一种胶原膜的改性方法与流程

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种胶原膜的改性方法。

背景技术：

牙科手术中常需要应用引导骨再生手术进行骨增量。胶原是细胞外基质的一种成分，已经广泛应用于引导骨再生术中。胶原膜有较好的生物相容性，并能促进成骨细胞黏附、增殖、迁移和分化，也能有阻挡成纤维细胞快速入侵骨组织生长位点、隔开软组织与硬组织的生长等屏障功能。

然而，作为一种外源性移植物，胶原仍然会引起一定的炎症反应，也因为它的易降解性而缺乏较好的机械性能。科学家们采用交联剂与胶原进行交联，从而提高它的机械性能。常用的交联剂是戊二醛，但它容易引发炎症和产生一定的细胞毒性。因此，胶原膜长期的保存和使用，不仅仅需要提高机械性能，更要抗炎和提高生物相容性。

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是一种来自绿茶的多酚，它拥有众多生物学功能，近年来广受关注。科学家们发现，EGCG拥有抗癌、抗氧化、抗炎症、抗纤维化和促进成骨的作用。同时，它也可以作为一种胶原的交联剂，既可以增强胶原的机械性能，也不会破坏胶原的三股螺旋结构。因此，EGCG-胶原复合膜可以用于引导骨再生等手术中，并拥有良好的前景。

EGCG与胶原膜交联后，随着EGCG浓度的增加，胶原膜的机械性随之增加。然而，EGCG作为一种药物，较大浓度的EGCG仍然拥有一定的细胞毒性。Li等人的研究表明不同浓度的EGCG会有不同的作用，不同浓度的EGCG可以有抗癌作用也可能有促癌作用。因此，对EGCG的细胞毒性仍然需要进一步的解决。

因此，现有的胶原膜的机械性能、抗炎性和生物相容性都有待提高。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种胶原膜的改性方法，

其中，所述改性胶原膜是通过加载一种聚合物在用药物-胶原复合膜上得到的。

其中，所述改性胶原膜所述加载的聚合物为聚乙二醇（PEG）。

其中，所述改性胶原膜所用药物为：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）。

本发明还提供了聚合物改性的药物-胶原复合膜的制备方法：先用药物交联胶原膜，再加载聚合物，以得到聚合物改性的药物-胶原复合膜。

其中，所述制备方法中改性胶原膜所述加载的聚合物为：聚乙二醇（PEG）。

其中，所述制备方法中改性胶原膜所用药物为：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）。

1、一种胶原膜的改性方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.以培养板为模板，加入胶原蛋白2mL，在-26℃低温冰箱冷冻过夜；

B.在-53℃、1 Pa条件下，将步骤A所得样品在冻干机真空冷冻干燥24 h，制备胶原膜；

C.将表没食子儿茶素没食子酸酯按照0.64%,0.064％,0.0064％梯度浓度进行溶液配制；

D. 将步骤B中制备的胶原膜置于0.64%EGCG中预交联10 min后，浸泡于含0.64％EGCG的0.05 mol/L醋酸溶液，于4℃交联24 h，lXPBS缓冲液漂洗3次。同样的方法制备加载0.064％EGCG,0.0064％EGCG的的胶原复合膜；

E. 将制备好的EGCG-胶原复合膜浸泡在1%的PEG20000中，于25℃浸泡过夜，再用PBS缓冲液冲洗三次，于-20℃条件下冷冻干燥过夜。

其中，所述步骤A中培养板的直径为3.5cm/孔，所述步骤E还包括胶原复合膜的生物相容性试验。

本发明的有益效果在于：创造性提供了一种拥有更好机械性能、抗炎性和生物相容性的胶原复合膜，提高了以前胶原膜的机械性能，克服了容易引发炎症等长期困扰本领域的技术问题，降低了药物-胶原复合膜的生物毒性，具有很好的应用前景，为引导骨再生术等相关骨增量手术提供了新选择。

附图说明

图1为本发明改性胶原膜的制备示意图。

图2为PEG改性EGCG-胶原复合膜材料表面结构图。

图3为MG63细胞在PEG改性EGCG-胶原复合膜上的形态特征图。

图4为MG63细胞在PEG改性EGCG-胶原复合膜上的活细胞数量特征图。

图5为MG63细胞在PEG改性EGCG-胶原复合膜上的CCK-8细胞活性特征图。

具体实施方式

实施例1：一种胶原膜的改性方法，包括以下步骤：

一、PEG改性的EGCG-胶原复合膜的制备

其中PEG改性的EGCG-胶原复合膜的制备示意图如图1所示。

制备流程一：胶原膜与EGCG复合，制得EGCG-胶原复合膜，该复合膜抑制细胞活力。

制备流程一：胶原膜与EGCG复合，制得EGCG-胶原复合膜，再与PEG改性，该复合膜促进细胞活力。

1、胶原膜的制备

以直径为3.5cm/孔的培养板为模具，加入胶原蛋白2 mL。-26℃低温冰箱冷冻过夜，在一53℃、1 Pa条件下，冻干机真空冷冻干燥24 h，制备胶原膜。

2、EGCG（0.64%,0.064％,0.0064％）梯度浓度溶液配制。

3、EGCG交联胶原膜

将制备的胶原膜置于0.64%EGCG中预交联10 min后，浸泡于含0.64％EGCG的0.05 mol/L醋酸溶液，于4℃交联24 h，l X PBS缓冲液漂洗3次。同样的方法制备加载0.064％EGCG,0.0064％EGCG的的胶原复合膜。

4、PEG化

将制备好的EGCG-胶原复合膜浸泡在1%的PEG20000中，于25℃浸泡过夜，再用PBS缓冲液冲洗三次，于-20℃条件下冷冻干燥过夜。

二、PEG改性的EGCG-胶原复合膜的生物相容性试验

1、细胞培养

MG63细胞株常规养于高糖DMEM培养基中（内含10%胎牛血清，100kU/L青霉素，100kU/L链霉菌）在5%CO2、37℃条件下培养，当融合度达到80%时进行处理。

2、加载EGCG、PEG的胶原膜对成骨细胞处理及观测

分多组进行：每个培养板作一组，编号A1—A15组。将各组细胞置于事先制备好的PEG改性的EGCG-胶原复合膜上进行培养，做空白组，每个培养板继续在前述环境下培养，换液时同时重新配置培养液梯度。

3、MG63细胞形态的免疫荧光染色。

用含2％多聚甲醛的PBS固定第3天的细胞，固定5分钟（pH 7.4），将样品在PBS中洗涤3次（每次5分钟），用含有1％牛血清白蛋白和0.1％Triton X-100的PBS预处理1小时，然后在1％Tween20中保温20分钟。之后用PBS洗涤5分钟后，培养在用PBS1：100稀释的Rhodamine-phalloidin (Life technologies, Thermo, USA)中15分钟。然后用PBS冲洗3次，每次5分钟。添加300nM的DAPI染色溶液(Life technologies, Thermo, USA)，覆盖细胞和培养基1-5分钟，避光。然后，用PBS冲洗细胞2-3次以去除染色液，采取图像（图2）。结果显示，PEG改性后的EGCG-胶原复合膜, 明显促进了细胞的铺展, 细胞有更好的型态。

4、CCK-8法（测量细胞增殖活性）

在96孔板中, 注入成骨细胞达到7000个/孔. 贴壁后，换成含2%胎牛血清的高糖DMEM配制的各种浓度的EGCG溶液，每孔200μl。继续培养24、48h，每孔换成新鲜培养液100μl，再加入10μl CCK-8溶液，细胞培养箱中孵育1h后在酶标仪上450nm波长处读取各孔吸亮度（A）值，计算细胞增殖率，公式为=（处理组A值-空白A值）/（对照组A值-空白A值）*100%。结果见图3。结果发现PEG改性后的EGCG-胶原复合膜上的细胞活性显著高于E-Col组。

5、活死细胞染色（CCK-8）

将实验孔样品经PBS液漂洗15s后，转移至盖玻片上，用含10μg/ml Calcein-AM的PBS液孵育30min，在共聚焦显微镜下检测成像。Calcein-AM显示绿色标示活细胞。计数活细胞数量（N活）。结果发现PEG改性后的EGCG-胶原复合膜上的活细胞数量显著高于E-Col组。