钆修饰硫化铋纳米诊疗剂的制备方法与流程

本发明涉及具有造影功能的纳米复合材料制备及应用领域，具体涉及一种新型MRI和CT双模式成像指导的钆修饰硫化铋纳米诊疗剂的制备方法。

背景技术：

目前，肿瘤的治疗方法有三大传统治疗方法：外科手术治疗，放射性治疗和化学药物治疗。然而，手术治疗无法彻底治愈那些已有肿瘤转移的晚期病人，而化疗和放疗给患者的二次伤害更比癌症本身带来的伤害更多。虽然三大癌症的传统治疗手段各有其优点，相互补充，从而在肿瘤治疗中发挥着举足轻重的作用，但是这三大传统治疗方法都存在一定的不足。因此，探索最新的并且毒副作用小的肿瘤治疗方法成为目前医学界肿瘤治疗亟待解决的问题。

光热治疗是通过利用纳米制剂在特定波长存在高的吸收特性，从而在特定波长的近红外激光照射下，将光能转化为热能，并使肿瘤癌细胞处于一个高温环境中，最终致使癌细胞凋亡，达到治疗恶性肿瘤的目的。光热疗法的优点包括:直接针对病变组织，微创性和非侵入性。光热治疗能引发细胞内蛋白结构变化和组织碳化等一系列生物学变化。治疗用的近红外激光只照射在病变组织，而对周围正常组织的影响很小。这种空间特异性和非侵入性治疗方式使光热治疗相比其它手术或者侵入性治疗方法，更成为一种广受欢迎的治疗方式。光热治疗是根据纳米材料本身高的吸收，不需要引入一些功能化的分子或者基团。在纳米制剂的设计上要求相对较低。所以，诸多纳米材料都可以被用于光热治疗。常用的光热制剂可以分为：有机化合物，包括聚吡咯、吲哚菁绿(ICG)和聚苯乙烯纳米颗粒等；金属纳米复合材料；碳基纳米材料，包括碳管、石墨烯、以及碳基复合纳米材料；硫族化合物，包括WS₂、MoS₂、CuS和CuSe等；金属纳米复合材料，包括各种形貌的金纳米材料(金纳米颗粒.金纳米棒、金纳米壳层、纳米笼和金星等)、锗纳米颗粒和钯纳米片等。然而这些材料都存在各自的缺点：碳基纳米材料在近红外区的吸收系数很低，光热转换效率不是很理想；有机化合物纳米材料存在严重的光漂白，而且光热转换效率不尽如人意；金属纳米材料由于种类繁多，形貌各异而受到广泛的关注和研究。但是，金属纳米材料制备成本大，也就限制其大规模的生产和进一步推广。一个最佳的纳米微粒的指导光热治疗诊疗剂的制备必须遵循以下几个原则：第一，高的X-射线消光能力；第二：低毒性；第三：成本低；第四：尺寸小，因为小尺寸的纳米材料相对于大尺寸的材料来说具有更强的X-射线消光效果。

CT成像全称电子计算机断层扫描成像，就是人们通常所说的X射线成像。CT成像以X射线的三维重构为基础。它的基本原理是不同组织有不同的X射线吸收能力，并且其X射线的组织透过剂量也会不同。利用测定不同部位组织X射线的透过剂量并利用数位几何处理重建出组织断层面三维影像。X射线对人体有电离辐射伤害而成为CT成像的主要缺点。除此，CT成像技术很难分辨密度相差不大的软组织，难以得到肿块、血管等软组织的清晰图像。

磁共振成像(MRI)是一种基于核磁共振原理的医学成像技术。核磁共振的原理是磁性原子核在外加磁场的作用下，吸收了一定频率的射频脉冲后，由低能态向高能态跃迁而产生的磁共振现象。MRI成像空间分辨率高，并且多参数成像和剖面成像不受组织影响等特点，使其成为临床诊断中主要的成像手段之一。然而，MRI成像的缺点是成像速度不够快，不能观察组织和器官的动态图像，也无法采集组织和器官的动态图像，并且无法对体内装有心脏起搏器或者其它金属物体的患者进行MRI成像检查。

目前，MRI诊断技术可以结合CT诊断技术以使得到人体组织的任意断面清晰图像。相应地，由于MRI诊断技术与CT诊断技术的结合，配合该结合诊断技术的新型CT/MRI双模式医学造影剂的研发即成为研究热点之一。然而，制备上述造影剂材料的结构性能由反应物及其所进行反应的机制决定，要以满足MRI、CT医学检测诊断需求为目的，采用简捷的方法，高效制备出具备相应功能的材料仍是这一领域亟待克服的难关。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种新型MRI和CT双模式成像指导的钆修饰硫化铋纳米诊疗剂的制备方法，该制备方法通过结合现有医学造影剂的研究背景，简化CT/MRI双模式造影剂制备方法，具有制备简单、可控性好、生产效率高、易于工业化生产等特点。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终以油酸、油胺、1-十八烯、新癸酸铋和硫代乙酰胺为原材料合成硫化铋，利用二乙三胺五乙酸双环酐和三氯化铋制备Gd-DTPA-OA配体，然后对硫化铋修饰Gd-DTPA-OA配体，从而得到钆修饰的硫化铋纳米材料(图1所示)。具体为：

一种新型MRI和CT双模式成像指导的钆修饰硫化铋纳米诊疗剂的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)制备硫化铋纳米材料：

a.量取油酸和十八碳烯于反应容器中，在剧烈搅拌的条件下，将新癸酸铋加至反应容器中，得混合物；

b.在N₂保护下，将混合物加热至160-170℃，保持15-30min后再冷却至103-107℃；

c.将含有硫代乙酰胺的油胺溶液在剧烈搅拌下注入上一步骤的混合物中，注入后溶液变成深褐色，反应持续4-7min；

d.冷却至室温后，加入乙醇溶液洗涤，获得硫化铋纳米材料,将所制备的硫化铋纳米材料按1.2-1.8mg/mL的浓度分散到二氯甲烷中，备用；

(2)制备Gd-DTPA-OA配体：

a.将二乙三胺五乙酸加入到68-72℃下含有DMF和油胺的溶液中，该温度下搅拌3-5h；

b.待溶液降至室温后，弃去上清液，加入乙醇后，抽滤，干燥洗涤得到二乙三胺五乙酸双环酐；

c.向去离子水中加入二乙三胺五乙酸双环酐和氢氧化钠溶液，超声混合0.5-1.5h，然后用盐酸调节pH为6-7，放置一夜，以二乙三胺五乙酸双环酐/GdCl₃·6H₂O的摩尔比为1.06的比例加入GdCl₃·6H₂O的水溶液中，调节pH为6-7，混合液继续搅拌8-16h；

(3)制备Bi₂S₃-Gd纳米材料：

取硫化铋二氯甲烷体系溶液，加水稀释8-12倍，然后超声助溶，以2500-3500r/min的转速离心4-8min后，取淡黄色上清液，加入至步骤(2)制备的溶液中超声震荡，得到钆修饰硫化铋纳米诊疗剂Bi₂S₃-Gd纳米材料。

在本发明最优选的实施例中，上述新型MRI和CT双模式成像指导的钆修饰硫化铋纳米诊疗剂的制备方法具体包括如下步骤：

(1)制备硫化铋纳米材料：

a.量取油酸13.33mL和十八碳烯26.67mL于容器中，在剧烈搅拌的条件下，将新癸酸铋2.096mL加至容器中；

b.在N₂保护下，将该混合物加热至165℃，保持20分钟后再冷却至105℃，得混合物；

c.将含有硫代乙酰胺0.25g的油胺溶液2.33mL在剧烈搅拌下注入上述混合物，注入后溶液变成深褐色，反应在该温度下持续5分钟，在整个反应过程中要在容器中通过溢流N₂保护；

d.冷却至室温后，加入乙醇溶液，洗涤两次后离心，获得纳米材料,将所制备的硫化铋纳米材料按1.2-1.8mg/mL的浓度分散到二氯甲烷中，备用；

(2)制备Gd-DTPA-OA配体：

a.将二乙三胺五乙酸0.5334g加入到70℃下含有DMF 15mL和油胺0.485mL的溶液中，该温度下搅拌4h；

b.待溶液降至室温后，弃去上清液，加入乙醇后，抽滤，干燥洗涤3次即可得到二乙三胺五乙酸双环酐；

c.向去离子水19mL中加入二乙三胺五乙酸双环酐0.0137g和0.1mol/L的NaOH0.83mL，超声混合1h，然后用HCl调节pH为6-7，放置一夜，以二乙三胺五乙酸双环酐/GdCl₃·6H₂O的摩尔比为1.06的比例加入25mmol/L的GdCl₃·6H₂O水溶液中0.650mL，调节pH为6-7，混合液继续搅拌12h；

(3)制备Bi2S3-Gd纳米材料：

取硫化铋二氯甲烷体系溶液，加水稀释8-12倍，然后超声助溶，以2500-3500r/min的转速离心4-8min后，取淡黄色上清液，加入至步骤(2)制备的溶液中超声震荡，得到钆修饰硫化铋纳米诊疗剂Bi₂S₃-Gd纳米材料。

与现有技术相比，本发明通过制备油酸、油胺保护的硫化铋纳米材料,然后合成两亲性的Gd-DTPA-OA配体；最后该配体与油相的硫化铋通过亲水疏水作用力结合在一起得到了钆修饰的硫化铋纳米材料,即通过在硫化铋纳米材料表面修饰钆螯合物，从而赋予该材料MRI和CT双模式成像指导的光热治疗效果，实现了MRI和CT双模式成像指导的光热治疗。具体的进步性和优点体现如下：

(1)硫化铋纳米材料是一种具有潜在应用价值的CT造影剂。铋元素的X-射线消光系数比碘的X-射线消光系数高，具有较低的毒性，在体内不会残留。

(2)硫化铋是一种半导体材料，在室温条件下它的禁带宽度为1.33eV。如此低的禁带宽度使得硫化铋在近红外区具有非常强的吸收。因此，硫化铋纳米材料可以作为一种有效的光热治疗试剂。

(3)将CT造影剂(Bi2S3)和T1造影剂(Gd-DTPA)结合到一起，将赋予该材料双模式成像指导的光热治疗效果，有效的弥补单一MRI和CT的缺陷，从而使成像信息更具准确性、精确性和可靠性，更有利于早期病变的诊断。

附图说明

图1：(a)硫化铋纳米材料的制备；(b)DTPA-OA的制备示意图；(c)钆修饰的硫化铋纳米材料制备示意图；

图2：(a)DTPA，(b)DTPAA，(c)DTPA-OA的FTIR图谱；

图3：Bi₂S₃-Gd纳米材料的粒径图；

图4：不同浓度的Bi₂S₃-Gd水溶液的紫外吸收光谱(各曲线代表的浓度按照图示箭头的方向依次下降)；

图5：不同浓度Bi₂S₃-Gd水溶液在808nm激光照射下的温度-时间图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的常规技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

(1)硫化铋纳米材料的制备：

①量取油酸(13.33mL)和十八碳烯(26.67mL)于烧瓶中，在剧烈搅拌的条件下，将新癸酸铋(2.096mL)加至烧瓶中；

②在N₂保护下，将该混合物加热至165℃，保持20分钟后再冷却至105℃；

③将含有硫代乙酰胺(0.25g)的油胺溶液(2.33mL)在剧烈搅拌下注入上述混合物。注射后溶液变成深褐色，反应在该温度下持续5分钟，在整个反应过程中要在烧瓶中通过溢流N2保护，以获得最好的结果；

④冷却至室温后，加入乙醇溶液，洗涤两次后离心，获得纳米材料,将所制备的硫化铋纳米材料(300mg)分散到200mL二氯甲烷中；

(2)二乙三胺五乙酸双环酐的制备：

①将二乙三胺五乙酸(0.5334g)加入到70℃下含有DMF(15mL)和油胺(0.485mL)的溶液中，该温度下搅拌4小时；

②待溶液降至室温后，弃去上清液，加入乙醇后，抽滤，干燥洗涤3次即可得到二乙三胺五乙酸双环酐；

(3)Gd-DTPA-OA配体的制备：

向去离子水(19mL)中加入二乙三胺五乙酸双环酐(0.0137g)和NaOH(0.1mol/L,0.83mL)。混合液超声1h，然后用HCl调节pH为6.91(6-7)。放置一晚后pH变为7.64。然后，以摩尔比为1.06的比例加入GdCl₃·6H₂O的水溶液中(25mmol/L,0.650mL)。调pH为6.47(6-7)。混合液继续搅拌12h；

(4)Bi₂S₃-Gd纳米材料的制备：

取硫化铋二氯甲烷体系溶液10mL，取0.1ml溶液，稀释至1ml，然后超声助溶，以3000r/min离心5min后，取上清液为淡黄色液体，将上清液加入至GdL溶液中超声震荡。

(5)材料的表征和性能测试：

①傅里叶变换红外光谱测试：分别取0.5mg的DTPA，DTPAA和DTPA-OA配体材料，压片放入Bruker Vertex 70光谱仪中检测红外图谱；

②动态光散射检测粒径:分别取2ml钆修饰的硫化铋纳米材料，在Nanosizer Nano-ZS马尔文公司纳米粒度分析仪上检测粒径；

③紫外吸收测试：取两份超纯水放入样品池对紫外分光光度计进行标定(紫外分光光度计的扫描波长范围为500nm-1000nm)。取出样品池用超纯水清洗后加入制备好的4种不同浓度的Bi₂S₃-Gd水溶液。在CARY 500紫外-可见-近红外光谱仪进行波长扫(不同样品用不同样品池)。

④光热转换性能测试:在规格为2W 808nm的激光光源的照射下，于固定时间内在室温下对不同浓度相同体积的Bi₂S₃-Gd水溶液进行温度测量。平均每10s对放入Bi₂S₃-Gd水溶液的热电耦温度计进行读数并记录，Bi₂S₃-Gd水溶液与超纯水的初始温度统一控制为26℃。

为了考察是否成功地制备了DTPA-OA配体，我们借助傅里叶变换红外光谱进行分析。如图2显示，对于DTPAA来说，在1820和1774cm^-1处可以观察到两个尖而强的峰。这来自于酸酐中C＝O的伸缩振动。作为对照，DTPA-OA配体的红外光谱，表现出了一系列的酰胺特征吸收峰。比如，位于3283cm^-1处的N–H伸缩振动峰；位于3070cm^-1处的N–H弯曲振动峰；位于1690cm^-1处的来自–CO–NH–基团的C＝O伸缩振动峰；以及C–N伸缩振动与N–H弯曲振动重叠而形成的位于1309cm^-1处的吸收峰。此外，由于–HC＝CH–基团而出现的位于1655cm^-l的C–H伸缩振动峰，以及位于2924cm^-1和2851cm^-1的两个来自于烷基链中CH₂的伸缩振动的强吸收峰，进一步证实了我们已经成功地得到了DTPA-OA配体。

接下来考察Bi₂S₃-Gd纳米材料的粒径大小，由图3可知，Bi₂S₃-Gd纳米材料，粒径大小均一，粒径大小为211nm左右，分散性好，而且粒径的大小很符合实验的需求。对Bi₂S₃修饰做了进一步的改进，选择DTPA-OA作为修饰配体，通过疏水-疏水相互作用包覆在Bi₂S₃纳米点表面。如图3所示，Bi₂S₃-Gd纳米材料没有明显的聚集现象，仍然保持良好的分散性。

然后，为了考察Bi₂S₃-Gd纳米材料的紫外吸收,我们用CARY 500紫外-可见-近红外光谱仪对不同浓度的Bi₂S₃-Gd水溶液进行紫外吸收，图4表明制备的Bi₂S₃-Gd水溶液在我们进行紫外扫描吸收波峰的数据中没有任何吸收波峰的出现。本实验中紫外吸收波峰扫描的波长范围为500nm-1000nm，在此范围内我们发现硫化铋纳米材料在近红外区具有很强的吸收，并且随着浓度的增加，在808nm处的紫外吸收值呈现线性增加的趋势。近红外区的吸收预示着它们可以应用于光热治疗。

为了探索Bi₂S₃-Gd纳米材料在光热治疗方面的可行性，我们考察了它们的光热转换性能。我们分别将62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml的Bi₂S₃-Gd纳米材料水溶液用808nm激光器照射，记录溶液的温度变化，结果显示在图5中。很明显，纯水溶液在激光照射下温度没有明显的变化。相反，当给予激光照射后，Bi₂S₃-Gd纳米材料水溶液的温度快速升高，并且随着Bi₂S₃-Gd纳米材料浓度的增加，溶液温度变化会更加明显。造成这种结果的原因是，随着浓度的增加，Bi₂S₃-Gd纳米材料在808nm处的光吸收值变强，从而导致其光热转换能力增强。通过光热转化实验，我们得出Bi₂S₃-Gd纳米材料具有良好的光热转换能力，并且浓度越高，光热转换能力越好。

综上，本发明采用已被临床应用的T1造影剂Gd-DTPA和具有潜在应用价值的CT造影剂硫化铋纳米材料，首先制备油酸、油胺保护的硫化铋纳米材料；接下来合成一种一端可以与钆螯合，另一端为长链烷基链的两亲性的配体；最后，该配体与油相的硫化铋通过亲水疏水作用力结合在一起得到了钆修饰的硫化铋纳米材料。实验结果证实，我们通过在硫化铋纳米材料表面修饰钆螯合物，从而赋予该材料MRI和CT双模式成像指导的光热治疗效果，这为发展多功能纳米诊疗剂提供了一个良好的平台。