一种具有增强免疫作用的大蒜多糖和硒化党参多糖的组合物的制作方法

本发明一种具有增强免疫作用的大蒜多糖和硒化党参多糖的组合物，属于中兽药免疫增强剂研究技术领域。

二、

背景技术：

动物疫病一直严重危害畜牧业的发展，尤其是病毒性传染病，迄今尚无有效的治疗方法，应用疫苗预防仍是最主要的措施。由于种种原因，多数疫苗只有与免疫增强剂或免疫佐剂配合应用才能发挥良好的防疫效果。但是，目前国内外广泛使用的油乳类、铝胶类等化学性免疫佐剂常有副作用大、局部刺激强、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊端。因此，研制开发高效、安全的新型免疫增强剂成为亟待解决的问题。

研究表明，许多中药具有免疫增强作用，但其作用相对较弱，而且传统方剂的粗、大、黑现象也限制了其推广应用。近年来，多糖的免疫增强作用吸引了人们极大的关注；硒是生命必需的微量元素，也具有较好的免疫增强作用。将多糖和硒结合起来制成硒化多糖，将使硒和多糖的生理功能得到优化，免疫增强活性大大提高，也可弥补天然硒多糖资源不足的问题。

为了研制新型免疫增强剂，我们首先研究了十余种中药多糖的硒化修饰，证明硒化修饰能进一步提高中药多糖的增强免疫活性，分别筛选出各自活性最强的硒化多糖和最佳修饰条件。为节约成本，以多糖和硒化多糖组成多个复方，比较它们的增强免疫活性，通过离体试验筛选出活性较强的3个复方。本发明进一步通过动物在体试验比较3个复方的增强免疫活性，筛选出一个活性最强的大蒜多糖和硒化党参多糖复方，可以开发成中兽药免疫增强剂。

三、

技术实现要素：

技术问题 本发明针对当前动物疫病防控急需高效、安全的新型免疫增强剂的问题，提供一种增强免疫作用显著的大蒜多糖和硒化党参多糖的组合物，可以开发成中兽药免疫增强剂。

技术方案 一种具有增强免疫作用的大蒜多糖和硒化党参多糖的组合物，包括：提取纯化3种多糖，制备2种硒化多糖，组成3个多糖-硒化多糖复方，通过动物在体试验比较它们的增强免疫活性，筛选出活性最强的复方。其特征在于，由大蒜多糖和硒化党参多糖组成的复方，增强免疫作用最强。

有益效果 本发明提供一种具有增强免疫作用的大蒜多糖和硒化党参多糖的组合物，可以开发成中兽药免疫增强剂。在动物生产上推广应用，提高动物疫病的防控效果，保障养殖业的健康发展。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.从畜牧生产方面，动物疫病防控急需新型免疫增强剂，本发明提供一种增强免疫作用显著的多糖-硒化多糖复方，可开发成新型免疫增强剂，填补国内外的空白。

2.从中兽药研究方面，本发明应用分子修饰技术对中药多糖进行结构改造，进一步提高多糖的生物活性，而且处方精练，成分明确，质量可控，国内外未见报道。

3.与化学佐剂相比，本发明来源天然于中药，无毒副作用，无药残隐患，保障动物源食品安全。

四、具体实施方式

1.多糖和硒化多糖的制备

当归多糖(CAP)、党参多糖(CPP)和大蒜多糖(GP)，分别用水煎醇沉法提取，DEAE-纤维素柱层析纯化；硒化当归多糖(sCAP)和硒化党参多糖(sCPP)，分别用硝酸-亚硒酸钠法制备，用硫酸-苯酚法测定多糖含量，原子荧光光谱法测定硒含量。

2.多糖-硒化多糖复方的制备

三个多糖-硒化多糖复方的组成分别为当归多糖9份加硒化党参多糖1份(CAP-sCPP)、大蒜多糖9份加硒化党参多糖1份(GP-sCPP)、党参多糖9份加硒化当归多糖1份(CPP-sCAP)。将3个复方分别用生理盐水溶解稀释成5mg·mL^-1、10mg·mL^-1两个浓度，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，备用。

3.增强免疫活性的比较

取14日龄雏鸡270羽随机分为9组，每组30羽，除空白对照组(BC)外均用新城疫IV系苗点眼滴鼻免疫，28日龄二免。在每次免疫的同时，3个复方的高(CAP-sCPP_H、GP-sCPP_H、CPP-sCAP_H)、低(CAP-sCPP_L、GP-sCPP_L、CPP-sCAP_L)剂量组每羽分别肌肉注射10mg·mL^-1、5mg·mL^-1浓度的复方多糖溶液0.5ml，免疫对照组(VC)和BC组注射等量生理盐水，每天1次，连续3天。分别于首免后第7(D₇)、14(D₁₄)、21(D₂₁)、28(D₂₈)天，每组随机抽取4羽，心脏采血，用MTT法测定淋巴细胞增殖(A₅₇₀值)；每组随机抽取6只翼静脉采血，分离血清，分别用β-微量法和试剂盒测定测定血凝抑制抗体效价和白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)的含量。统计比较各组的差异。结果如下：

(1)各组淋巴细胞增殖的变化

结果见表1。6个复方组在4个时间点的淋巴细胞A₅₇₀值均高于或显著高于VC和BC组，说明3个复方的高、低剂量均能促进淋巴细胞增殖，从而增强细胞免疫。GP-sCPP_H组在4个时间点的淋巴细胞A₅₇₀值均为最高，均显著高于VC和BC组(P＜0.05)；CAP-sCPP_H和GP-sCPP_L组在D₁₄和D₂₈、CPP-sCAP_H组在D₂₁和D₂₈的淋巴细胞A₅₇₀值均显著高于VC和BC组(P＜0.05)，说明这些复方在这些时间点能显著增强细胞免疫，GP-sCPP的活性最强。

表1各组淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

注：同列数据标注字母不同者差异显著(P＜0.05)。以下表同。

(2)各组血清血清抗体效价的变化

结果见表2。6个复方组在4个时间点的血清抗体效价均高于、多显著高于VC和BC组，说明3个复方的高、低剂量均能增强体液免疫。GP-sCPP_H组在4个时间点的抗体效价均为最高，均显著高于VC和BC组(P＜0.05)；GP-sCPP_H、CAP-sCPP_L和GP-sCPP_L组在D₇、D₁₄和D₂₈、CPP-sCAP_H组在D₁₄和D₂₈、CPP-sCAP_L组在D₂₈的抗体效价均显著高于VC和BC组(P＜0.05)，说明这些复方在这些时间点能显著增强体液免疫，GP-sCPP的活性最强。

表2各组血清抗体效价的变化(Log2)

(3)各组血清IL-2含量的变化

结果见表3。6个复方组在4个时间点的血清IL-2含量均高于、多显著高于VC和BC组，说明3个复方的高、低剂量均能促进IL-2的产生，从而增强免疫。GP-sCPP_H在4个时间点的IL-2含量均为最高，均显著高于VC和BC组(P＜0.05)；CAP-sCPP_H组在D₇、除CPP-sCAP_L外其余5个复方在D₁₄、6个复方组在D₂₁和D₂₈的血清IL-2含量均显著高于VC和BC组(P＜0.05)，表明这些复方在这些时间点能显著增强免疫，GP-sCPP的作用最强。

表3各组血清IL-2含量的变化

(4)各组血清IFN-γ含量的变化

结果见表4。6个复方组在4个时间点的血清IFN-γ含量均高于、多显著高于VC和BC组，说明3个复方的高、低剂量均能促进IFN-γ的产生，从而增强免疫。GP-sCPP_H在4个时间点的IFN-γ含量均为最高，均显著高于VC和BC组(P＜0.05)；CPP-sCAP_H和GP-sCPP_L组在D₇～D₂₁、CAP-sCPP_H组在D₇和D₂₁、CPP-sCAP_L组在D₂₁的血清IFN-γ含量均显著高于VC和BC组(P＜0.05)，说明这些复方在这些时间点均能显著增强免疫，GP-sCPP的作用最强。

表4各组血清IFN-γ含量的变化

综合以上结果可见，大蒜多糖-硒化党参多糖的增强免疫活性最强，可以开发成中兽药免疫增强剂。