本发明涉及猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸在制备治疗支气管哮喘药物中的应用。
背景技术：
支气管哮喘（Bronchial asthma，简称哮喘）是常见的慢性呼吸道疾病之一，是由多种炎症细胞、炎症介质参与的气道慢性炎症性疾病。这种慢性炎症会导致气道高反应性的产生，通常出现广泛多变的可逆性气流受限，并引起反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，且常在夜间和凌晨发作。近年来，由于气候、环境等的变化，哮喘的发病率、患病率及死亡率均呈逐年上升趋势。哮喘严重影响了患者的生活质量，并给患者带来了沉重的经济负担，因此该病全球范围内引起了广泛重视。
目前，糖皮质激素、β2受体激动剂、白三稀受体调节剂、抗胆碱能药、IgE抗体等是治疗哮喘的主要药物。然而，由于个体的敏感度不同，仍有部分患者如吸烟者、肥胖哮喘患者和非Th2增高型哮喘患者对上述治疗药物的反应较差。
猪胆粉是我国的传统中药，具有清热、润燥、解毒、止咳平喘等功效，用于热病燥渴、目赤、喉痹、黄疸、百日咳、哮喘、泄泻、痢疾、便秘、痈疮肿毒等症。猪胆粉结合型总胆酸中包括牛磺猪胆酸（Taurohyocholic acid）、牛磺猪去氧胆酸（Taurohyodeoxycholic acid）、牛磺鹅去氧胆酸（Taurochenodeoxycholic acid）、甘氨猪胆酸（Glycohyocholic acid）、甘氨猪去氧胆酸（Glycohyodeoxycholic acid）和甘氨鹅去氧胆酸（Glycochenodeoxycholic acid）。其中，牛磺猪去氧胆酸的含量达到4%以上。
据发明人所知，猪胆粉结合型总胆酸及牛磺猪去氧胆酸在制备治疗支气管哮喘药物中的应用，目前还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸在制备治疗支气管哮喘药物中的应用，涉及一种新用途。
本发明的实现过程如下：
猪胆粉结合型总胆酸的制备：取猪胆粉药材，加入其体积10倍量的质量分数为95%的乙醇，超声提取使猪胆粉完全溶解，静置12-14小时，过滤，回收溶剂，得棕黑色浸膏。将柱层析硅胶（100～160目）加入到浸膏中，浸膏与柱层析硅胶的质量比为1：2，拌样，挥干溶剂，研成80目细粉，细粉与中性氧化铝按质量比1：15干法装于层析柱中，用质量分数为95%的乙醇洗脱，收集洗脱液，用毛细管点样于硅胶G薄层板上，用展开剂展开后用显色剂显色，待薄层板上出现结合型胆酸斑点时合并洗脱液，至斑点消失时结束，将收集到的洗脱液减压回收溶剂，在烘箱内80～100℃烘干，得猪胆粉结合型总胆酸，含量以牛磺猪去氧胆酸计在50%以上。
上述的展开剂为乙酸乙酯与甲醇、水、冰醋酸的体积比为10：2：1：0.1的混合溶液，显色剂为香草醛硫酸试液或乙醇制硫酸试液。
2、牛磺猪去氧胆酸的制备
将上述得到的猪胆粉结合型总胆酸与柱层析硅胶（100～160目）按质量比1：2的比例拌样，研成80目细粉，细粉与柱层析硅胶（100～160目）按质量比1: 25干法装于层析柱中，经反复柱层析进行分离，以体积比为65：25：10：2的二氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸混合溶剂的下相洗脱，收集洗脱液，用毛细管点样于硅胶G薄层板上，用展开剂展开后用显色剂显色，待薄层板上出现牛磺猪去氧胆酸斑点时合并洗脱液，至斑点消失时结束，将收集到的洗脱液回收溶剂，于丙酮中重结晶，得牛磺猪去氧胆酸，纯度达95%以上。
上述的展开剂为乙酸乙酯与甲醇、水、冰醋酸的体积比为10：2：1：0.1的混合溶液，显色剂为香草醛硫酸试液或乙醇制硫酸试液。
上述方法制备的猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸在制备治疗支气管哮喘药物中的用途。
有效成分猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸制备治疗支气管哮喘的药物用常规药用制剂的形式来使用。所述的常规药用制剂含作为活性成分的猪胆粉结合型总胆酸或牛磺猪去氧胆酸，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于胃肠内给药的有机或无机的固体或液体赋形剂混合。该药用制剂可以是固体形式如片剂、颗粒剂、胶囊剂；也可以是液体形式如悬浮剂、糖浆剂、灌肠剂等。
上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂和其它常用的添加剂，如乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二醇、抗坏血酸、甘露醇等。
上述的制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。
采用本发明得到的猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸经过治疗支气管哮喘的药效学试验，表明猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸对哮喘模型小鼠免疫球蛋白、白介素4和白介素13含量升高有抑制作用，显示猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸能抑制促炎细胞因子的分泌，调节免疫反应，有效阻断免疫反应性对机体造成的损伤，达到治疗目的。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
以猪胆粉100 g为例，猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸的制备方法如下：
1.猪胆粉结合型总胆酸的制备
取猪胆粉药材100 g，加入其体积10倍量的质量分数为95%的乙醇，超声提取使猪胆粉完全溶解，静置12-14小时，过滤，回收溶剂，得棕黑色浸膏。取浸膏5 g，加入100-160目的柱层析硅胶10 g拌样，挥干溶剂，研成80目细粉，细粉与中性氧化铝按质量比1：15干法装于层析柱中，用质量分数为95%的乙醇洗脱，收集洗脱液，用毛细管点样于硅胶G薄层板上，用乙酸乙酯与甲醇、水、冰醋酸的体积比为10：2：1：0.1的混合溶液为展开剂展开，用香草醛硫酸试液显色，待薄层板上出现结合型胆酸斑点时合并洗脱液，至斑点消失时结束。将收集到的洗脱液减压回收溶剂，在烘箱内80～100℃烘干，得猪胆粉结合型总胆酸，含量以牛磺猪去氧胆酸（C26H45O6NS）计在50%以上。
2.牛磺猪去氧胆酸的制备
取步骤1中得到的猪胆粉结合型总胆酸2 g，加入100-160目的柱层析硅胶4 g拌样，研成80目细粉，细粉与柱层析硅胶（100～160目）按质量比1：25干法装于层析柱中，经反复柱层析进行分离，以体积比为65：25：10：2的二氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸混合溶剂的下相洗脱，收集洗脱液，用毛细管点样于硅胶G薄层板上，用乙酸乙酯与甲醇、水、冰醋酸的体积比为10：2：1：0.1的混合溶液为展开剂展开，用香草醛硫酸试液显色，待薄层板上出现牛磺猪去氧胆酸斑点时合并洗脱液，至斑点消失时结束。将收集到的洗脱液回收溶剂，于丙酮中重结晶，得牛磺猪去氧胆酸，纯度达95%以上。
实施例2
药用制剂猪胆粉结合型总胆酸制备成片剂，以生产片剂1000片为例所用原料和辅料及其质量配比如下：
猪胆粉结合型总胆酸 50g
糊精 50g
硬脂酸镁 2g
淀粉 加至300g
其制备方法按制剂学片剂的常规方法进行，每片重0.3g，每片含猪胆粉结合型总胆酸50mg。
药用制剂牛磺猪去氧胆酸制备成片剂，以生产片剂1000片为例所用原料和辅料及其质量配比如下：
牛磺猪去氧胆酸 10g
糊精 50g
硬脂酸镁 2g
淀粉 加至300g
其制备方法按制剂学片剂的常规方法进行，每片重0.3g，每片含牛磺猪去氧胆酸10mg。
实施例3
药用制剂猪胆粉结合型总胆酸制备成胶囊剂，以生产胶囊剂1000粒为例所用原料和辅料及其质量配比如下：
猪胆粉结合型总胆酸 50g
微晶纤维素 20g
硬脂酸镁 1g
淀粉 加至300g
其制备方法按制剂学胶囊剂的常规方法进行，每粒重0.3g，每粒含猪胆粉结合型总胆酸50mg。
药用制剂牛磺猪去氧胆酸制备成胶囊剂，以生产胶囊剂1000粒为例所用原料和辅料及其质量配比如下：
牛磺猪去氧胆酸 10g
微晶纤维素 20g
硬脂酸镁 1g
淀粉 加至300g
其制备方法按制剂学胶囊剂的常规方法进行，每粒重0.3g，每粒含牛磺猪去氧胆酸10 mg。
实施例4
药用制剂猪胆粉结合型总胆酸制备成颗粒剂，以生产颗粒剂产品1000g为例所用原料和辅料及其质量配比如下：
猪胆粉结合型总胆酸 5g
蔗糖 400g
糊精 加至1000g
制备方法按制剂学颗粒剂的常规方法进行，每袋重10g，1g含猪胆粉结合型总胆酸5 mg。
药用制剂牛磺猪去氧胆酸制备成颗粒剂，以生产颗粒剂产品1000g为例所用原料和辅料及其质量配比如下：
牛磺猪去氧胆酸 1g
蔗糖 400g
糊精 加至1000g
制备方法按制剂学颗粒剂的常规方法进行，每袋重10g，1g含牛磺猪去氧胆酸1 mg。
实施例5
药用制剂猪胆粉结合型总胆酸制备成糖浆剂，以生产糖浆剂1000 mL为例所用原料和辅料及其质量配比如下：
猪胆粉结合型总胆酸 5g
甜蜜素 10g
蒸馏水 加至1000mL
其制备方法按制剂学糖浆剂的常规方法进行，每瓶10mL，1mL含猪胆粉结合型总胆酸5mg。
药用制剂牛磺猪去氧胆酸制备成糖浆剂，以生产糖浆剂1000 mL为例所用原料和辅料及其质量配比如下：
牛磺猪去氧胆酸 1g
甜蜜素 10g
蒸馏水 加至1000mL
其制备方法按制剂学糖浆剂的常规方法进行，每瓶10mL，1mL含牛磺猪去氧胆酸1 mg。
为了验证采用本发明制备的猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸的有益效果，发明人对猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸进行了治疗支气管哮喘的药效学试验，各种试验情况如下：
1、实验药物
猪胆粉结合型总胆酸，为黄色至深黄色的固体粉末，味苦，二次重蒸水配制，4℃密闭保存。牛磺猪去氧胆酸，为白色固体粉末，味微苦，二次重蒸水配制，4℃密闭保存。
2、实验动物
雌性昆明种健康小鼠，体重（22±2）ｇ，购自西安交通大学医学院实验动物中心，合格证编号为61001700000563。
3、实验试剂
卵清蛋白（OVA）试剂购自 Sigma公司，小鼠免疫球蛋白IgE、白介素4（IL-4）和白介素13（IL-13）酶联免疫试剂盒购自R&D Systems公司。
4、实验方法
猪胆粉结合型总胆酸用二次重蒸水分别配成体积浓度20 mg/ml、10 mg/ml、5 mg/ml 的水溶液，牛磺猪去氧胆酸用二次重蒸水分别配成体积浓度3 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml 的水溶液，4℃冰箱保存备用。
昆明种健康雌性小鼠，体重（22±2）g，在实验条件下适应1周后，随机分为8组，即正常对照组、模型组、猪胆粉结合型总胆酸大、中、小剂量给药组、牛磺猪去氧胆酸大、中、小剂量给药组，进行试验。
支气管哮喘小鼠模型采用OVA制备分为致敏和激发两个阶段。
致敏阶段：正常对照组在小鼠腹腔注射0.2 mL生理盐水致敏，其余各组小鼠均于实验第0、7、14天腹腔注射0.2 mL含20 μg OVA和2 mg氢氧化铝凝胶的无菌抗原液致敏。
激发阶段：实验第22、23、24天将除正常对照组外其余各组小鼠置于密闭的有机玻璃箱中，雾化吸入1%（w/v） OVA生理盐水溶液，每天1次，每次30 min，连续激发3天。正常对照组用生理盐水激发。
各组小鼠于实验第18-24天灌胃给药，每次于雾化前1 小时给药治疗。正常对照组和模型组小鼠分别给予生理盐水灌胃（20 ml/kg），给药组猪胆粉结合型总胆酸按大计量400 mg/kg、中计量200 mg/kg、小剂量100 mg/kg灌胃给药，给药组牛磺猪去氧胆酸按大计量60 mg/kg、中计量40 mg/kg、小剂量20 mg/kg灌胃给药每天一次，持续七天。末次雾化结束24小时后，处死小鼠。检测各组小鼠血清中IgE含量，测定肺泡灌洗液中IL-4和IL-13活性，制备肺组织病理切片。
血清的采集及肺泡灌洗液的制备：
最后一次雾化激发操作24小时后，对小鼠进行眼球采血。从小鼠眼眶取血1 ml，把血液注入高速离心机，5000转/分钟离心15分钟，取上清液放入-80℃冰箱冷冻保存，用于检测IgE。
小鼠处死后，开胸暴露气管至左右分支处，结扎右主支气管后，将右肺取下，放入10%甲醛溶液中固定，48 小时后进行水洗，再用不同浓度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脱水，经过二甲苯透明后用石蜡包埋，用切片机切成5 µm厚的切片，采用苏木精-伊红染色法进行染色。光镜下观察肺组织病理改变，拍照记录。
小鼠处死后，暴露并分离气管后，经颈部气管插入留置针，向左肺匀速注入2 mL生理盐水，留置2分钟，按摩小鼠的胸部30秒后缓慢充分回收肺泡灌洗液，重复同样操作3次，保证回收率>80%。充分混匀肺泡灌洗液，以2000转/分钟离心5分钟，吸取上清于离心管中，用于测定细胞因子含量。
实验数据以均值±标准差表示。实验数据采用SPSS17.0统计分析软件进行统计分析，多组均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），P <0.05 为差异有统计学意义。
5、实验结果
（1）实验小鼠病理学形态变化
小鼠肺组织用苏木精-伊红染色法染色后在光学显微镜下观察，正常对照组小鼠肺组织切片支气管壁完整，厚薄均匀，粘膜上皮细胞排列整齐，管腔内未见脱落的上皮细胞及炎性渗出物，管壁及肺泡间未见嗜酸性粒细胞。模型组小鼠肺组织切片支气管壁环肌肥厚，粘膜上皮细胞排列紊乱，部分上皮细胞脱落，管腔内可见炎性渗出物，管壁和肺泡间隔可见较多淋巴细胞、单核细胞及嗜酸性粒细胞。阳性对照组小鼠肺组织切片支气管粘膜上皮细胞部分破坏，支气管管壁稍增厚，粘膜下可见轻度充血和水肿，视野下可见少许炎性渗出物。猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸各剂量给药组小鼠肺组织切片支气管壁结构基本恢复，管腔内无炎性渗出物，粘膜上皮细胞开始恢复，粘膜下充血及水肺不明显。
（2）猪胆粉结合型总胆酸及牛磺猪去氧胆酸对小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13活性及血清中IgE含量的影响
猪胆粉结合型总胆酸及牛磺猪去氧胆酸治疗组与模型组相比，IL-4、IL-13和IgE含量明显降低，有显著性差异（P <0.001或P ﹤0.01或P ﹤0.05），与正常空白对照组相比，差异无显著性，表明猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸可明显抑制卵清蛋白（OVA）诱导小鼠肺泡灌洗液IL-4和IL-13活性及血清IgE含量升高。
6、结论
实验结果表明，猪胆粉结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸对卵清蛋白诱导的支气管哮喘模型小鼠免疫球蛋白、白介素4和白介素13含量升高有抑制作用，猪胆汁结合型总胆酸和牛磺猪去氧胆酸能抑制促炎细胞因子的分泌，调节免疫反应，有效地阻断免疫反应性对机体造成的损伤，达到治疗目的。
含有效成分猪胆粉结合型总胆酸或牛磺猪去氧胆酸药物的功能：消炎。
含有效成分猪胆粉结合型总胆酸或牛磺猪去氧胆酸药物主治：支气管哮喘。
含有效成分猪胆粉结合型总胆酸或牛磺猪去氧胆酸药物的规格：片剂每片重0.3g，每片含猪胆粉结合型总胆酸50 mg，或每片含牛磺猪去氧胆酸10 mg；胶囊剂每粒重0.3 g，每粒含猪胆粉结合型总胆酸50 mg，或每粒含牛磺猪去氧胆酸10 mg；颗粒剂每袋重10g，每克含猪胆粉结合型总胆酸5 mg，或每克含牛磺猪去氧胆酸1 mg；糖浆剂每瓶10mL，每毫升含猪胆粉结合型总胆酸5 mg，或每毫升含牛磺猪去氧胆酸1 mg。
含有效成分猪胆粉结合型总胆酸或牛磺猪去氧胆酸药物的用法用量：口服药物每日服3次，每次口服片剂1片或胶囊剂1粒或颗粒剂1袋或糖浆剂1支，小儿酌减。
含有效成分猪胆粉结合型总胆酸或牛磺猪去氧胆酸药物的储藏：密封阴凉干燥处储藏。
含有效成分猪胆粉结合型总胆酸或牛磺猪去氧胆酸药物的有效期：两年。