本发明涉及医药
技术领域：
，尤其涉及一种干细胞制剂及其在制备治疗慢性肾炎的药物中的应用。
背景技术：
：慢性肾炎：即慢性肾小球肾炎，系指蛋白尿、血尿、高血压、水肿为基本临床表现，起病方式各有不同，病情迁延，病变缓慢进展，可有不同程度的肾功能减退，具有肾功能恶化倾向和最终将发展为慢性肾衰竭的一组肾小球病。大部分慢性肾炎的发病机制是免疫介导炎症。另外，非免疫、非炎症机制在疾病发展过程中起重要作用，如存在肾单位长期代偿处于血流高灌注、高滤过和高跨膜压的“三高”状态，久之导致健存肾小球硬化。慢性肾炎可发生于任何年龄，但以青中年为主，男性多见。多数起病缓慢、隐袭。慢性肾炎是一种自身免疫性疾病，其病理损害主要与免疫介导的炎症反应有关，其结果是导致肾小球硬化，肾小管间质纤维化。对于慢性肾炎的治疗，尽管已经阐释了很多治疗方式，仍无法阻止该病的发展。慢性肾炎的治疗目前西医多采用激素疗法，但激素对病情的掩盖性较强，副作用明显，治标不治本；中医采用具有解毒、消炎作用的中药材制成，但中药治疗的效果差强人意。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种干细胞制剂及其在制备治疗慢性肾炎的药物中的应用，该制剂能够有效治疗慢性肾炎。本发明提供的干细胞制剂包括脐带间充质干细胞和生理盐水，其中脐带间充质干细胞的密度为1×105cell/mL～5×105cell/mL。一些实施例中，脐带间充质干细胞的密度为1×105cell/mL。一些实施例中，脐带间充质干细胞的密度为2×105cell/mL。一些实施例中，脐带间充质干细胞的密度为5×105cell/mL。本发明制剂中，脐带间充质干细胞的表面标志物CD29表达量≥95％；CD44表达量≥90％；CD105表达量≥95％；CD34表达量≤5％；CD45表达量≤2％；CD86表达量≤5％；HLA-DR不表达。脐带间充质干细胞的获得方法为市场购得或自行制备本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。干细胞的制备方法包括：步骤1：脐带以含有200U/m双抗的PBS溶液冲洗3遍后，剪成2cm长小段，剥去动、静脉管和外膜后，剪碎成1～2mm2小块，均匀贴附于10cm培养皿，37℃5％CO2培养箱内倒放1～2h；培养基为X-VIVO15无血清培养基。步骤2：加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15无血清培养基，37℃5％CO2培养2～3天后半量换液，继续培养6～8天，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；步骤3：待生长至80％融合，倒去培养液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS终止消化，400g离心5min收集脐带间充质细胞。本发明中，干细胞的培养的采用含有EGF的X-VIVO15无血清培养基；其中EGF的浓度为10ng/mL。干细胞的培养方法为，将细胞接种至含有EGF的X-VIVO15无血清培养基37℃，5％CO2培养箱培养至80％融合后继续传代。本发明提供的干细胞制剂在制备抑制T细胞表面抗原CD8的表达的药物中的应用。实验表明，本发明提供的干细胞制剂能够将T细胞表面抗原CD8的表达量降低5％以上。本发明提供的干细胞制剂在制备促进IL-4分泌的药物中的应用。所述IL-4为外周血T淋巴细胞的IL-4。实验表明，本发明提供的干细胞制剂能够将外周血T淋巴细胞中IL-4的表达量上调15％以上。本发明提供的干细胞制剂在制备抑制INF-γ分泌的药物中的应用。所述INF-γ为外周血T淋巴细胞的INF-γ。实验表明，本发明提供的干细胞制剂能够将外周血T淋巴细胞中INF-γ的表达量降低12％以上。本发明提供的干细胞制剂在制备降低尿蛋白含量、尿红细胞数量的药物中的应用。本发明实验表明，给予本发明提供的干细胞制剂，38％的慢性肾炎患者的尿蛋白减少，与给予前相比下降50％以上，肾功能正常或基本正常，症状、体征有所改善，尿镜检红细胞＜2个/HP。另有49％的慢性肾炎患者的尿蛋白减少，定量值小于0.4g/24h，肾功能正常或基本正常，症状、体征有所改善，尿镜检红细胞＜2个/HP。说明本发明提供的干细胞制剂具有降低尿蛋白含量、尿红细胞含量的药物中的应用。本发明提供的干细胞制剂在制备治疗慢性肾炎的药物中的应用。综合上述结果，本发明提供的干细胞制剂能够具有治疗慢性肾炎的作用。本发明提供的干细胞制剂可单独用于改善慢性肾炎，也可添加其他辅料制成不同的药物剂型用于治疗慢性肾炎，本发明对此不做限定。本发明还提供了一种治疗慢性肾炎的药物，其中包括本发明提供的干细胞制剂。本发明还提供了一种治疗慢性肾炎的方式，具体为给予本发明提供的干细胞制剂。所述给予的方式为滴注，具体为静脉滴注。给予的剂量为100mL/次。2天一次连续3次，3个月一个疗程。本发明提供的干细胞制剂由生理盐水重悬脐带间充质干细胞制成，其通过抑制T细胞表面抗原CD8的表达和INF-γ的分泌，并上调外周血T淋巴细胞的IL-4的分泌，进而降低患者尿蛋白含量、尿红细胞数量，从而起到治疗慢性肾炎的作用，其治疗的有效率可达88％，缓解率可达54％。具体实施方式本发明提供了一种干细胞制剂及其在制备治疗慢性肾炎的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1制备脐带间充质干细胞脐带以含有200U/m双抗的PBS溶液冲洗3遍后，剪成2cm长小段，剥去动、静脉管和外膜后，剪碎成1-2mm2小块，均匀贴附于10cm培养皿，37℃5％CO2培养箱内倒放1-2h；培养基为X-VIVO15无血清培养基。加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15无血清培养基，37℃5％CO2培养2～3天后半量换液，继续培养6～8天，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；待生长至80％融合，倒去培养液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS终止消化，400g离心5min收集脐带间充质细胞。以含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15无血清培养基重悬脐带间充质细胞，根据计数结果接种2-3皿(接种密度为1-5×105cell/ml)。待细胞生长至80％融合后继续传代，至P2或P3代细胞进行细胞和培养上清液的收集。对收集后的细胞进行流式细胞检测，选择符合表1标准的干细胞制备干细胞制剂。表1干细胞筛选标准实施例2干细胞制剂的制备收集实施例1中经筛选的P2和P3代干细胞，以生理盐水重悬至细胞密度为2×106cell/mL。实施例3干细胞制剂的制备收集实施例1中经筛选的P2和P3代干细胞，以生理盐水重悬至细胞密度为1×106cell/mL。实施例4干细胞制剂的制备收集实施例1中经筛选的P2和P3代干细胞，以生理盐水重悬至细胞密度为5×106cell/mL。实施例5检测实施例2～4的干细胞制剂对外周血T淋巴细胞表达炎症相关抗原CD8的作用，及对外周血T淋巴细胞分泌IL-4和INF-γ的作用实验方法为：在聚羟基脂肪酸酯(PHA，10g/ml浓度)存在条件下，将外周血T淋巴细胞(PBMC)与本发明制备的干细胞制剂共同培养，培养时间为3天。分组为：阳性对照组：PHA+PBMC；实验组1：PHA+PBMC+实施例2干细胞制剂；实验组2：PHA+PBMC+实施例3干细胞制剂；实验组3：PHA+PBMC+实施例4干细胞制剂；3天后测定收集各组PBMC检测CD8差异；收集各组上清液检测IL-4和INF-γ浓度差异；结果如表1：表1细胞检测结果阳性组实验组1实验组2实验组3CD829.8％24.5％22.3％23.8％IL-40.27ug/ml0.35ug/ml0.32ug/ml0.41ug/mlINF-γ0.18ug/ml0.13ug/ml0.12ug/ml0.15ug/ml实验表明，本发明提供的干细胞制剂能够将T细胞表面抗原CD8的表达量降低5％以上。将外周血T淋巴细胞中IL-4的表达量上调15％以上。将外周血T淋巴细胞中INF-γ的表达量降低12％以上。实施例6随机选取志愿患者200例，诊断结果符合原发性肾小球肾炎。其中男性112例，女性88例，年龄20-55岁，平均年龄33岁，病程1～5年，平均2.2年，血肌酐(SCr)≤177umol/L，并签订知情同意书。所有病人随机分为4组进行治疗。对照组：现有专利药物；实验组1：给予实施例2干细胞制剂；实验组2：给予实施例3干细胞制剂；实验组3：给予实施例4干细胞制剂；实验组1～3每人每次滴注本发明的干细胞制剂100mL，隔天回输一次，3次一疗程，间隔3个月进行第二个疗程。所有病人持续治疗跟踪3年，进行疗效评价：缓解：尿蛋白定量＜0.4g/24h，尿镜检红细胞＜2个/HP，肾功能正常、症状、体征消失；有效：尿蛋白检测持续减少比治疗前下降50％以上，肾功能正常或基本正常，症状、体征有所改善。评价结果如表3：表3评价结果分组病例数缓解数有效数缓解率有效率阳性对照5092818％74％实验组150251850％86％实验组250271754％88％实验组350222244％88％结果表明，本发明提供的组合物对慢性肾炎的有效率可达88％，缓解率可达54％。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3