本发明属于松花粉萃取技术领域，尤其涉及一种从松花粉中提取有效成分的超临界萃取方法。
背景技术：
松花粉是一种药食兼用的花粉品种，作为中国传统药材，其药食兼用的历史已逾千年，具有延年益寿等多种保健功效。花粉黄酮具有多种美容护肤作用，有研究表明其在抗辐射、延缓衰老和抗氧化方面都有良好的表现。
目前松花粉的提取分离工艺大都集中在水提和醇提工艺研究，对松花粉中的酯类成分和生物碱类成分难以达到分离纯化的目的；利用超临界等萃取技术通常是针对松花粉中的酯类成分如甾醇、甘油酸等，但是对传统提取工艺下涉及的活性成分少有涉及，因此很难最大程度的利用松花粉中的有效成分。
技术实现要素：
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种从松花粉中提取有效成分的超临界萃取方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种从松花粉中提取有效成分的超临界萃取方法，包括以下步骤：
(1)提取总酯类成分：将经过干燥、破壁和灭菌的松花粉装入萃取器中，在温度为40-50℃、压力为25MPa、CO2流速为25L/h-35L/h,条件下连续萃取2h；带着萃取出脂肪类化合物的CO2流体进入分离釜I中，在温度为40℃-60℃、压力为8MPa条件下进行一级分离；再进入分离釜II中，在温度为30℃、压力为6MPa条件下进行二级分离；
(2)提取总黄酮类成分：将步骤(1)得到的药物残渣在压力为20-40MPa、温度为60-80℃、CO2流速为25L/h-35L/h的条件下萃取1.5h；
(3)提取总生物碱成分：将步骤(2)得到的药物残渣与100mL、浓度为10-20％的氨水溶液混合，碱化1-2h后，在温度为70℃、压力为40MPa、CO2流速为35-45L/h的条件下萃取1.5h；
(4)将步骤(1)(2)(3)的萃取成分混合。
其中，步骤(2)的萃取过程中加入200-400ml、浓度为80-90％的乙醇作为挟带剂。
步骤(3)中的萃取过程中加入300ml无水乙醇作为挟带剂。
步骤(1)(2)(3)中所述的CO2纯度为99％以上。
本发明的有益效果是：
1、本发明提取的酯类成分在护肤品中可以起到脂质屏障防护的作用，并且同保湿抗炎等功效息息相关；提取的黄酮类成分具有抗衰老、抗炎症等护肤活性；提取的生物碱类成分具有与神经酰胺相似的功能结构基团，能够起到调节皮肤生理功能、保湿和延缓皮肤衰老的作用。三种成分的功能活性相辅相成，达到协同增效的目的，促进松花粉有效成分在终端产品中的利用率。
2、现有的松花粉超声提取多为一级提取，主要针对其中的脂肪类成分，或是脂质合成前体物质甾醇类化合物。本发明提取的物质为总酯类，除了常见的脂肪类或是甾醇类成分，还包括磷脂类成分和挥发油类成分等。另外，本发明涉及三级提取，借助超临界萃取技术，除了提取常见的酯类成分外，还利用残渣进行黄酮和生物碱两种较难提纯物质的提取，提高了黄酮等成分的提取率，进而提高了松花粉的利用效率，避免了资源浪费，同时最大程度的保存了其中的有效物质，提高了生物活性。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种从松花粉中提取有效成分的超临界萃取方法，包括以下步骤：
(1)提取总酯类成分：将松花粉装入萃取器中，在温度为40-50℃、压力为25MPa、CO2流速为30L/h条件下连续萃取2h；带着萃取出脂肪类化合物的CO2流体进入分离釜I中，在温度为50℃、压力为8MPa条件下进行一级分离；再进入分离釜II中，在温度为30℃、压力为6MPa条件下进行二级分离；
(2)提取总黄酮类成分：将步骤(1)得到的药物残渣在压力为20-40MPa、温度为70℃、CO2流速为30L/h的条件下萃取1.5h，的萃取过程中加入200-400ml、浓度为80-90％的乙醇作为挟带剂；
(3)提取总生物碱成分：将步骤(2)得到的药物残渣与100mL、浓度为10-20％的氨水溶液混合，碱化1-2h后，在温度为70℃、压力为40MPa、CO2流速为40L/h的条件下萃取1.5h，萃取过程中加入300ml无水乙醇作为挟带剂；
(4)将步骤(1)(2)(3)的萃取成分混合。
各提取成分的含量测定：
1、总甾醇含量测定
对照品标准液的配制：精密称取豆甾醇对照品0.022g，用甲醇溶解并定容至50mL容量瓶作为对照品标准溶液。
显色剂的配制：称取0.5g氧化汞，精密加入2mL浓硫酸和10mL蒸馏水，超声溶解，量取1mL该溶液置于100mL容量瓶中，用冰乙酸和浓硫酸混合溶液(1∶2)定容至刻度。
供试品溶液的配制：精密称取0.5g一级萃取后溶液，用甲醇溶解并定量至10mL容量瓶作为供试品溶液。
测定方法：取供试品溶液2mL置于10mL容量瓶中用磺基醋酸汞试剂定容至刻度，在410nm波长处，用甲醇作为空白测定其吸光度。
线性与范围：精密吸取豆甾醇标准品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、10.0mL分别置于10mL容量瓶中并用甲醇定容至刻度，作为对照品溶液。410nm波长处测定其吸光度，以豆甾醇浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标作回归曲线，得回归方程。
实验结果:结果测得溶液中甾醇含量为31.69mg/mL,用传统溶剂提取同样得率提取液中甾醇含量仅为10.19mg/mL.
2、黄酮含量测定:
最大吸收峰位置确定：准确吸取芦丁标准溶液(0.55g/L)10mL于50ml容量瓶中，用30％乙醇补至25mL，加入1.4mL、5％NaNO2摇匀，放置5min后加入1.4mL、10％Al(NO3)3，6min后再加入10mL、1mol/L NaOH混匀，用30％乙醇稀释至刻度，10min后测定其λmax，参比为空白试剂。
标准曲线的绘制：分别取上述芦丁标准溶液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于6只50mL容量瓶中，用30％乙醇补至25mL，加入1.4mL、5％NaNO2摇匀，放置5min后加入1.4mL、10％Al(NO3)3，6min后再加入10mL、1mol/L NaOH，混匀，用30％乙醇稀释至刻度。于波长510nm处测定测吸光值，参比为空白试剂。
样品溶液的测定：取1mL提取液，于25mL容量瓶中用30％乙醇-水补充至12.5mL，加入0.7mL亚硝酸钠，摇匀，放置5min后加入0.7mL、l0％Al(NO3)3，6min后再加人5mL、1mol/L NaOH混匀，用30％乙醇稀释至刻度，10min后测定其在510nm波长下的吸光度，参比为空白试剂。
实验结果：测得提取液中黄酮含量为2.38mg/mL。
3、生物碱含量测定：
标准曲线的绘制：用移液管准确量取氧化苦参碱对照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL,置于干燥的具塞三角瓶中,各加蒸馏水至6mL,分取5mL,分别加入pH值7.0缓冲液5mL,再依次精密加入浓度0.025％溴麝香草酚蓝标准液2.0mL和氯仿10.0mL,振摇1min,转移至50mL分液漏斗放置分层，静置1h,分取氯仿层，在417nm波长处测定吸光度。
另以同法操作(不加氧化苦参碱对照品溶液)的氯仿为空白。
以浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线。
样品测定：分别取稀释液5.0mL置分液漏斗中,依次加入pH值7.0缓冲溶液5mL、浓度0.025％溴麝香草酚蓝标准液2.0mL和氯仿10.0mL,振摇1min,静置1h,分取氯仿层。用紫外可见分光光度计于417nm波长处测定吸光度。将测得的吸光度值代入回归方程，计算提取液中总生物碱的含量。
实验结果：提取液中生物碱含量为1.94mg/mL。若不采用超临界萃取，只能使用有机溶剂对生物碱进行富集，影响产品后期利用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。