有效性实验结果以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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