本发明涉及的是一种药物制剂，尤其涉及一种用于治疗物理性皮肤病及动物性皮肤病的外用药物及其制备方法和应用。
背景技术：
物理性皮肤病是指由于各种物理性因素(机械磨擦、温度、湿度、光线、电磁辐射波、压力等)作用于皮肤，引起的不良反应。皮肤创伤是人们在日常生活中经常碰到的伤害，皮肤愈合过程慢，处理不当还会发生感染、溃烂而难以治愈。
夏季皮炎是夏天的多发病，因持续的高温、高湿度的外环境，加上皮肤出汗多没有及时清洗所致皮肤炎症。好发于中年偏胖的女性，其典型症状为发生于四肢伸侧，比较密集的红斑、丘疹或丘疹水疱，瘙痒明显，并伴有灼热感。由于奇痒难忍而搔抓，常出现多条条状抓痕、血痂，消退后会留下色素沉着。
痱子是夏天最多见的皮肤急性炎症。痱子是由汗孔堵塞引起的，多发生在颈、胸背、肘窝等部位，小孩可发生在头部前额等处。初起时皮肤发红，然后出现针头大小的红色丘疹或丘疱疹，密集成片，其中有些丘疹呈脓性。生了痱子后剧痒、疼痛，有时还会有一阵阵热辣的灼痛等表现。
褶烂别名擦烂红斑、间擦疹，该病主要是皮肤皱襞处由于皮肤面密切接触，局部湿热散发不畅，汗液潴留，导致浸渍，加之活动时皮肤面不断摩擦刺激而引起急性炎症。常继发细菌或白念珠菌感染。好发于皱褶部位，如腹股沟、腋下、乳房下等，皮疹为红斑、丘疹，部分呈水疱，继而糜烂、渗出，边界清楚，悬附着花边样的浸软发白的鳞屑。指间糜烂好发于第三、四指间，除有边缘清楚的湿润性红斑外，常有皲裂。
动物性皮肤病，比如蚊虫叮咬，是夏秋温暖潮湿季节常见病，叮咬后多在皮肤暴露部位和接触部位发生圆形或椭圆形的红色丘疹、丘疱疹或水肿性红斑，在皮疹中间可见“咬痕”和肿块，并伴有难忍的瘙痒感。抓挠后，可引发皮肤感染或炎症。
目前，在治疗物理性皮肤时，多采用避光药：维生素类、氯喹、反应停，抗组织胺药，激素，维甲酸类等。这些药物疗效不够理想，并且存在副作用影响健康。在治疗蚊虫叮咬皮肤病时，多使用清凉油、风油精、花露水等，因含酒精成分不适合于皮肤敏感者和婴幼儿，
所以有必要开发一种无毒副作用、疗效快速的药物，解决各类物理性皮肤病及动物性皮肤病问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种用于治疗物理性皮肤病及动物性皮肤病的外用药物及其制备方法，以解决现有药物疗效不够理想，存在副作用等技术问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种用于治疗物理性皮肤病及动物性皮肤病的外用药物，所述外用药物包括质量百分比为20％-100％的NK细胞原液。
进一步地，所述外用药物为一种液体制剂，命名为SNK液，所述SNK液的组分及其质量百分比包括：NK细胞原液80.0-90.0％、甘油3.0-5.0％、硼砂0.05-0.08％、透明质酸0.1-0.3％、对羟基苯甲酸乙酯0.01-0.03％，溶剂为水。
进一步地，所述外用药物为一种膏状制剂，命名为SNK膏，所述SNK膏的组分及其质量百分比包括：NK细胞原液70.0-80.0％、卡波姆941为0.1-1.5％、甘油1.0-2.0％、三乙醇胺1.0-3.0％、羟苯乙酯0.01-0.03％、透明质酸0.05-0.1％，余量为水。
本发明还提供了上述治疗物理性皮肤病及动物性皮肤病的外用药物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取NK细胞进行扩增培养，获得NK细胞原液；
(2)将NK细胞原液与外用药物辅料混合，制备获得所述外用药物。
进一步地，若所述药物为液体制剂时，所述NK细胞原液的质量百分比为80.0-90.0％，所述辅料及其质量百分比包括：甘油3.0-5.0％、硼砂0.05-0.08％、透明质酸0.1-0.3％、对羟基苯甲酸乙酯0.01-0.03％，溶剂为水；若所述药物为膏状制剂时，所述NK细胞原液的质量百分比为70.0-80.0％，所述辅料及其质量百分比包括：卡波姆941为0.1-1.5％、甘油1.0-2.0％、三乙醇胺1.0-3.0％、羟苯乙酯0.01-0.03％、透明质酸0.05-0.1％，余量为水。
进一步地，所述NK细胞扩增培养的方法，包括以下步骤：
步骤一：取新鲜血液，提取血液中的外周血单核细胞(以下简称PBMC)；
步骤二：在RPMI-1640基础培养基中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的庆大霉素和10％重量百分比的胎牛血清，获得NK细胞培养液；
步骤三：取3.0×107-4.0×107个PBMC于一细胞培养瓶中，加入20-30ml的NK细胞培养液和2ml的浓度为1.0×107个/ml的NK扩增试剂，获得起始培养液；
步骤四：将NK细胞接种于起始培养液中培养1-2天，培养期间根据细胞生长状态添加NK细胞培养液；当培养至第3天时，将培养液离心，获得的细胞沉淀中加入NK细胞培养液继续培养；
步骤五：当NK细胞数量达1.5×108个/瓶以上时，加入2支NK扩增试剂和NK细胞培养液进行扩大培养，培养过程中根据细胞生长状态增加NK细胞培养液并进行分袋培养，使细胞浓度在1.0×106个/ml，当培养至第12天时，控制加液量，使细胞浓度为2.0×106个/ml；
步骤六：继续培养至第14天后，收集细胞培养液，获得NK细胞原液。
本发明还提供了上述外用药物在作为物理性皮肤病治疗药物中的应用。
进一步地，将NK细胞原液与不同的外用药物辅料混合，可制备获得外用液体制剂和外用膏状制剂，在使用上述外用药物治疗物理性皮肤病及动物性皮肤病时，先用外用液体制剂，再用外用膏状制剂进行混合治疗，可保持药效能够很好地让皮肤吸收，达到最佳治疗效果，混合使用数次后，症状即可减轻或消失。
本发明的原理为：NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞在体外可杀伤某些细菌、真菌等，这与NK细胞释放某些杀伤介质有关。NK释放的介质主要有穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等。而在NK细胞培养过程中，其培养液中可分泌多种细胞因子，发挥免疫调节作用，这些细胞因子包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、单核细胞趋化蛋白、白介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素以及穿孔素等，这些细胞因子能够直接渗透皮肤作用于靶细胞，达到治疗的效果。
与现有技术相比，本发明提供了一种用于治疗物理性皮肤病及动物性皮肤病的外用药物及其制备方法和应用，该外用药物是利用NK细胞分泌的细胞因子配上一些药用辅料，使细胞因子快速渗入皮肤，消除炎症，可综合治疗物理性皮肤病及动物性皮肤病，蚊虫叮咬，防止丘疹、水疱、伤口、糜烂后真菌细菌的感染等，具有快速止痒、治疗彻底，无毒副作用等优势，特别是对于皮肤敏感者、婴幼儿、孕妇等，不适宜用其它种类药物、激素的特殊人群也同样适用。
具体实施方式
实施例1
1、材料：
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1制备NK细胞原液
步骤一：PBMC提取：
将新鲜血液于740g离心10分钟，获得上层淡黄色血浆和下层血细胞，将下层血细胞与生理盐水按照体积比1：1混合，取50ml离心管，将稀释的血细胞悬液铺在15ml淋巴细胞分离液上，400g离心30分钟。收集中间白色膜状细胞层，加入生理盐水洗涤，400g离心10分钟，弃上清液，重复洗涤一次。最后用适量培养液重悬细胞沉淀，即获得PBMC。
步骤二：NK细胞培养液的制备：
在Gibco RPMI Medium 1640basic培养液(购买于美国GIBCO公司)中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的庆大霉素和10％重量百分比的Gibco FBS(购买于美国GIBCO公司)，获得NK细胞培养液。
步骤三：NK细胞起始培养液的制备：
取3.0×107-4.0×107个PBMC于一T75培养瓶中，加入20-30ml的NK细胞培养液和1支NK扩增试剂，其中，所述NK扩增试剂为一种CD8α-白介素21-CD137复合物(参见中国专利文献CN102154207A)，可直接通过市场购买的方式获得，本发明使用的NK扩增试剂的产品规格为2ml/支，浓度为1×107个/ml。
步骤四：NK细胞起始培养：
将NK细胞接种于上述T75培养瓶中培养，其中：
第1、2天注意观察细胞。如果细胞状态良好可不处理。若细胞密度明显加大，可加NK细胞培养液10ml。
第3天将培养液离心，获得的细胞沉淀转移至新的T75培养瓶中，并加入30ml的NK细胞培养液继续培养。
第4天观察细胞，若细胞状态良好，可不做处理，如果细胞密度过大，可酌情加NK细胞培养液。
第5天，若第4天未处理，且细胞状态良好，密度大，则加入NK细胞培养液20ml。
第6天观察细胞，根据细胞密度添加培养液30-50ml。
步骤五：NK细胞扩大培养：
第7天计数，若细胞数量大于1.5×108个/瓶，则加入2支NK扩增试剂，若细胞数量在30-60百万，则长至第8天再添加NK扩增试剂。然后添加NK细胞培养液，使总细胞浓度在1.0×106个/ml。随培养体积逐步增大，可转入T175培养方瓶扩大体积培养，培养液体积大于120ml或细胞数量大于2.0×108个/瓶时，则可以转移至培养袋培养。
第8-11天每天观察，使得细胞浓度在1.0×106个/ml左右，通过计数添加培养液，使得细胞浓度在1.0×106个/ml。
第12-14天每天观察，当细胞数量大于3.0×109个/袋，并且体积大于1200ml时，将细胞分为2袋。
步骤六：收集NK细胞原液：
当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存。一般情况下，14或15天收集细胞，因为此时细胞处于对数生长期，状态最好，越往后细胞状态会缓慢下滑，此时细胞可到3×109个以上，NK细胞(CD3-CD56+)纯度可达到80％以上。
2.2制备SNK液：
按重量计，取NK细胞原液90.0％、甘油3.0％、硼砂0.05％、透明质酸0.1％、对羟基苯甲酸乙酯0.01％和无菌水，混匀后灭菌分装，获得所述SNK液。
2.3制备SNK膏：
按重量计，取NK细胞原液80.0％、卡波姆941为0.1％、甘油1.0％、三乙醇胺1.0％、羟苯乙酯0.01％、透明质酸0.05％和无菌水20.0％，混匀后灭菌分装，获得所述SNK膏。
3、临床验证
将临床实验分成3组进行，具体为：
实验组1：选若干患有物理性皮肤病及动物性皮肤病的患者，包括：多形性日光疹5例、痱子6例、夏季皮疹8例、皮肤褶烂5例、烫烧伤4例和蚊虫叮咬10例，用SNK液进行涂抹或喷液治疗，每天使用2-3次，统计临床治疗结果。
实验组2：选若干患有物理性皮肤病及动物性皮肤病的患者，包括：多形性日光疹5例、痱子6例、夏季皮疹8例、皮肤褶烂5例、烫烧伤4例和蚊虫叮咬10例，用SNK膏进行涂抹治疗，每天使用2-3次，统计临床治疗结果。
实验组3：选若干患有物理性皮肤病及动物性皮肤病的患者，包括：多形性日光疹5例、痱子6例、夏季皮疹8例、皮肤褶烂5例、烫烧伤4例和蚊虫叮咬10例，用SNK液及膏涂抹或喷液治疗，每天使用2-3次，统计临床治疗结果。
结果如下表1所示：
表1：SNK液和SNK膏临床实验结果统计表
临床实验可看出，本发明的NK细胞原液、SNK液和SNK膏对多形性日光疹、痱子、夏季皮炎、褶烂、烧烫伤、蚊虫叮咬等物理性皮肤病及动物性皮肤病等均具有显著的治疗效果，轻度患者涂抹2天后即可痊愈，重度患者涂抹5天后可痊愈，且不留任何色素沉着，3组实验患者均未出现任何副作用。其中，第一组和第二组分别为SNK液和SNK膏，SNK液和SNK膏疗效无显著差别。当SNK液和SNK膏一起使用时(先涂SNK液，再涂SNK膏)，既可保证NK液中的活性因子高效和持久被皮肤所吸收，又可提高疗效，两者联合使用疗效最佳。
实施例2
本实施例提供了一种SNK液，按重量计，所述SNK液由NK细胞原液80.0％、甘油5.0％、硼砂0.08％、透明质酸0.3％、对羟基苯甲酸乙酯0.03％和适量水组成，其中，所述NK细胞原液的制备方法同实施例1。
选痱子患者5例，轻度烧伤患者2例，用上述SNK液进行治疗，每天使用2-3次，结果发现，上述SNK液对痱子和轻度烧伤均有显著治疗效果，轻度痱子患者连续使用2天即可痊愈，重度痱子患者连续使用4天痊愈，轻度烧伤使用3天可痊愈。
实施例3
本实施例提供了一种SNK膏，按重量计，所述SNK膏由NK细胞原液70.0-80.0％、卡波姆941为0.1-1.5％、甘油1.0-2.0％、三乙醇胺1.0-3.0％、羟苯乙酯0.01-0.03％、透明质酸0.05-0.1％和适量水组成。
选蚊虫叮咬患者6例，夏季皮炎患者3例，用上述SNK膏进行治疗，结果发现，上述SNK膏对蚊虫叮咬和夏季皮炎均有显著治疗效果，一般蚊虫叮咬患者涂抹3天可痊愈，且不留色素，夏季皮炎患者连续使用6天痊愈。
实施例4
本实施例提供了一种SNK液，按重量计，所述SNK液由NK细胞原液20％，甘油5％和适量无菌水组成，利用所述SNK液治疗褶烂，连续使用8天后，基本痊愈。
实施例5
本实施例提供了一种SNK液，所述SNK液由NK细胞原液50％，甘油5％和适量无菌水组成，利用所述SNK液治疗夏季皮炎，连续使用7天后，基本痊愈。
实施例6
本实施例提供了一种SNK液，所述SNK液为100％的NK细胞原液，利用所述SNK液治疗烫伤患者，结果发现，对于轻度烫伤患者治疗4天可痊愈，对于重度烫伤患者治疗7天可痊愈。
理论上，药物中的NK细胞原液的含量越高，活性因子含量越高，效果越好，但考虑到使用方便性和增加皮肤渗透性和保护性的情况下，需要在NK细胞原液基础上添加了一些辅助成分，实施例6中采用100％的NK细胞原液进行治疗，其临床实验结果与实施例1的SNK液及膏相比，在治疗效果上并无很大差别。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。