丹酚酸A的医药用途的制作方法

本发明涉及丹酚酸A的新的医药用途，具体是指其在制备治疗心脑血管疾病药物方面的用途。

背景技术：

cAMP广泛存在于各种细胞中，对细胞的功能和代谢起着重要的调节作用。药理试验表明，外源性cAMP具有舒张平滑肌、扩张血管、改善肝功能、促进神经再生、抑制皮肤外层细胞分裂和转化异常细胞的功能，可促进呼吸链氧化酶的活性、改善心肌缺氧等。升高cAMP的含量可用于治疗下列病症，包括但不限于：血栓栓塞性疾病、周围血管病、人工心脏瓣膜、充血性心力衰竭、冠脉搭桥手术、病毒性心肌炎、心律失常、甲亢、慢性肝炎、支气管哮喘。【党立等.环磷酸腺苷的临床应用进展.山东科学，2007；20：61-64.】

血小板在血栓形成过程中，特别是动脉血栓和微血管血栓形成中起着关键作用。抗血小板药可抑制血小板的黏附、聚集和释放功能，阻抑血栓形成，多项循证医学研究显示加强抗血小板治疗，可明显减少急性冠脉综合征患者心脏事件的发生率和有效减少缺血性脑卒中事件的发生。

细胞外和细胞内的钙离子对于血小板的功能都起着重要的作用。细胞外的钙离子是血小板聚集过程中的重要因素之一，而细胞内钙离子的重新分布可能是血小板聚集的必要条件。随着钙离子释放，胞内钙浓度增高，与钙调蛋白形成复合物，激活多种血小板内钙依赖性酶，包括分解cAMP的磷酸二酯酶，促使糖原分解的磷酸化酶激酶，以及膜磷酸化相关的酶等。cAMP能抑制血小板的变形，颗粒中心化，分泌，释放和聚集等反应。cAMP对血小板功能的抑制作用也主要是通过抑制Ca²⁺的释放、降低胞内的Ca²⁺水平来实现的，因而使得磷脂酶不能被激活，花生四烯酸就不可能从血小板的膜磷脂中释放出来。结果，前列腺素与TXA2的合成就不能进行。因此，文献报道，对于钙离子浓度的抑制、对于腺苷酸活化酶的抑制、对于血小板胞浆钙离子浓度的抑制可用于治疗下列疾病的一种或几种：心肌梗塞、缺血性卒中、心绞痛、急性冠状动脉综合症、冠状动脉溶栓后再闭塞、血栓形成期间的闭塞和冠状动脉再狭窄、中风、TIA(短暂性脑缺血发作或急性脑血管综合征)、肺动脉高压、糖尿病、外周血管疾病、心力衰竭、患有心血管和脑血管疾病的患者的临床血管并发症的二级预防、动脉粥样硬化、血管介入性策略的结合药物治疗、周身血液血栓性疾病。

丹参为重要的传统活血化瘀中药，属唇形科鼠尾草属植物，具有抗血栓、扩张血管和改善微循环之功效，临床常用于治疗各种心脑血管疾病。丹酚酸A(Salvianolic acid A)为中医常用活血化瘀药丹参Salvia miltiorrhiza Bge中存在的酚酸类化合物，天然含量约为0.01％～0.08％之间，最早为北京药物所黎莲娘教授首先在丹参中发现，并经张均田，杜冠华等证明了其具一定的生物活性。但丹酚酸A对于促进血小板和/或血浆中cAMP含量升高、对于钙离子浓度的抑制、对于腺苷酸活化酶的抑制、对于血小板胞浆钙离子([Ca²⁺]i)浓度的抑制作用未见报道。

技术实现要素：

本发明公开了丹酚酸A在制备促进血小板和/或血浆中CAMP含量升高的药物中的用途。其中所述的促进血小板和/或血浆中CAMP含量升高的药物可用于治疗以下病症的一种或几种：预防或治疗溶栓、经皮冠状动脉介入术或冠脉搭桥术等原因引起的心肌缺血再灌注损伤、血栓栓塞性疾病、周围血管病、人工心脏瓣膜、充血性心力衰竭、冠脉搭桥手术、病毒性心肌炎、心律失常、甲亢、变态反应、免疫力低下、抑郁、慢性肝炎、支气管哮喘，特别是可用于预防或治疗溶栓、经皮冠状动脉介入术或冠脉搭桥术等原因引起的心肌缺血再灌注损伤。

本发明还公开了，丹酚酸A在制备抑制血小板中磷酸二酯酶活性的药物中的用途。其中所述的抑制血小板中磷酸二酯酶活性的药物可用于治疗以下病症的一种或几种：预防或治疗溶栓、经皮冠状动脉介入术或冠脉搭桥术等原因引起的心肌缺血再灌注损伤、心肌梗塞、缺血性卒中、心绞痛、急性冠状动脉综合症、冠状动脉溶栓后再闭塞、血栓形成期间的闭塞和冠状动脉再狭窄、中风、TIA(短暂性脑缺血发作或急性脑血管综合征)、肺动脉高压、糖尿病、外周血管疾病、心力衰竭、患有心血管和脑血管疾病的患者的临床血管并发症的二级预防、动脉粥样硬化、血管介入性策略的结合药物治疗、周身血液血栓性疾病，特别是可用于预防或治疗溶栓、经皮冠状动脉介入术或冠脉搭桥术等原因引起的心肌缺血再灌注损伤。

本发明还公开了丹酚酸A在制备促进腺苷酸活化酶活性的药物中的用途。其中所述的促进腺苷酸活化酶活性的药物可用于治疗以下病症的一种或几种：预防或治疗溶栓、经皮冠状动脉介入术或冠脉搭桥术等原因引起的心肌缺血再灌注损伤、心肌梗塞、缺血性卒中、心绞痛、急性冠状动脉综合症、冠状动脉溶栓后再闭塞、血栓形成期间的闭塞和冠状动脉再狭窄、中风、TIA(短暂性脑缺血发作或急性脑血管综合征)、肺动脉高压、糖尿病、外周血管疾病、心力衰竭、患有心血管和脑血管疾病的患者的临床血管并发症的二级预防、动脉粥样硬化、血管介入性策略的结合药物治疗、周身血液血栓性疾病，特别是可用于预防或治疗溶栓、经皮冠状动脉介入术或冠脉搭桥术等原因引起的心肌缺血再灌注损伤。

本发明还公开了丹酚酸A在制备抑制血小板胞浆钙离子浓度的药物中的用途。其中所述的制血小板胞浆钙离子浓度的药物可用于治疗以下病症的一种或几种：预防或治疗溶栓、经皮冠状动脉介入术或冠脉搭桥术等原因引起的心肌缺血再灌注损伤、心肌梗塞、缺血性卒中、心绞痛、急性冠状动脉综合症、冠状动脉溶栓后再闭塞、血栓形成期间的闭塞和冠状动脉再狭窄、中风、TIA(短暂性脑缺血发作或急性脑血管综合征)、肺动脉高压、糖尿病、外周血管疾病、心力衰竭、患有心血管和脑血管疾病的患者的临床血管并发症的二级预防、动脉粥样硬化、血管介入性策略的结合药物治疗、周身血液血栓性疾病，特别是可用于预防或治疗溶栓、经皮冠状动脉介入术或冠脉搭桥术等原因引起的心肌缺血再灌注损伤。

本发明采用体内、外实验证明丹酚酸A有较好的抗血小板聚集效应，采用ADP、AA、凝血酶3种诱导剂检测丹酚酸A对血小板聚集的作用，丹酚酸A对于ADP和凝血酶诱导剂引起的血小板聚集均有抑制作用，丹酚酸A能够抑制AA诱导的血小板聚集，但作用较弱，处于一个平缓的抑制趋势。环磷酸腺苷(cAMP)存在于血小板膜中，由ATP通过腺苷酸环化酶(AC)作用生成，又通过磷酸二酯酶(PDE)的作用而分解为5′-磷酸腺苷(5′-AMP)，因此内源性cAMP含量主要受AC和PDE调控，通过进一步测定ADP诱导的血小板内cAMP含量及血小板磷酸二酯酶和腺苷酸环化酶活性的影响，显示丹酚酸A能够升高血小板内cAMP的浓度，激活腺苷酸环化酶，并抑制磷酸二酯酶活性。细胞外和细胞内的钙离子对于血小板的功能都起着重要的作用。细胞外的钙离子是血小板聚集过程中的重要因素之一，而细胞内钙离子的重新分布可能是血小板聚集的必要条件。随着钙离子释放，胞内钙浓度增高，与钙调蛋白形成复合物，激活多种血小板内钙依赖性酶，包括分解cAMP的磷酸二酯酶，促使糖原分解的磷酸化酶激酶，以及膜磷酸化相关的酶等。cAMP能抑制血小板的变形，颗粒中心化，分泌，释放和聚集等反应。cAMP对血小板功能的抑制作用主要是通过抑制Ca²⁺的释放、降低胞内的Ca²⁺水平来实现的，因而使得磷脂酶不能被激活，花生四烯酸就不可能从血小板的膜磷脂中释放出来。结果，前列腺素与TXA₂的合成就不能进行。本实验采用荧光探针Fura-2定量测定丹酚酸A对ADP诱导所致的大鼠血小板胞浆中[Ca²⁺]i的影响。结果表明，ADP使血小板[Ca²⁺]i显著升高，另一方面，使用抗血小板聚集等浓度的丹酚酸A却使上述诱导剂刺激而升高的[Ca²⁺]i产生不同程度的降低，且其降[Ca²⁺]的浓度与其抗聚集的浓度基本一致。综上所述丹酚酸A具有肯定的抑制血小板聚集的作用，该机制为丹酚酸A增加血小板内cAMP的含量，降低血小板[Ca²⁺]i等环节有关。迄今为止，还没有发现丹酚酸A抗血小板聚集是通过增加血小板内cAMP的含量、降低血小板[Ca²⁺]i的报导。

cAMP广泛存在于各种细胞中，对细胞的功能和代谢起着重要的调节作用。药理试验表明，外源性cAMP具有舒张平滑肌、扩张血管、改善肝功能、促进神经再生、抑制皮肤外层细胞分裂和转化异常细胞的功能，可促进呼吸链氧化酶的活性、改善心肌缺氧等。升高cAMP的含量可用于治疗下列病症，包括但不限于：血栓栓塞性疾病、周围血管病、人工心脏瓣膜、充血性心力衰竭、冠脉搭桥手术、病毒性心肌炎、心律失常、甲亢的治疗、对周围神经再生作用用于神经系统疾病的治疗、慢性肝炎、支气管哮喘的呼吸系统疾病。

体内血栓形成是一个复杂的生理、生化及病理过程。当血管壁损伤；凝血活性增高，血小板粘附、聚集性增高；血流缓慢、血液粘度增高时就容易形成血栓。动脉血栓栓塞性疾病是人类重要的致死疾病之一，由于血小板聚集是正常凝血机制中的一个关键环节，血小板的粘附、聚集、释放反应是动脉血栓启动的一个重要机制。本发明利用大鼠颈总动脉-颈外静脉血流旁路形成血小板血栓，观察丹酚酸A不同剂量对血栓形成的影响。结果显示丹酚酸A剂量依赖性地降低血栓湿重，其机制研究发现丹酚酸A各剂量组对血浆中TXB₂，6-keto-PGF_1α以及TXB₂/6-keto-PGF_1α比值没有明显影响，但呈剂量依赖性升高大鼠血浆中cAMP含量。在丹酚酸A对大鼠血液流变学指标观察中发现丹酚酸A 5mg/kg、10mg/kg剂量组全血粘度明显低于模型组，10mg/kg组同时能降低大鼠血浆粘度、红细胞压积，10mg/kg组效果与赖氨匹林相当。

具体实施方式

实验例1：丹酚酸A对体外不同诱导剂血小板聚集的影响

1、材料

丹酚酸A，山东靶点药物研究有限公司提供

乙酰水杨酸(ASA)，sigma公司A5376

3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，sigma公司I5879

二磷酸腺苷(ADP)，sigma公司A2754

凝血酶(Thr)，sigma公司T4648

花生四烯酸(AA)，sigma公司BMA001

乙二胺二乙酸二钠盐(EDTA.Na₂)，天津市化学试剂一厂，批号：080616

乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，sigma公司E4378

Hepes，sigma公司H3375

牛血清白蛋白第五组分(BSA)，Roche 738328

枸盐酸钠，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20071212

无水氯化钙(CaCl₂)，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20090113

氯化钾(KCl)，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20071008

无水氯化镁(MgCl₂)，天津市福晨化学试剂厂，批号：20030928

碳酸氢钠(NaHCO₃)，天津市福晨化学试剂厂，批号：20080402

氯化钠(NaCl)，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20080723

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20080822

无水葡萄糖(Glucose)，天津市化学试剂一厂，批号：020202

LBY-NJ4血小板聚集仪，北京普利生公司产品

Z36HK型低速冷冻离心机，德国Hermle公司

AR1140万分之一电子天平，OHAUS Corporation

AR2130千分之一电子天平，OHAUS Corporation

动物：SPF级SD大鼠，雄性，体重300～350g，购于北京大学医学部实验动物中心，合格证号：SCXK(京)2006-0008

2、方法与结果

取SD大鼠，10％水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3.8％枸盐酸钠抗凝(1∶9)，1000rpm，20℃离心8min，取上清得PRP。PRP以2500rpm离心10min，得到血小板沉淀，用改良的无Ca²⁺Tyrode-Hepes洗涤液(NaCl 129mM，KCl 2.8mM，NaHCO₃ 8.9mM，MgCl₂ 0.8mM，KH₂PO₄ 0.8mM，EGTA 2mM，glucose 5.6mM，Hepes 10mM，BSA 0.35％，pH7.4)洗涤血小板两次，2500rpm离心10min，最后将血小板悬浮于含Ca²⁺(1mM)的Tyrode-Hepes缓冲液(NaCl 129mM，KCl 2.8mM，NaHCO₃ 8.9mM，MgCl₂ 0.8mM，KH₂PO₄ 0.8mM，CaCl₂ 1mM，glucose 5.6mM，Hepes 10mM，BSA 0.35％，pH7.4)中，调节血小板数4.5×10⁸个/ml。取血小板悬液280μl，加入10μl药物或等体积溶媒孵育5min后，加入诱导剂ADP(终浓度10μmol/l)，AA(终浓度0.5mmol/l)，Thr(终浓度0.7u/ml)诱导血小板聚集。记录血小板5min内聚集率，并计算血小板聚集抑制率(％)。

数据用表示，以组间t检验进行统计学处理，结果显示，丹酚酸A能够抑制ADP、AA、Thr诱导的大鼠血小板聚集，其作用强度为：ADP＞Thr＞AA，IC₅₀分别为：ADP：389.7μg/ml，Thr：912μg/ml，AA：1499μg/ml。丹酚酸A能够抑制AA诱导的血小板聚集，但作用较弱，处于一个平缓的抑制趋势。对于凝血酶诱导的血小板聚集，在600μg/ml浓度以下，几乎没有抑制作用，但当浓度增大以后，丹酚酸A能够较好的抑制血小板聚集。

实验例2：丹酚酸A对血小板内cAMP含量及血小板中磷酸二酯酶和腺苷酸环化酶活性的影响

1、丹酚酸A对血小板内cAMP含量的影响

1.1材料

丹酚酸A，山东靶点药物研究有限公司提供

3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，sigma公司，批号：I5879，用生理盐水100℃水浴中溶解，浓度为10mM。

二磷酸腺苷(ADP)，Sigma公司，批号：A2754，用生理盐水配制成浓度为300μmol/l的溶液。

乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，天津市化学试剂一厂，批号：080616，用去离子水配制。

乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，sigma公司，批号：E4378

Hepes，sigma公司，批号：H3375

牛血清白蛋白第五组分(BSA)，Roche公司，批号：738328

枸盐酸钠，国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：F20071212，临用时用超纯水配制成3.8％的溶液。

无水氯化钙(CaCl₂)，国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：F20090113

氯化钾(KCl)，天津市科密欧化学试剂有限公司，优级纯，批号：20071008

无水氯化镁(MgCl₂)，天津市福晨化学试剂厂，分析纯，批号：20030928

碳酸氢钠(NaHCO₃)，天津市福晨化学试剂厂，分析纯，批号：20080402

氯化钠(NaCl)，国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：F20080723

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯，批号：20080822

无水葡萄糖(Glucose)，天津市化学试剂一厂，分析纯，批号：020202

AR1140电子天平：OHAUS Corporation

动物：SPF级SD大鼠，雄性，体重300～350g，购于北京大学医学部实验动物中心，合格证号：SCXK(京)2006-0008

1.2方法与结果

取SD大鼠，10％水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3.8％枸盐酸钠抗凝(1∶9)，制备PRP。PRP以2500rpm离心10min，得到血小板沉淀，用改良的无Ca²⁺Tyrode-Hepes洗涤液洗涤两次，最后将血小板悬浮于含Ca²⁺(1mM)的Tyrode-Hepes缓冲液中，调节血小板数4.5×10⁸个/ml，备用。取血小板悬液280μl，加入10μl不同浓度药物或等体积溶媒孵育5min后，加入ADP(终浓度10μmol/l)诱导血小板聚集。反应5min后，加入10μl EDTA终止反应，立即放入100℃水浴中5min，冷却至室温后，4℃，4000rpm，离心10min，取上清液，-20℃冻存，放免法测血小板中cAMP含量。

数据用表示，以组间t检验进行统计学处理，结果加入ADP诱导血小板聚集后，血小板中cAMP含量降低，注射用丹酚酸A不同浓度均能一定程度上升高cAMP含量，从400μg/ml浓度开始，与空白对照比较，作用有显著性差异。

2、丹酚酸A对血小板磷酸二酯酶和腺苷酸环化酶活性的影响

2.1材料

丹酚酸A，山东靶点药物研究有限公司提供

[³H]cAMP(12.4Ci/mmol)，购自PerkinElmer

ATP，购自sigma公司

蛇毒，购自sigma公司

腺苷为BDH产品

Triton闪烁液，购自华美生物工程公司

茶碱，上海试剂二厂产品

福斯高林(Forskolin)，sigma公司产品，货号：F6886

动物：健康家兔

2.2方法与结果

2.2.1血小板PDE的制备

健康家兔颈总动脉插管取血，以0.077mol/l EDTA抗凝，200×g离心10min，分离PRP，然后将PRP在室温下继续离心10min(1200×g)，得到血小板，用含0.15mol/l NaCl，0.15mol/l Tris-HCl，0.077mol/l EDTA的缓冲液洗涤血小板两次。洗过的血小板悬浮于适量的无钙Kreb’s液中，并加入少量苏来醇溶液，于液氮快速冻融三次后，2500×g 4℃离心20min，上清部分即为血小板PDE溶液，置-20℃保存。

2.2.2PDE活性测定

各试管内依次加入50mM Tris，5mM MgSO₄溶液100μl，药液50μl(对照管为50μl 50mM Tris缓冲液)，纯化的³H-cAMP 50μl(100,000cpm)，再加PDE溶液50μl，置30℃水浴温孵15min后，立即放入100℃水浴2min，冷却后再加入蛇毒10μl，30℃温孵10min，再加入740μl 2.5mM腺苷溶液，将上述试管加于2×0.7cm的QAE Sephadex A-25柱后，加适量的20mM甲酸铵溶液洗脱，取收集液1.5ml加入甲苯-Triton(2∶1)闪烁液10ml，用液闪烁仪测定各管的脉冲数。所有样品均作双管测定，以³H-cAMP转化率表示PDE的活性。

空白管用50μl 50mmol/l Tris缓冲液代替PDE溶液，总计数为50μl³H-cAMP加5ml 20mmol/l甲酸铵，取其中1.5ml加10ml甲苯-Triton闪烁液所测得的脉冲数。

2.2.3血小板AC的制备

将2.2.1中得到的血小板沉淀悬浮于1ml含145mM NaCl，10mM Tris溶液中，储存于-70℃备用，用Lowry法测定酶粗提物的蛋白含量。

2.2.4AC活性的测定

测定血小板膜腺苷酸环化酶活性的反应液每管为450μl，含(2mM ATP、4mMMgCl₂、5mM茶碱、290mM NaCl、250mM Tris、0.5mM EGTA、药液或溶媒50μl)，将50μl血小板膜粗提物加入管中，立即于37℃孵育20min，然后将反应管置沸水中灭活3min，迅速冰水冷却，离心后取适量上清液以蛋白激酶结合法测cAMP含量，空白对照管加50μl经煮沸3min的血小板膜粗提物代替活酶。酶基础活性以pmol.cAMP/mg protein/min表示。

数据用表示，以组间t检验进行统计学处理，结果见表3。

实验证明，丹酚酸A能激活腺苷酸环化酶，并抑制磷酸二酯酶活性，这可能是丹酚酸A能升高血小板中cAMP含量的作用机理。

3丹酚酸A对血小板磷酸二酯酶和腺苷酸环化酶活性的影响(n＝5)

实验例3：丹酚酸A对血小板内游离[Ca2+]i的测定

1、材料

丹酚酸A，山东靶点药物研究有限公司提供

二磷酸腺苷(ADP)：sigma公司A2754

乙酰羟甲基酯(Fura-2/AM)：sigma公司产品

TritonX-100，购自华美生物工程公司

动物：SPF级SD大鼠，雄性，体重300～350g，购于北京大学医学部实验动物中心，合格证号：SCXK(京)2006-0008。

2、方法与结果

大鼠腹主动脉取血，3.8％枸盐酸钠(1∶9)抗凝，制备PRP。取PRP，加入终浓度为2μmol/L的Fura-2/AM，37℃避光振摇30min。用无Ca²⁺ Tyrode-Hepes液洗涤2次，将血小板外多余的Fura-2/AM洗去，最后悬浮于含Ca²⁺Tyrode-Hepes液中，并调整血小板浓度值为4-5×10⁸/mL。取该血小板悬液280μl，加入不同浓度的丹酚酸A各20μl，37℃孵育5min后加入ADP(终浓度约为10μmol/L)，37℃孵育1min，用荧光分光光度计测Ca²⁺浓度，固定发射光波长505nm，激发光波长340nm和380nm(波宽5nm)，测定荧光强度比值(R)，加入0.1％Triton-100(v/v)，混匀后测得最大荧光强度比值(Rmax)和Sb₂，加入EGTA(终浓度10mmol/L)，测得最小荧光强度比值(Rmin)和Sf₂。根据公式计算[Ca²⁺]i。

[Ca2+]i(nmmol/l)=Kd×R-RminRmax-R×Sf2Sb2]]>

公式中Kd为Ca²⁺结合Fura-2的解离常数，R为激发光波长340和380nm时Fura-2的荧光强度比值，Rmax为加入TritonX-100时使得Fura-2与Ca²⁺的结合达到饱和时所测得的荧光强度比值，Rmin为加入EGTA使Ca²⁺游离测得的荧光强度比值。Sf2和Sb2分别代表Ca²⁺与Fura-2的结合为0及饱和时，在Ex 380nm测得的Fura-2的荧光强度。

数据用表示，以组间t检验进行统计学处理，结果丹酚酸A能够降低大鼠血小板胞浆钙离子浓度。