神经兴奋性损伤相关多肽在预防、缓解或治疗疼痛的用途的制作方法

发明领域

本申请大体上涉及医学领域，具体而言，本申请提供了神经兴奋损伤相关多肽在预防、缓解或治疗疼痛中的应用。

发明背景

疼痛是人们一生中经常遇到的不愉快的感觉。它提供躯体受到威胁的警报信号，是生命不可缺少的一种特殊保护功能。另一方面，它又是各种疾病最常见的症状，也是当今困扰人类健康最严重的问题之一。疼痛是机制非常复杂的神经活动。疼痛研究已经成为当前神经科学研究的重要课题之一。

现有的研究表明，n-甲基-d-天冬氨酸(n-methy-d-spartate，nmda)受体的nr2b亚基参与脊髓神经元的兴奋性突触传递、中枢敏化以及慢性痛等生理病理过程。背根神经节(dorsalrootganglion，drg)的神经元有外周突和中枢突，外周突末梢直接接受伤害性刺激，通过aδ纤维和c纤维传递至脊髓背角浅层的中枢突末梢，释放神经递质，如谷氨酸、天冬氨酸、sp和cgrp等，谷氨酸再结合到nmda受体和ampa受体。由于mg²⁺阻断了nmda受体离子通道，只有ampa受体被激活，ampa受体持续激活na⁺流入细胞，导致膜的去极化，消除了mg²⁺对通道的阻断，增加ca²⁺通透性，大量进入细胞的ca²⁺激活了pkc，pkc磷酸化nmda受体，改变不同nmda受体亚型的表达比例，同时使nmda受体的沉默突触转化为有功能的突触。nmda相关的nos受ca²⁺浓度影响，nos在psd-95和psd-93的pdz位点发生酶促反应，生成no并激活鸟甘酸环化酶，合成鸟甘酸，增强psd钙调蛋白依赖性磷酸化，调节突触递质的释放，改变神经元的兴奋性。这种反馈放大效应将伤害性信息进一步向中枢传递，引起痛觉敏感和放大疼痛信号。

在上述过程中，我们可以看出ca²⁺浓度以及nr2b和psd-95相互作用是放大疼痛信号的关键条件，因此限制这其中一个条件均可能弱化疼痛信号。故而，psd95的抑制剂的研发对于疼痛的治疗具有重要意义。

发明概述

第一方面，本申请提供了含有氨基酸序列yeklldtei(seqidno:1)或其功能性变体的肽或者包含所述肽的药物组合物在制备预防、缓解或治疗个体的疼痛的药物中的用途。

第二方面，本申请提供了预防、缓解或治疗疼痛的方法，所述方法包括：向有需要的个体给予含有氨基酸序列yeklldtei或其功能性变体的肽或者包含所述肽的药物组合物。

在第一方面所述的用途或第二方面所述的方法的一些实施方案中，功能性变体为yeklldtei中的ldtei部分发生一处或多处保守型取代后产生的变体。

在一些实施方案中，保守型取代选自d和e之间的取代，l、v和i之间的取代以及t和s之间的取代。

在一些实施方案中，功能性变体为yeklldtei中的ldtei部分被替换为下述任一序列后产生的变体：ldtel、ldtev、ldtdi、ldtdl、ldtdv、ldsei、ldsel、ldsev、ldsdi、ldsdl、ldsdv、letei、letel、letev、letdi、letdl、letdv、vdtei、vdtel、vdtev、vdtdi、vdtdl、vdtdv、idtei、idtel、idtev、idtdi、idtdl、idtdv、ietei、ietel、ietev、ietdi、ietdl、ietdv。

在第一方面所述的用途或第二方面所述的方法的一些实施方案中，所述肽为包含氨基酸序列yeklldtei或其功能性变体以及内化肽的嵌合肽。

在一些实施方案中，内化肽包含氨基酸序列ygrkkrrqrrr(seqidno:2)。

在一些实施方案中，嵌合肽包含氨基酸序列ygrkkrrqrrryeklldtei(seqidno:3)。

在第一方面所述的用途或第二方面所述的方法的一些实施方案中，疼痛为伤害感受性疼痛。

在一些实施方案中，疼痛为由外部应激或刺激导致的疼痛。

在一些实施方案中，外部应激或刺激为热刺激或触碰。

在一些实施方案中，伤害感受性疼痛为躯体疼痛和/或内脏疼痛。

在一些实施方案中，躯体疼痛包括灼伤、切伤、挫伤、肩周痛、肢体疼痛、腰痛、关节炎、肌腱炎、筋膜炎。

在一些实施方案中，内脏疼痛包括胃痛、阑尾炎、胰腺炎、消化性溃疡。

在一些实施方案中，前述的用途和方法中所述的个体为无神经损伤的个体。

在一些实施方案中，所述个体为健康个体。

附图简要说明

图1显示了pull-down实验检测p5与pdz1/2结构域的相互作用。m代表dna分子量标识；泳道1为his+pdz1/2+p5；泳道2为单独的p5；泳道3为his+p5；泳道4为his+pdz1/2。泳道1所示的洗脱条带包含p5与pdz1/2两者，证实p5能够结合pdz1/2结构域。

图2为在热板实验中利用p5多肽、阴性对照(生理盐水)、阳性对照(布洛芬)处理大鼠获得的结果图。

图3为在针刺实验中利用p5多肽、阴性对照(生理盐水)、阳性对照(布洛芬)处理大鼠获得的结果图。

发明详述

本申请的发明人通过对疼痛机制的研究，拟定了疼痛治疗的多个靶点，并通过实验对可预防、缓解或治疗疼痛的肽进行了设计和筛选，最终筛选得到了具有理想性质的肽。本申请得到的肽具有高效、低毒的优势。

除非另外指明，本申请中所有的术语均具有本领域技术人员通常所理解的含义。

术语“嵌合肽”表示具有两个天然不彼此结合的组件肽的肽，所述两个组件肽可以作为融合蛋白或通过化学键彼此结合。

术语“功能性变体”是指与母体具有相同或相近的生物学功能和性质的变体。作为非限制性的实例，“功能性变体”可以通过在母体中进行一处或多处保守型取代获得。

术语“pdz结构域”是指约90个氨基酸的模块蛋白质结构域，其特征是对脑突触蛋白psd-95、果蝇(drosophila)分隔连接蛋白discs-large(dlg)和上皮紧密连接蛋白z01(z01)具有显著(例如至少60％)的序列同一性。pdz结构域也称作discs-large同源性重复(“dhrs”)和glgf重复。pdz结构域通常显示保留核心共有序列(doyle,d.a.,1996,cell85：1067-76)。示例性的含pdz结构域的蛋白质和pdz结构域序列在美国申请no.10/714,537中公开。

术语“特异性结合”是指两个分子(例如配体和受体)之间的结合，其特征是甚至在存在许多其他不同分子时，一种分子(配体)与另一种特异分子(受体)结合的能力，即在分子的异质混合物中显示一种分子对另一分子的优先结合的能力。配体与受体的特异性结合也如下被证明：存在过量未标记的配体时，经可检测标记的配体与受体的结合降低(即结合竞争实验)。

第一方面，本申请提供了含有氨基酸序列yeklldtei(seqidno:1)或其功能性变体的肽或者包含所述肽的药物组合物在制备预防、缓解或治疗疼痛的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述的功能性变体为yeklldtei中的ldtei部分发生一处或多处保守型取代后产生的变体。

在一些实施方案中，保守型取代选自d和e之间的取代，l、v和i之间的取代以及t和s之间的取代。

在更具体的一些实施方案中，功能性变体为seqidno:1中的ldtei部分被替换为下述任一序列后产生的变体：ldtel、ldtev、ldtdi、ldtdl、ldtdv、ldsei、ldsel、ldsev、ldsdi、ldsdl、ldsdv、letei、letel、letev、letdi、letdl、letdv、vdtei、vdtel、vdtev、vdtdi、vdtdl、vdtdv、idtei、idtel、idtev、idtdi、idtdl、idtdv、ietei、ietel、ietev、ietdi、ietdl、ietdv。

在一些实施方案中，本文所公开的功能性变体还包括与以上提到的肽具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、甚至更高的同一性的氨基酸序列。本领域已知，两种蛋白之间的“同一性”通过将一种蛋白的氨基酸序列和它的保守氨基酸取代的第二种蛋白的序列进行比对来确定。使用本领域技术人员公知的计算机算法和方法确定两种蛋白之间的同一性程度。两个氨基酸序列之间的同一性优选地通过利用blastp算法确定。

在一些实施方案中，本文所公开的功能性变体包括与以上提到的肽相比，具有1、2、3、4、5或更多处的氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或插入而区别于上述公开的具体的肽。

如上所述，功能性变体可以通过一个或多个取代、缺失、添加和/或插入区别于上述公开的具体的肽。这些变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个本文公开的上述肽序列并按照本文所述用本领域内公知的多种技术中的任何一种评估其生物活性。

在一些实施方案中，所述含有氨基酸序列yeklldtei(seqidno:1)或其功能性变体的肽为包含氨基酸序列yeklldtei或其功能性变体以及内化肽的嵌合肽。

内化肽为也可称为穿膜肽，在蛋白质药物领域被广泛使用，其功能是促进与其结合的活性肽被细胞摄取和吸收。作为非限制性的一个实例，内化肽可以为tat肽，其中tat肽的一个非限制性实例为ygrkkrrqrrr(seqidno:2)。

在一些实施方案中，所述内化肽包含氨基酸序列ygrkkrrqrrr(seqidno:2)

在一些实施方案中，所述嵌合肽包含氨基酸序列ygrkkrrqrrryeklldtei(seqidno:3)。

本领域技术人员应当理解，前文所述的肽能够任选地被衍生化(例如乙酰化、磷酸化和/或糖基化)以促进与靶标的亲和力，促进其跨越细胞膜被转运的能力，或者促进稳定性。

疼痛是与实际或潜在的组织损伤相联系的一种不愉快的感觉或情感体验。根据疼痛发生的病理生理学，可将疼痛分为伤害感受性疼痛、非伤害感受性疼痛和总痛，其中伤害感受性疼痛包括躯体疼痛和内脏疼痛，非伤害感受性疼痛包括神经源性痛、中枢性疼痛、周围性疼痛和心理性疼痛。

在一些实施方案中，本申请中所预防、缓解或治疗的疼痛为伤害感受性疼痛。伤害感受性疼痛是由伤害性刺激激活和致敏伤害性感受器如aδ和c类神经纤维引起的一种生理反应，其是对组织损伤产生的一种病理生理过程，组织损伤产生的各种介质如h⁺、前列腺素、缓激肽、5-羟色胺、腺苷等刺激感觉神经末梢，使各种神经末梢感受器敏化，导致沿着神经纤维传导各种痛信号，引起痛感觉。

在一些实施方案中，本申请中所预防、缓解或治疗的疼痛为由外部应激或刺激导致的疼痛。在一些实施方案中，所述外部应激或刺激为热刺激或触碰。

在一些实施方案中，本申请所预防、缓解或治疗的伤害感受性疼痛为躯体疼痛。躯体疼痛是由体表(皮肤组织)或深部组织(骨骼肌肉组织)的痛觉感受器受到各种伤害性刺激所引起的，前者又称为浅表躯体痛，后者称为深部躯体痛。

在一些实施方案中，躯体疼痛包括但不限于：灼伤、切伤、挫伤、肩周痛、肢体疼痛、腰痛、关节炎、肌腱炎、筋膜炎。

在一些实施方案中，本申请所预防、缓解或治疗的伤害感受性疼痛为内脏疼痛。内脏疼痛是由于渗透、压迫、牵拉或者扭转胸、腹、盆腔脏器等导致这些部位的痛觉感受器活化而引起的疼痛，其通常不易定位。

在一些实施方案中，内脏疼痛包括但不限于：胃痛、阑尾炎、胰腺炎、消化性溃疡。

在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列yeklldtei或其功能性变体的药物组合物可以通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包封、捕获或者冻干方法制造。

在一些实施方案中，可以使用一种或多种生理学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅料，以常规方式配制药物组合物。

在一些实施方案中，可以将肽或药物组合物配制进水溶液中，优选地配制进生理学兼容的缓冲液例如hank’s溶液、ringer’s溶液，或生理盐水或乙酸缓冲液中(以减轻注射位点处的不适)。溶液可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

在一些实施方案中，本申请的肽或药物组合物可以为在使用前用合适的运载体(例如无菌无热源水)构建的粉末形式。

在一些实施方案中，可在配制物中使用适合要穿透的屏障的穿透剂。

在一些实施方案中，可以将本申请的肽与可药用的载体一起配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆体、悬浮液等。对于固体配制物例如粉末、胶囊和片剂而言，合适的赋形剂包括填充剂例如糖，如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚维酮(pvp)；制粒剂和粘合剂。如果需要，可以添加崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。如果需要，可以使用标准技术对固体剂型进行糖包裹或肠溶衣包裹。对于液体制剂例如悬浮液、酏剂和溶液而言，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、甘油、油、醇。另外，可以添加调味剂、防腐剂、着色剂等。

除了先前所述的配制物以外，也可以将本申请的肽配制成储存制剂。因此，例如可将化合物与合适的多聚体材料或疏水材料(例如配制为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制在一起，或配制为略溶的衍生物，例如配制为略溶的盐。

在一些实施方案中，前述所述的个体为无神经损伤的个体。在一些实施方案中，所述个体为健康个体。

第二方面，本申请提供了预防、缓解或治疗疼痛的方法，所述方法包括：向有需要的个体给予含有氨基酸序列yeklldtei或其功能性变体的肽或者包含所述肽的药物组合物。

在一些实施方案中，所述的功能性变体为yeklldtei中的ldtei部分发生一处或多处保守型取代后产生的变体。在一些实施方案中，保守型取代选自d和e之间的取代，l、v和i之间的取代以及t和s之间的取代。在更具体的一些实施方案中，功能性变体为seqidno:1中的ldtei部分被替换为下述任一序列后产生的变体：ldtel、ldtev、ldtdi、ldtdl、ldtdv、ldsei、ldsel、ldsev、ldsdi、ldsdl、ldsdv、letei、letel、letev、letdi、letdl、letdv、vdtei、vdtel、vdtev、vdtdi、vdtdl、vdtdv、idtei、idtel、idtev、idtdi、idtdl、idtdv、ietei、ietel、ietev、ietdi、ietdl、ietdv。

在一些实施方案中，本文所公开的功能性变体还包括与以上提到的肽具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、甚至更高的同一性的氨基酸序列。本领域已知，两种蛋白之间的“同一性”通过将一种蛋白的氨基酸序列和它的保守氨基酸取代的第二种蛋白的序列进行比对来确定。使用本领域技术人员公知的计算机算法和方法确定两种蛋白之间的同一性程度。两个氨基酸序列之间的同一性优选地通过利用blastp算法确定。

在一些实施方案中，本文所公开的功能性变体包括与以上提到的肽相比，具有1、2、3、4、5或更多处的氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或插入而区别于上述公开的具体的肽。

如上所述，功能性变体可以通过一个或多个取代、缺失、添加和/或插入区别于上述公开的具体的肽。这些变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个本文公开的上述肽序列并按照本文所述用本领域内公知的多种技术中的任何一种评估其生物活性。

在一些实施方案中，所述含有氨基酸序列yeklldtei(seqidno:1)或其功能性变体的肽为包含氨基酸序列yeklldtei或其功能性变体以及内化肽的嵌合肽。

内化肽为也可称为穿膜肽，在蛋白质药物领域被广泛使用，其功能是促进与其结合的活性肽被细胞摄取和吸收。作为非限制性的一个实例，内化肽可以为tat肽，其中tat肽的一个非限制性实例为ygrkkrrqrrr(seqidno:2)。

在一些实施方案中，所述内化肽包含氨基酸序列ygrkkrrqrrr(seqidno:2)

在一些实施方案中，所述嵌合肽包含氨基酸序列ygrkkrrqrrryeklldtei(seqidno:3)。

本领域技术人员应当理解，前文所述的肽能够任选地被衍生化(例如乙酰化、磷酸化和/或糖基化)以促进与靶标的亲和力，促进其跨越细胞膜被转运的能力，或者促进稳定性。

在一些实施方案中，所述疼痛为伤害感受性疼痛。

在一些实施方案中，所述疼痛为由热刺激或触碰导致的疼痛。

在一些实施方案中，所述疼痛为热痛或刺痛。

在一些实施方案中，预防、缓解或治疗的伤害感受性疼痛为躯体疼痛。在一些实施方案中，躯体疼痛包括但不限于：灼伤、切伤、挫伤、肩周痛、肢体疼痛、腰痛、关节炎、肌腱炎、筋膜炎。

在一些实施方案中，预防、缓解或治疗的伤害感受性疼痛为内脏疼痛。在一些实施方案中，内脏疼痛包括但不限于：胃痛、阑尾炎、胰腺炎、消化性溃疡。

在一些实施方案中，含有氨基酸序列yeklldtei或其功能性变体的肽或者包含所述肽的药物组合物的施用方式可以是肠胃外、静脉内、经口、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌内施用，优选静脉内施用。

在一些实施方案中，用于肠胃外施用的本申请的药物组合物优选地是无菌和基本等渗的。对注射而言，可以将肽或药物组合物配制进水溶液中，优选地配制进生理学兼容的缓冲液例如hank’s溶液、ringer’s溶液，或生理盐水或乙酸缓冲液中(以减轻注射位点处的不适)。溶液可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

或者，本申请的肽或药物组合物可以为在使用前用合适的运载体(例如无菌无热源水)构建的粉末形式。

对跨粘膜施用而言，在配制物中使用适合要穿透的屏障的穿透剂。该施用途径可被用于将化合物递送至鼻腔或用于舌下施用。

在一些实施方案中，对经口施用而言，可以将本申请的肽与可药用的载体一起配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆体、悬浮液等，用于由被治疗的患者经口摄入。对于口服固体配制物例如粉末、胶囊和片剂而言，合适的赋形剂包括填充剂例如糖，如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚维酮(pvp)；制粒剂和粘合剂。如果需要，可以添加崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。如果需要，可以使用标准技术对固体剂型进行糖包裹或肠溶衣包裹。对于口服液体制剂例如悬浮液、酏剂和溶液而言，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、甘油、油、醇。另外，可以添加调味剂、防腐剂、着色剂等。

除了先前所述的配制物以外，也可以将本申请的肽配制成储存制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用这类长效配制物。因此，例如可将化合物与合适的多聚体材料或疏水材料(例如配制为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制在一起，或配制为略溶的衍生物，例如配制为略溶的盐。

或者，可以使用其他药物递送系统。可使用脂质体和乳剂递送嵌合肽。也可以使用某些有机溶剂例如二甲基亚砜。另外，可以使用持续释放的系统(例如含有治疗剂的固体聚合物的半渗透性基质)递送化合物。

本申请的肽或药物组合物以有效达到预期目的(例如预防、缓解或治疗伤害感受性疼痛)的治疗有效量施用。治疗有效量表示：相对于未用本文公开的肽或药物组合物治疗的个体(或动物模型)的对照群体中疼痛而言，在用本文公开的肽或药物组合物治疗的个体(或动物模型)中，足以显著预防、缓解或治疗疼痛的肽或药物组合物的量。

在一些实施方案中，所述肽的施用剂量范围为0.1微克～10微克/kg，例如0.1微克/kg、0.2微克/kg、0.3微克/kg、0.4微克/kg、0.5微克/kg、0.6微克/kg、0.7微克/kg、0.8微克/kg、0.9微克/kg、1微克/kg、2微克/kg、3微克/kg、4微克/kg、5微克/kg、6微克/kg、7微克/kg、8微克/kg、9微克/kg、10微克/kg。在一些实施方案中，优选剂量为0.2微克/kg。

在一些实施方案中，施用的本申请的肽或药物组合物的量取决于被治疗的受试者、受试者的体重、痛苦的严重性、施用方式和开处方的医师的调节。

在一些实施方案中，本申请的肽或药物组合物的治疗上有效的剂量能够提供治疗益处而不引起重大的毒性。可以通过标准药物步骤在细胞培养物或实验动物中测定毒性，例如通过测定ld50(使50％群体致死的剂量)或ld100(使100％群体致死的剂量)来实现。毒性效应和治疗效应的剂量比例是治疗指数。实验证实本申请的肽在200mg/kg的剂量下无明显毒性。

在一些实施方案中，本申请的肽或组合物的药效可持续至少两小时。

在一些实施方案中，前述所述的个体为无神经损伤的个体。

在一些实施方案中，所述个体为健康个体。

应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。

实施例

提供以下实施例仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。

实施例1：活性肽分子的筛选

根据已报道的研究结果，选取tat穿膜肽ygrkkrrqrrr，并将其与不同数目的氨基酸相连接，形成肽库。将肽库中的肽分子，分别与体外表达并纯化的pdz1/2结构域相互作用，根据相互作用力的强弱，对多肽进行初步筛选。

固定的分子(配体)为pdz1/2蛋白，分子量：～20kd，浓度：2mg/ml；流动相的分子(分析物)：待筛选多肽，分子量：～2kd，浓度：10mg/ml。使用biacore3000仪器，cm5芯片进行固定。电泳缓冲液为pbs+0.005％吐温20。使用氨基偶联方法进行固定。配体的浓度为10μg/ml。固定缓冲液为10mm醋酸钠，ph4.0。固定量：1400ru，固定至流动细胞2。使用的流速为10μl/ml，配体进样1分钟。使用ph2.0+2.5的10mmgly作为再生液，以30μl/分钟的流速进行再生。进样时间为30s。

使用下述条件进行动力学分析：对照通道：流动细胞1；电泳缓冲液为pbs；使用kineticanalysiswizard模式，浓度梯度为6.25nm、12.5nm、25nm、50nm、100nm、200nm、400nm；进样时间为1分钟；解离时间为2min；流速为30μl/分钟。

用拟和软件biaevaluation4.1软件对数据进行拟合。拟和模型为1：1结合模型。解离常数kd值与作用力呈反比。

通过筛选，获得了与pdz1/2结构域具有较强相互作用能力的嵌合肽，将其命名为p5，序列如下：

p5:ygrkkrrqrrryeklldtei

以下实验中对嵌合肽p5进行进一步地测试。

实施例2：pull-down实验检测p5与pdz1/2结构域的相互作用

为证明p5能与pdz1/2结构域相互作用，进行pull-down实验。

用100μl的his珠子和1ml的mcac-0缓冲液将柱子平衡5min。在4℃震荡。将混合物在4℃，以5000g离心1分钟，弃上清。向混合物中加入1mgpdz1/2蛋白，并用缓冲液补齐至1ml。在4℃，将所述混合物旋转结合1小时。将所述混合物在4℃，以5000g离心1分钟，弃上清。用1ml的mcac-0缓冲液清洗3次，每次5分钟(在4℃，震荡洗涤)。向混合物中加入1mgp5蛋白，并用缓冲液补齐至1ml。在4℃，将所述混合物旋转结合2小时。将所述混合物在4℃，以5000g离心1分钟，弃上清。用1ml裂解液进行清洗3次，每次5分钟(在4℃，震荡洗涤)。清洗之后加入20μlmcac-300。离心，取洗脱液进行sds-page检测。实验结果显示于图1。

如图1所证实，多肽p5的洗脱条带中同时包含p5和pdz1/2结构域两者，由此证实多肽p5能够结合pdz1/2结构域。

实施例3：p5多肽的热板镇痛效果检测

实验步骤

动物筛选

选取18只240～260克雄性sd大鼠(购自化阜康成有限公司)作为实验鼠，分成3组，每组6只：0.2μg/kg剂量p5多肽给药组一组、生理盐水组一组、阳性药对照组一组(布洛芬，50mg/kg)应用于热板实验。实验前筛选：热板实验造模前，将备选大鼠置于55℃热板上，凡在30秒钟内不舐后足或者抬足的大鼠，不在实验中使用。

动物模型建立

4.0铬制肠线(购自山东博达医疗用品有限公司)需用生理盐水(购自石家庄四药有限公司，国药准字h13023200)提前浸泡30分钟软化。大鼠大腿中部剃毛，碘酒擦拭，剪刀剪开表皮伤口1cm以下，再用j31060止血钳撕开股二头肌，可见坐骨神经暴露在大腿中部。近腿端是坐骨神经的三叉，选择坐骨神经大腿骨中部，使用4.0铬制肠线宽松地结扎四次，力度以结扎位置附近出现肌肉轻微颤抖为宜，相邻结扎位置1mm间距，随后再分别缝合肌肉和表皮组织。

给药

实验前对手术成功的实验组大鼠一次性尾静脉注射p5多肽生理盐水溶液(剂量为0.2μg/kg)，ns组大鼠腹腔注射生理盐水0.3ml，阳性药组灌胃给药布洛芬悬浊液(购自上海强生制药有限公司，国药准字h19991011)，剂量为50mg/kg。

热板实验

大鼠术后7天后开展热板实验。大鼠适应性喂养，室内环境保持在25℃左右，将yls-6b智能热板仪(购自北京众实迪创科技发展有限责任公司)的温度设置在55℃左右。将大鼠放置在有密闭可拆卸的透明有机玻璃缸内的热板仪上记录其出现舔后足或跳跃反应的时间。如果给药后放入瓷罐内20秒钟仍无反应，即将sd大鼠取出，以免时间太长把脚烫伤，其痛阈可按20秒计算。每只鼠连续测试2次，每次测试至少间隔30秒，取其平均值。

实验完毕，记录生理盐水对照组和各给药组的给药前和给药后10min、70min、130min的大鼠热痛反应时间(即痛阈值，单位为s)。

实验结果

使用excel自带的t-test函数(双尾等方差)分析实验大鼠造模前后热痛抬足阈值统计学差异以评价造模成功与否，然后再分析给药前、给药后各个时间点的热痛阈值的差异，评价药效。p<0.05认为有统计学差异，p<0.01则认为有显著统计学差异。

实验结果如下表1以及图2所示。

表1p5多肽治疗大鼠热痛阈值的统计结果

结果表明，使用0.2μg/kg剂量的治疗组大鼠，造模前和手术侧抬足阈值时间p＝0.0002，存在显著统计学差异，说明造模成功。0.2μg/kg剂量给药前和给药后10min，p＝0.013，存在统计学差异；p5给药10min与生理盐水给药10min，p＝0.028也存在统计学差异，说明p5给药短时间内即能产生镇痛效果。此外，0.2μg/kg剂量p5给药前和给药后130min，p＝0.047，存在统计学差异；给药后10min与给药后130min，p＝0.697，无统计学差异，说明给药后10分钟到给药后130min内镇痛效果无统计学变化，即p5多肽的治疗效果至少可以持续130min。

阳性药对照组的结果显示，50mg/kg剂量的布洛芬治疗组大鼠，健康侧和手术侧抬足阈值p<0.01，存在统计学差异，说明造模成功。给药前和给药后10min，p＝0.03，存在统计学差异，说明布洛芬给药短时间内即能产生镇痛效果。但是，布洛芬给药130min后与给药前手术侧抬足阈值p>0.05，无统计学差异，说明其镇痛效果不能维持130分钟。

实施例4：p5多肽的刺痛镇痛效果检测

实验步骤

大鼠筛选

选取18只240～260克雄性sd大鼠(购自化阜康成有限公司)作为实验鼠，分成3组，每组6只：0.2μg/kg剂量多肽给药组一组、生理盐水组一组、阳性药对照组(布洛芬，50mg/kg)一组应用于针刺实验。

造模

4.0铬制肠线(购自山东博达医疗用品有限公司)需用生理盐水(购自石家庄四药有限公司，国药准字h13023200)提前浸泡30分钟软化。大鼠大腿中部剃毛，碘酒擦拭，剪刀剪开表皮伤口1cm以下，再用j31060止血钳撕开股二头肌，可见坐骨神经暴露在大腿中部。近腿端是坐骨神经的三叉，选择坐骨神经大腿骨中部，使用4.0铬制肠线宽松地结扎四次，力度以结扎位置附近出现肌肉轻微颤抖为宜，相邻结扎位置1mm间距，随后再分别缝合肌肉和表皮组织。

给药

实验前对手术成功的实验组大鼠一次性尾静脉注射p5多肽生理盐水溶液(剂量为0.2μg/kg)，ns组大鼠腹腔注射生理盐水0.3ml，阳性药组灌胃给药布洛芬悬浊液(购自上海强生制药有限公司，国药准字h19991011)，剂量为50mg/kg。

针刺实验

大鼠术后14天后，给药组在给药前和给药后10min\70min\130min开展实验。将实验大鼠放置在有机玻璃观察格中，大鼠适应环境5分钟，待大鼠不再四处张望。将zs-cty足底刺痛系统(购自北京众实迪创科技发展有限责任公司)与一台win732位的计算机连接，打开测试软件，对仪器零点校正，再挂上10g砝码后再校正一次，然后使用vonfrey探针缓慢地轻柔地刺激大鼠待测后肢足底中部，观察大鼠的缩足反应，大鼠若由于刺激而出现快速的缩足反应，则标记为阳性反应，若由于身体活动引起大鼠的缩足反应则不算在内。每个时间点记录两次，取平均值作为刺痛抬足阈值(单位为g)，足底刺痛系统(厂家：北京众实迪创科技发展有限公司；出厂编号：20160101060001)10g砝码调零后，触碰大鼠足底仍然存在基础读数波动，波动一般为+3～+5g之间，最终数值需减去该值。若仍然有基线则除去。

实验结果

使用excel自带的t-test函数(双尾异方差)分析实验大鼠未处理侧和手术侧针刺抬足阈值的统计学差异，以评价造模的成功与否，然后再分析给药前后、给药后各个时间点的刺痛阈值的差异评价药效和药效持续时间。p<0.05认为有统计学差异，p<0.01则认为有显著统计学差异。

实验结果如下表2以及图3所示。

表2p5多肽治疗大鼠刺痛阈值的统计结果

结果表明，0.2μg/kg剂量的治疗组大鼠，健康侧和手术侧针刺抬足阈值p＝0.0004，存在统计学差异，说明造模成功。0.2μg/kg剂量的治疗组大鼠，给药前和给药后10min，大鼠手术侧针刺抬足阈值p＝0.03，存在统计学差异；p5给药10min与生理盐水给药10min，大鼠手术侧针刺抬足阈值p＝0.03，存在统计学差异，说明p5给药短时间内即能产生镇痛效果。此外，0.2μg/kg剂量的治疗组大鼠p5给药前和给药后130min，大鼠手术侧针刺抬足阈值p＝0.03，存在统计学差异；给药10min后与给药130min后，大鼠手术侧针刺抬足阈值p＝0.687，说明给药130min内针刺抬足时间无统计学变化，即p5多肽的治疗效果至少可以持续130min。

而阳性药对照组的结果显示，50mg/kg剂量的布洛芬治疗组大鼠，健康侧和手术侧针刺力度抬足阈值p<0.01，有统计学差异，说明造模成功。给药前和给药后10min，p＝0.069，统计学差异不明显，p5给药10min与生理盐水给药10min，p＝0.08，统计学差异也不明显。此外，布洛芬给药130min后与给药前，p>0.05，说明阳性药镇痛药效不能维持130分钟且p5多肽镇痛药效优于阳性药。

实施例5：急性毒性试验

用大鼠进行急性毒性试验。结果表明：在1000mg/kg体重的给药剂量下，p5对大鼠无致死作用和其它明显的毒副作用。

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