本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种胎盘脂多糖、多肽二联免疫增强剂及其制备方法。
背景技术：
随着现代医学、细胞生物学及分子生物学的发展，人们逐渐认识到：许多疾病的发生、发展与机体免疫系统功能缺陷和功能失调有着密切的联系。影响机体正常免疫系统功能的原因有：①各种先天或后天自身免疫功能缺陷；②各种急慢性细菌、病毒感染；③人为因素、环境因素、药物引发的不良反应等原因导致的继发性免疫功能下降。针对以上原因，调节或增强机体免疫功能，已成为预防和治疗疾病的重要途径。
胎盘是哺乳动物妊娠期间由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官，在分娩时排除体外。不同种属动物的胎盘外形和内部构造差别很大，但它们在胎儿的发育过程中都承担着除运动和中枢神经系统以外的胎儿器官的所有功能，具有让胚胎生长的相同作用。胎盘入药在我国已经有几千年的历史，《本草纲目》中就有记载。传统医学认为，胎盘味甘咸，性温，归肺肝肾经，具有温肾益精，补气养血的功效。现代生物学及医学研究证明，妊娠期承担如此复杂的功能的动物和人胎盘，不仅为妊娠期胎儿的发育提供了坚强的后盾，并且在娩出后仍含有多种免疫球蛋白、活性肽、干扰素、激素等生物活性物质及磷脂、氨基酸、矿物质和多种多糖等成分。
自1985年刘月新报道采用“匀浆-透析法”提取胎盘肽（又称胎盘因子，胎盘免疫调节因子）以来，广大科研工作者对胎盘肽进行了大量的理化分析与生物活性测定，并就其在临床用于治疗病毒性肝炎、白细胞减少症、重症肌无力等免疫性疾病以及恶性肿瘤等作了大量的观察，取得了较为理想的疗效。大量临床研究证明从哺乳类动物胎盘中提取出来的多肽具有抗氧化、防衰老、增强机体免疫、抑菌和促进细胞繁殖的功效。以前，人们认为氨基酸是人体吸收蛋白质的主要途径，近年来，科学家经研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后，主要以小肽形式吸收，比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用，所以制备胎盘肽口服制剂，将胎盘中丰富的生物活性物质，通过肽的形式传递给动物或人，以增强动物或人体的生物功能，已经越来越多地引起人们的重视，胎盘肽作为一类小分子物质，以其相对分子量低、活性强、用量少的独特优势，其工业化生产也成为当前食品和医药行业发展的大趋势。
动物胎盘脂多糖是一种类酸性黏多糖与脂质的共价结合物。大量实验研究证明，它能明显诱导机体淋巴细胞的增殖，促进淋巴细胞的DNA合成；能够增强机体对多种细菌和病毒的非特异免疫力，同时对机体的体液免疫应答也具有良好的促进作用，可产生较好的免疫保护性。脂多糖能增强非特异性免疫防卫系统的体液因素使补体的含量增高，也可诱导干扰素的产生，使溶菌酶和吞噬细胞活性增强，提高嗜中性白细胞和巨噬细胞的杀菌作用。临床研究表明脂多糖对于病毒和细菌引起的许多过敏性疾患、感染性疾病有很好的预防和治疗作用，如对慢性支气管炎、支气管哮喘、慢性胃肠炎、过敏性皮疹和预防感冒等都有较好疗效。近些年已有厂家生产人胎盘脂多糖注射液，但针剂注射使用不便且长时间肌肉注射会给患者带来肌肉疼痛等问题，使其应用受到很大限制。
目前胎盘类产品的制备主要以人胎盘为原材料，最近有些省份已经明文规定禁止进行人胎盘买卖活动，并且个人胎盘应归产妇个人所有，还有一些地方有保存胎盘习俗，忌讳食用胎盘等原因，人胎盘的来源将会大受限制，满足不了医药、食品等多方面的需求。所以数量大、成本低、供货时间长的动物胎盘具有极大的开发利用价值，为胎盘类产品的开发提供可靠的物质基础。
近几年我公司技术团队一直从事开发动物胎盘资源综合利用的研究，并于2009年获得国家发明专利《从猪胎盘中提取多种生物活性物质的联产工艺》，专利号为CN200910064789.6。在此基础上，为了使专利技术转化为生产力，针对如何才能更好的调节和增强机体免疫功能这个困扰大众健康的难题，我公司技术团队又开发出了一种生物利用度高、免疫增效作用强、无毒副作用的动物胎盘脂多糖、多肽二联免疫增强剂，并研制出一套不用任何化学试剂和有机溶剂，收率更高，成本更低，更适用于大规模生产的从动物胎盘中提取脂多糖、多肽、副产物为蛋白粉的联产工艺。
到目前为止，市场已有的胎盘产品均是单一、单产品种，尚未发现有关动物胎盘脂多糖、多肽二联免疫增强剂的使用、销售及报道，为开发该产品尽快上市特申报本发明专利。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种生物利用度较高、免疫增效作用强、无毒副作用、便于工业化、规模化生产的动物胎盘脂多糖、多肽二联免疫增强剂及其相应的制备方法。具体来说本发明是以动物胎盘为原料，应用现代生物过程集成化技术，在同一生产工艺流程中，可生产出脂多糖、多肽、蛋白粉3种功能成份，并以脂多糖、多肽为主要原料，通过科学配方制成一种二联口服剂，可广泛应用于人类和动物医药治疗、预防保健业。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种胎盘脂多糖、多肽二联免疫增强剂，以动物胎盘（猪、牛、羊等）脂多糖、多肽为主要原料，加有无菌生理盐水以及辅料组成，其具体配方为每100 mL中含有胎盘脂多糖5-30 mg；多肽0.1-1.0 g；聚乙二醇4000-6000 3-10 g；木糖醇 1-15 g；余量由无菌生理盐水补足，pH为6.0-8.0。
本发明产品中加入的辅料聚乙二醇4000-6000对人体无毒、无刺激性、具有优良的水溶性、相溶性、粘接性和热稳定性。它可与蛋白质多肽的疏水链作用，增加其稳定性，常作为蛋白质和多肽的保护剂，还可促进机体对功能成分脂多糖、多肽的吸收，提高其生物利用度。本发明产品中加入了木糖醇，可有效改善动物胎盘脂多糖多肽二联口服剂的口感，使产品适口性好，这将会大大提高该产品的食用舒适性，且木糖醇生物稳定性好，食用木糖醇后血糖值不会上升还会起到防龋齿的作用。
其中的动物胎盘脂多糖、多肽是通过以下提取工艺步骤得到的（参见说明书附图）：
A、原料处理：收集经检疫合格的新鲜动物胎盘（猪、牛、羊等）去胎膜、脐带、血块等附属物后用纯水冲洗干净，依次用绞肉机、胶体磨、研磨机粉碎后，放-20℃以下冷库速冻24-48 h，然后取出37℃水浴融化，如此冻融3-5次后置于反应釜中进行消化酶解。
B、消化酶解：向反应釜中加2-3倍原料重的生理盐水，加入原料重量30-50%的新鲜胰浆（取新鲜胰脏，去脂肪，绞碎1-2次，称重，加等量纯水，高速匀浆或搅拌均匀即可），用饱和氢氧化钙调pH值至7.5-9.0，间隙搅拌下，加热至50-55℃，消化10-15 h后，加热至60℃，用超声波发生器中波处理20-30 min，冷却至室温。用过滤式离心机离心过滤，滤液为酶解液。滤渣为蛋白原料1。
C、冷藏离心：将酶解液用醋酸调pH值至4.0-6.0，放冷藏室静置过夜，然后高速（8000 r/min以上）4-8℃条件下离心20-30 min，分别收集上清液和沉淀，上清液即为脂多糖多肽粗提液，沉淀作为蛋白原料2。用苯酚-硫酸法检测多糖含量；双缩脲法检测多肽含量。
D、超滤提取：将脂多糖多肽粗提液用截留分子量10万的超滤装置进行超滤，收集浓缩液1为蛋白原料3。透过液再经截留分子量1万超滤装置进行超滤，收集浓缩液2即为脂多糖提取液，透过液为多肽提纯液。用Tricine SDS-PAGE电泳鉴定多肽分子量≦10000。
E、脂多糖热处理：将脂多糖提取液用生理盐水稀释至脂多糖含量每毫升10-30mg，放100-120℃水浴加热40-60 min，降至室温，转速3000-5000 r/min条件下离心20-30 min，分别收取上清液和沉淀，上清液进入层析纯化，沉淀为蛋白原料4。
F、层析纯化：将上清液过分子筛柱Sephadex G-100或G-200，用生理盐水作平衡液和洗脱液，收集脂多糖含量高的洗脱液即为脂多糖提纯液，含量低的洗脱液收集作为下次洗脱液用。
G、膜过滤精制：将脂多糖提纯液和多肽提纯液分别依次经1.0 μm、0.60 μm、0.45 μm生物膜过滤分别得脂多糖精制液和多肽精制液。用银染法聚丙烯酰胺电泳鉴定脂多糖纯度≧90%。
H、将上述蛋白原料1、2、3、4混合，搅拌均匀，经真空干燥（60-65℃）制成蛋白粉为本工艺副产物，可应用于食品业或饲料业。
本发明的脂多糖、多肽二联免疫增强剂的制备方法如下：
A、先将聚乙二醇和木糖醇按配方称重后混合，加入总体积50-80%的生理盐水，搅拌均匀，加热至120-130℃保持30-40 min，密封，降至室温放置在万级净化室待用，为配料1。
B、在万级净化室内分取脂多糖精制液和多肽精制液按配方和生产用量混合后经过0.22 μm除菌膜除菌，为配料2。
C、在净化百级条件下无菌操作将灭菌后的配料1和配料2液体混合，用饱和氢氧化钙调pH值至6.0-8.0，搅拌均匀，最后用灭菌生理盐水加至总体积即为二联无菌液。
D、将二联无菌液按规格要求直接灌封为口服液型动物胎盘脂多糖、多肽二联免疫增强剂，也可以根据市场需求，经冷冻干燥做成冻干粉制成粉剂、片剂、胶囊等口服剂型。
本发明与现有传统工艺相比主要创新点如下：
1、本发明二联口服剂将动物胎盘脂多糖和胎盘肽完美的结合，使胎盘脂多糖和胎盘肽发挥协同作用，与市面上现有类似胎盘产品相比，对机体能够起到更强的免疫功能，增强机体对多种细菌和病毒的免疫力，对人和动物的慢性支气管炎、支气管哮喘和预防感冒等均有较好疗效，可减少服用次数，缩短疗程。目前尚未见有此类口服剂型报道。
2、发明产品配方组合科学适用，各组份均为纯生物原料，对人体无毒副作用，各个成分之间具有相互协同作用，配方中加入了聚乙二醇4000-6000，可增加各功效成分稳定性和在胃内的溶解性，促进机体对有效成分的吸收，提高其生物利用度。而产品中加入的木糖醇，则能有效改善动物胎盘脂多糖多肽二联口服剂的口感，使适口性好，大大提高产品的食用舒适性。该产品配方目前未见国内报道。
3、本发明产品生产采用联产工艺，应用现代生物过程集成化技术，在同一生产工艺流程中，可生产出脂多糖、多肽、蛋白粉3种功能成份。该工艺采用传统工艺与现代工艺相结合，简易设备与现代设备相结合，可操作性强，规模可大可小，生产成本低，经济效益显著。而且本工艺简便规范，适用性强，便于实现工业化规模化生产。
4、生产过程节能环保，减少了传统工艺大量使用化学试剂和有机溶剂对环境和人体的污染，可做到无三废环保要求。同时，本工艺有效利用每级提取工艺中产生的废料因无化学残留可作为食用功能蛋白原料，降低了制作成本，具有良好的经济效益和社会效益。
5、本产品使用方法简单方便，适用范围广，经试用很受用户欢迎，具有市场需求潜力，可广泛应用于人和动物的疾病预防、治疗和食品保健业。
与已有专利如《从猪胎盘中提取多种生物活性物质的联产工艺》中脂多糖、多肽提取方法相比，本产品生产工艺做出了以下几项创新和改进：
A)、本工艺采取绞肉机、胶体磨、研磨机等多重粉碎与反复冻融、超声波处理相结合的手段，不用化学类裂解剂而使用新鲜胰浆将胎盘组织酶解时间由原来的48小时缩短至10-15小时，不仅大大减少了劳动力，而且降低了水电能源消耗，生产综合经济效益平均可提高63.2%
B)、本工艺采用截留分子量100KD和10KD的双效超滤及层析相结合的方法进行脂多糖、多肽的提取、纯化，克服了原工艺中大量使用三氯乙酸、酒精等化学试剂，节能环保，同时有利于生产人员的身体健康。
C)、本工艺中提取多肽的方法是从胎盘组织酶解液中与脂多糖同时提取，打破了传统工艺从胎盘组织单一提取的局限性，大大提高了多肽的含量和生物活性，经多次试验对比多肽收率比原工艺平均提高87.3%。
附图说明
图1为本发明中动物胎盘脂多糖、多肽提取工艺路线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种猪胎盘脂多糖、多肽二联免疫增强剂，具体制备方法包括以下步骤：
1、脂多糖、多肽联产工艺
A、原料处理：经检疫合格的新鲜猪胎盘10 kg去胎膜、脐带、血块后用纯水冲洗干净，依次用绞肉机、胶体磨粉碎、研磨后，放-20℃以下冷库速冻24 h，取出37℃水浴融化，如此冻融3次，然后置于反应釜中进行消化酶解。
B、消化酶解：向反应釜中加2倍原料重的生理盐水，加入原料重量30%的新鲜胰浆，用饱和氢氧化钙调pH值至7.5，间隙搅拌下，加热至50℃，消化13 h后，加热至60℃，用超声波发生器中波处理30 min，冷却至室温。用过滤式离心机离心过滤，滤液为酶解液。滤渣为蛋白原料1。
C、冷藏离心：将酶解液用醋酸调pH值至4.0，放冷藏室静置过夜，然后高速（10000 r/min）6℃条件下离心20 min，分别收集上清液和沉淀，上清液即为脂多糖多肽粗提液，沉淀作为蛋白原料2。
D、超滤提取：将脂多糖多肽粗提液用截留分子量10万的超滤装置进行超滤，收集浓缩液1为蛋白原料3。透过液再经截留分子量1万超滤装置进行超滤，收集浓缩液2即为脂多糖提取液，透过液为多肽提纯液。
E、脂多糖热处理：将脂多糖提取液用生理盐水稀释至脂多糖含量每毫升15 mg，放100℃水浴加热40 min，降至室温，转速3000 r/min条件下离心20 min，分别收取上清液和沉淀，上清液进入层析纯化，沉淀为蛋白原料4。
F、层析纯化：将上清液过分子筛柱Sephadex G-100，用生理盐水作平衡液和洗脱液，收集脂多糖含量高的洗脱液即为脂多糖提纯液，含量低的洗脱液收集作为下次洗脱液用。
G、膜过滤精制：将脂多糖提纯液和多肽提纯液分别依次经1.0 μm、0.60 μm、0.45 μm生物膜过滤分别得脂多糖精制液和多肽精制液
H、将上述蛋白原料1、2、3、4混合，搅拌均匀，经真空干燥（65℃）制成功能蛋白粉原料应用。
2、脂多糖、多肽二联免疫增强剂生产工艺
配方（按100 mL计算）
脂多糖(即上述所得的脂多糖精制液) 5 mg
多肽(即上述所得的多肽精制液) 0.2 g
聚乙二醇4000 3 g
木糖醇 5 g
生理盐水 余 量
pH 6.5±0.2
制备方法：
A、先将聚乙二醇和木糖醇按配方称重后混合，加入总体积50%的生理盐水，搅拌均匀，加热至120℃保持30 min，密封，降至室温放置在万级净化室待用，为配料1。
B、在万级净化室内分取脂多糖精制液和多肽精制液按配方和生产用量混合后经过0.22 μm除菌膜除菌，为配料2。
C、在净化百级条件下无菌操作将灭菌后的配料1和配料2液体混合，用饱和氢氧化钙调pH值至pH 6.5±0.2，搅拌均匀，最后用灭菌生理盐水加至总体积即为二联无菌液（即本发明的二联免疫增强剂）。
D、选择好包装瓶清洗灭菌后，在净化工作台内无菌操将二联无菌液按规格要求直接灌封为口服液型，每瓶10 mL。
实施例2
一种牛胎盘脂多糖、多肽二联免疫增强剂，具体制备方法包括以下步骤：
1、脂多糖、多肽联产工艺
A、原料处理：经检疫合格的新鲜牛胎盘20 kg去胎膜、脐带、血块等附属物后用纯水冲洗干净，依次用绞肉机、胶体磨粉碎、研磨后，放-20℃以下冷库速冻48 h，取出37℃水浴融化，如此冻融5次，然后置于反应釜中进行消化酶解。
B、消化酶解：向反应釜中加3倍原料重的生理盐水，加入原料重量50%的新鲜胰浆，用饱和氢氧化钙调pH值至8.5，间隙搅拌下，加热至55℃，消化10h后，加热至60℃，用超声波发生器中波处理20 min，冷却至室温。用过滤式离心机离心过滤，滤液为酶解液。滤渣为蛋白原料1。
C、冷藏离心：将酶解液调pH值至6.0，放冷藏室静置过夜，然后高速（8000 r/min）8℃条件下离心30 min，分别收集上清液和沉淀，上清液即为脂多糖多肽粗提液，沉淀作为蛋白原料2。
D、超滤提取：将脂多糖多肽粗提液用截留分子量10万的超滤装置进行超滤，收集浓缩液1为蛋白原料3。透过液再经截留分子量1万超滤装置进行超滤，收集浓缩液2即为脂多糖提取液，透过液为多肽提纯液。
E、脂多糖热处理：将脂多糖提取液用生理盐水稀释至脂多糖含量每毫升20 mg，放120℃水浴加热60 min，降至室温，在转速5000 r/min条件下离心20 min，分别收取上清液和沉淀，上清液进入层析纯化，沉淀为蛋白原料4。
F、层析纯化：将上清液过分子筛柱Sephadex G-200，用生理盐水作平衡液和洗脱液，收集脂多糖含量高的洗脱液即为脂多糖提纯液，含量低的洗脱液收集作为下次洗脱液用。
G、膜过滤精制：将脂多糖提纯液和多肽提纯液分别依次经1.0 μm、0.60 μm、0.45 μm生物膜过滤分别得脂多糖精制液和多肽精制液。
H、将上述蛋白原料1、2、3、4混合，搅拌均匀，经真空干燥（65℃）制成功能蛋白粉原料应用。
2、脂多糖、多肽二联免疫增强剂冻干粉生产工艺
配方（按1000 mL计算，各组分按质量比）
脂多糖(即上述所得的脂多糖精制液) 200 mg
多肽(即上述所得的多肽精制液) 5 g
聚乙二醇6000 100 g
木糖醇 150 g
生理盐水 余 量
pH 7.5±0.2
制备方法：
A、先将聚乙二醇和木糖醇按配方称重后混合，加入总体积80%的生理盐水，搅拌均匀，加热至130℃保持40 min，密封，降至室温放置在万级净化室待用，为配料1。
B、在万级净化室内分取脂多糖精制液和多肽精制液按配方和生产用量混合后经过0.22 μm除菌膜除菌，为配料2。
C、在净化百级条件下无菌操作将灭菌后的配料1和配料2液体混合，用饱和氢氧化钙调pH值至7.5±0.2，搅拌均匀，最后用灭菌生理盐水加至总体积即为二联无菌液（即本发明的二联免疫增强剂）。
D、将冻干盘灭菌处理，在净化台内操作，用封口膜密封冻干盘大部分开口，留一小口将配好的二联无菌液注入冻干盘内，高度1cm，每盘约300 mL。将冻干盘放入冻干机内冻干后在无菌操作下分装于包装瓶内即为冻干粉口服剂，每瓶1.0-2.0 g。