本发明涉及生物治疗领域，特别涉及一种用于糖尿病足的干细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
糖尿病(Diabetes Mellitus)发病率在全球呈上升的趋势，现已成为继心血管疾病及肿瘤后的第3大非传染性疾病，糖尿病患者由于血糖浓度过高，肢体抵抗能力下降，下肢和足部的血流供应不足，合并神经病变及各种不同程度末梢血管病变，而导致的下肢感染、溃疡形成和/或深部组织破坏。
1972年，Catterall首先提出了糖尿病足(diabetic foot)发病的三大因素：血管闭塞性缺血、感染、以及神经病变。其中，血管病变是一个重要因素。它不仅是导致糖尿病患者足部感染的主要病因，而且也是影响糖尿病足部溃疡(diabetic footulcer，DFU)预后的最重要因素。由于糖尿病患者机体持续处于高血糖与蛋白质的非酶糖化状态，引起脂代谢紊乱，使血液持续处于高粘稠、高凝状态，因此患者下肢动脉较容易发生血管壁增厚、管腔狭窄等血管病变，进而导致不同程度的微循环障碍，出现下肢供血逐渐减少，最终发生组织损伤。Loomans等的研究结果显示，糖尿病患者在代谢紊乱的状态下，血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)的数量减少且有功能障碍，影响其增殖、黏附及血管生成。糖尿病的高胰岛素血症导致了血管内皮祖细胞的增殖和存活能力的减低。因此，在糖尿病等一些疾病状态下，血管内皮祖细胞的数量和功能两方面均有所降低；血管内皮祖细胞的功能状态异常，导致血管再生能力减弱，这可能是引起糖尿病血管病变的基础，同时也是此类疾病预后差、治疗困难的原因之一。
研究发现，从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞—脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)具有恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生的特点。
基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是吸引静息T淋巴细胞、单核细胞以及造血干细胞的趋化因子。在创面发生时，局部产生炎症反应，生成多种细胞因子，其中包括SDF-1因子，对细胞有趋化归巢的作用，使得归巢后的干细胞分化成纤维母细胞，或是归巢的干细胞分泌细胞因子促进血管新生，从而达到修复创面的作用。
纤连蛋白也称纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)，是1974年国外研究发现的一种高分子糖蛋白，具有多种生物学功能。纤连蛋白广泛存在于动物组织和组织液中，具有多种生物活性。大量国内外的研究结果证明，纤连蛋白在进化过程中保守性很强，各种动物体液中的纤连蛋白具有非常相近的结构、性质和生物学功能，因而不同来源的纤连蛋白可以相互替代使用。纤连蛋白主要功能是介导细胞粘着，纯化的纤连蛋白可增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。在胚胎发生过程中，纤连蛋白对于许多类型细胞的迁移和分化是必需的。在创伤修复中，纤连蛋白亦是重要的。在血凝块形成过程中，纤连蛋白促进血小板附着于血管受损部位。
目前，糖尿病足对各种治疗方法不敏感，治疗效果不佳，预后不良，病变恶化易导致截肢。糖尿病足的传统治疗方法有药物治疗、血管搭桥、局部涂抹中药及介入治疗，但是手术和介入治疗对患者的选择要求较高，有严格的指征，导致许多自身条件欠佳或合并有重要脏器严重病变而不能耐受搭桥手术及介入治疗的中老年患者只能选择药物治疗，而这些治疗方法的远期效果均不理想且不能从根本上解决问题，很多患者最终无法避免截肢的厄运。因此，研发一种对糖尿病足有良好疗效的干细胞制剂是本领域技术人员需要解决的技术问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明公开了一种对糖尿病足有改善作用的干细胞制剂，所述干细胞制剂对糖尿病足有良好的疗效。
本发明公开了一种干细胞制剂，包括如下含量的组分：
优选地，为了达到更好的作用效果，所述干细胞制剂包括如下含量的组分：
作为优选，所述基质细胞衍生因子与所述纤连蛋白的质量复配比为1:30～1:90，在该复配比范围内干细胞制剂对糖尿病足的治疗效果最好。其中，优选复配比为1:50～1:80。
本发明公开了上述干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述脂肪干细胞、所述基质细胞衍生因子、所述纤连蛋白和溶剂混合，制得所述干细胞制剂。
优选地，所述溶剂为生理盐水。
所述脂肪干细胞按照以下步骤获得：
a)、取腹部皮肤下的脂肪组织；
b)、用清洗液清洗所述脂肪组织，剪成0.2～0.3cm2的脂肪块，再用清洗液清洗；
c)、用胶原酶消化脂肪块，离心收集脂肪干细胞；
d)、将步骤c)收集的脂肪干细胞进行培养；
e)、收集培养至第3代的脂肪干细胞，用生理盐水重悬制得得到所述脂肪干细胞的悬液。
优选地，所述清洗液为D-Hank’s液。
优选地，所述胶原酶为I型胶原酶。
本发明还公开了所述干细胞制剂或所述制备方法制得的干细胞制剂在制备治疗糖尿病足的生物制剂或药物中的应用。
链脲佐菌素(STZ)是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲，是一种DNA烷基化试剂，能通过GLUT2葡萄糖转运蛋白(GLUT2glucose trasport protein)独自进入细胞。对胰腺胰岛胰岛素诱发的β-细胞具毒性。STZ对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用，能诱发许多动物产生糖尿病。因此一般可以利用采用大鼠和小鼠制造糖尿病的动物模型。
本发明用链脲佐菌素建立大鼠的糖尿病足模型，用所制备的干细胞制剂对模型大鼠进行注射。与对照组相比，本发明所制备的干细胞制剂对治疗糖尿病足有良好的疗效。
综上所述，本发明公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，该干细胞制剂包括脂肪干细胞、基质细胞衍生因子和纤连蛋白，将这3个组分进过特定含量的混合制成的干细胞制剂输入机体内可以有效的治疗糖尿病足。与现有技术相比，本发明提供的方法取材容易，减轻患者的痛苦，满足疾病各个进展程度的患者；脂肪干细胞不仅能在坏死处发挥修复，对患者机体微环境有一定的改善作用。
具体实施方式
本发明公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，该干细胞制剂对糖尿病足具有良好的疗效。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例中使用到的组分和试剂均为自制或市售来源。
基质细胞衍生因子(鼠源)购自上海江莱生物科技有限公司。
纤连蛋白(鼠源)购自上海江莱生物科技有限公司。
本实施例以大鼠作为试验对象，所用的脂肪干细胞为从大鼠体内取材的脂肪干细胞，所用的基质细胞衍生因子和纤连蛋白均为鼠源。需要注意的是，本实施例公开的方法具有普适性，并不限于应用在大鼠上，还可应用于其它物种，也可应用于人体。
实施例1制备脂肪干细胞
1、在无菌条件下，取大鼠自体腹部健康皮肤下的3mL脂肪组织，置于5mL离心管；
2、在无菌条件下用D-Hank’s液离心清洗3遍脂肪组织，离心条件为4℃、200g，离心时间为10min；离心完后用眼科剪刀将脂肪组织剪成0.2-0.3cm3的小块，再用D-Hank’s液清洗2遍；
3、用Ⅰ型胶原酶消化脂肪块20min，400g离心10min收集脂肪干细胞；
4、以5000个/cm2的密度将离心收集的脂肪干细胞接种至六孔板培养，每培养三天将细胞用0.25％胰酶消化再以5000个/cm2的密度接种培养；
5、用0.25％胰酶消化收集第3代脂肪干细胞，用生理盐水重悬成1.5mL细胞悬液，置于4℃保存待用。
实施例2制备干细胞制剂
将基质细胞衍生因子和纤连蛋白加入1.0mL的生理盐水，使基质细胞衍生因子的浓度为8ng/mL，使纤连蛋白的浓度为0.5μg/mL；混匀后加入实施例1制备的脂肪干细胞，并使脂肪干细胞的浓度为8×106个/mL，混匀后转移至5mL注射器中待用，制得干细胞制剂。
实施例3制备干细胞制剂
将基质细胞衍生因子和纤连蛋白加入1.0mL的生理盐水，使基质细胞衍生因子的浓度为5ng/mL，使纤连蛋白的浓度为0.4μg/mL；混匀后加入实施例1制备的脂肪干细胞，并使脂肪干细胞的浓度为4.6×106个/mL，混匀后转移至5mL注射器中待用，制得干细胞制剂。
实施例4制备干细胞制剂
将基质细胞衍生因子和纤连蛋白加入1.0mL的生理盐水，使基质细胞衍生因子的浓度为15ng/mL，使纤连蛋白的浓度为1.5μg/mL；混匀后加入实施例1制备的脂肪干细胞，并使脂肪干细胞的浓度为1×108个/mL，混匀后转移至5mL注射器中待用，制得干细胞制剂。
实施例5建立动物模型
1、建立糖尿病模型
取健康雌雄性Wistar大鼠30只。随机分为对照组(n＝5)和实验组(n＝25)。高糖高脂饮食喂养4周后，禁食15天时(不禁水)，称量体重，实验组按50mg/kg腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素(STZ)；对照组给予腹腔注射实验组同等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。5天后测晨起空腹血糖(fastingplasmaglucose，FPG)，以14.0mmol/1为成模标准。并以第一次注射为起点，分别于第5、7、10、15和25天测量晨起空腹血糖。血糖不达标者根据血糖水平再次注射链脲佐菌素(25mg/kg或20mg/kg)。
2、糖尿病足模型的建立
1)糖尿病成模大鼠，连同对照组大鼠，10％水合氯醛以0.03ml/kg腹腔麻醉。
2)左侧腹股沟韧带处行一纵行切口，分离肉膜层及肌层。在手术放大镜下暴露股动脉、静脉及其分支，结扎并离断。
3)逐层缝合皮下组织及皮肤，观察大鼠各项生命体征平稳后放回鼠笼。术后所有大鼠给予青霉素3万单位/天，持续3天以预防感染。
3、糖尿病及糖尿病足模型指标测定
1)血糖以第一次注射STZ为起点，于注射后第5天、第7天、第14天和第28天剪尾法测量晨起空腹血糖。
2)体重、饮水量、尿量，体重量为单个样本体重的测定，饮水量为各饮水瓶总体饮水量，尿量为肉眼观察粗测。
3)肉眼观察糖尿病足溃疡或坏疽分别观察实验组及对照组的缺血下肢一般活动情况、皮肤颜色、溃疡或者坏疽出现时间及其累计部位。
4、结果
1)血糖水平：25只大鼠注射STZ 5天后，血糖均有不同程度升高，22只FPG>I6mmol/l，并有多饮、多尿、多食、消瘦等症状。对照组血糖STZ注射前为4.73土0.52mmol/1，注射5天后为4.7士0.60mmol/1，无明显差异；实验组血糖于注射STZ 5天后由4.72+0.64mmol/1明显升高至18.57+5.03mmol/1，与注射前及对照组同一时点比较差异明显(P<0.05)
2)体重：对照组大鼠体重量由注射前209.2+16.07增多到215.2+15.13，无明显差异。实验组大鼠体重量由注射前209.24+20.03至注射7天后下降至158.12+11.75，与本组注射前及对照组同一时点大鼠体重量比较差异明显(P<0.05)。
3)行股动脉结扎术后，大鼠进食量明显减少，左后肢活动受限。5天后，精神状况有所改善，缺血后肢活动力明显下降。用眼科剪分别在结扎动脉的下方皮肤制造约16cm2的创面，糖尿病足模型建立完成
实施例6动物试验
以实施例5建立的动物模型为试验对象，选取22只模型中的20只大鼠为试验对象，10只为对照组，10只为试验组，试验组大鼠使用实施例2制备的干细胞制剂进行注射，空白对照组使用等量的生理盐水进行注射。在无菌条件下，消毒好创面周围的皮肤，围绕创面皮下均匀点状肌注干细胞制剂3mL或生理盐水3mL，1h内完成肌注；连续定时观察10天创面愈合情况，做好创面的记录。
试验结果如表1所示，试验组大鼠的创面平均面积在治疗的10天不断缩小，有痊愈的趋势。空白对照组大鼠的创面平均面积不仅没有缩小，反而溃烂面积在不断增大。说明实施例2制备的干细胞制剂对治疗糖尿病足有良好的疗效。用实施例3和实施例4制备的干细胞制剂重复上述试验，得到相似的结论。
表1各组大鼠创面平均面积
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。