两种含氮杂环酯类化合物在制备抗肠道病毒71型药物中的应用的制作方法

本发明属于抗病毒药物领域，具体涉及两种含氮杂环酯类化合物在制备抗肠道病毒71型的药物中的应用。

背景技术：

肠道病毒71型(EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员，是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一，有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎，脑炎，脊髓灰质炎样麻痹，神经性心肺衰竭等，甚至导致死亡。自1974年首次报道以来，EV71感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行，在亚太地区尤其是我国形势严峻。鉴于手足口病的传播流行给我国人民生命和健康带来的极大危害，我国政府已于2008年将手足口病列为丙类传染病纳入管理，并制定一系列相关法律法规，严控手足口病的流行传播。目前对于由EV71感染的疾病治疗没有特效药物，相关的疫苗于2015年才上市，其预防效果还有待进一步调查。因此开发特异有效的抗EV71药物势在必行。

酯类化合物是一类重要的精细化工产品，广泛应用于药物、材料、食品、增塑剂、溶剂等化工行业。本申请人所在项目组自主合成了上述两种具有新型结构的含氮杂环酯类化合物，并于2015年在期刊Tetrahedron Letters公开了这几种芳香酯化合物的制备方法。未对其生物学活性进行评价。

技术实现要素：

本发明的目的是提供含氮杂环酯类化合物在制备抗肠道病毒71型的药物中的应用，所述的含氮杂环酯类化合物WY209、WY210，其结构式如下式：

本发明在细胞水平发现WY209、WY210可以强烈抑制EV71病毒引起的细胞病变效应，增强感染细胞的存活率，降低子代病毒产量，并且可以抑制病毒感染引起的细胞凋亡。

本发明的第二个目的是提供一种抗肠道病毒71型的药物，包含有效剂量的作为活性成份的化合物WY209、WY210中的任意一种，或它们的盐，和药学上可以接受的载体。

进一步地，所述药物制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

由此表明化合物WY209、WY210有制备抗EV71感染的特异治疗药物的潜力，具有临床应用前景。

本发明的含氮杂环酯类化合物的制备，参照文献Tetrahedron Letters 2015，56，6136–6141的方法，具体以过渡金属钯为催化剂，在吡啶的邻位诱导作用下，在芳环的邻位用高价碘苯作用，进行芳酰氧基化，得到最终酯化产物。

本发明具有以下优点：

1、这些化合物合成原料价格低廉，易于购得；合成工艺简单，经济快速，易于大规模生产推广。

2、从结构相似的化合物中寻找抗EV71药物，易于通过构效关系探讨确认其作用靶点，为进一步药物开发提供有价值的导向作用。

附图说明

图1是化合物WY209和WY210对于EV71作用的RD细胞存活率的影响。

图2是WY209和WY210对于EV71引起的RD细胞CPE的抑制效应。

图3是WY209和WY210对于EV71引起的RD细胞凋亡的抑制作用。

图4是WY210对于EV71子代病毒产量的抑制作用。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

【实施例1】对2种含氮杂环酯类化合物抗EV71活性进行评估

1、试验方法：

1.1化合物对于宿主RD细胞的毒性

将RD细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，MTT法测定细胞存活率。SPSS 11.5软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC50)。细胞存活率＝(药物组平均OD₄₉₂值/细胞对照组平均OD₄₉₂值)×100％。

1.2化合物对于EV71的抑制活性

将RD细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100TCID50的EV71病毒液感染细胞1h，加入不同浓度的测试化合物(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的CPE病变时，显微镜下观察细胞病变效应(CPE)。CPE的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

CPE观察完毕后，利用MTT方法检测药物对EV71的抑制率。具体步骤为：每孔加入MTT 50μL(5mg·mL^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等体积的DMSO溶解沉淀。用酶标仪在492nm处读取所对应的吸光度(OD₄₉₂值)。利用如下公式计算药物对EV71的抑制率。用SPSS 11.5软件计算药物的半数有效浓度(Concentration for 50％of maximal effect，EC50)。

1.3药物的治疗指数(SI)

SI＝CC50/EC50。治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

2、试验结果

表1具有新型结构的酯类化合物细胞毒性及抗EV71活性

化合物细胞毒性及抗EV71活性测试结果如表1所示。浓度依赖的化合物对于EV71作用的RD细胞存活率的影响如图1所示。本发明检测到WY209和WY210对于EV71有强的抑制活性，优于阳性对照化合物利巴韦林。其中WY210有更好的抑制效果，WY209抗EV71活性有所下降，但毒性也明显降低，所以两种化合物有较高且相似的治疗指数。化合物WY209和WY210抑制EV71引起的RD细胞CPE效应如图2所示。EV71感染的RD细胞变圆，从细胞板壁脱离，WY209和WY210(40μg/mL)处理对于其病变效应有一定的抑制作用，WY210有强的抑制效果，可以几乎完全抑制EV71引起的RD细胞病变效应，抑制率达94％。

【实施例2】WY209和WY210对于EV71引起的RD细胞凋亡的抑制作用

1、试验方法

对数生长期的RD细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID50EV71感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，加入含40μg/mL WY209和WY210的细胞维持液。大约48h后，收集细胞，运用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒在流式细胞仪上进行细胞凋亡的检测。

2、试验结果

实验结果如图3表明，40μg/mL WY209和WY210可以有效抑制EV71导致的细胞凋亡。在病毒对照组细胞凋亡率为85.96％(图3-b)，正常未处理细胞凋亡率0.83％的情况下(图3-a)，40μg/mL WY209和WY210处理的细胞凋亡率分别有19.17％和11.84％(图3-c，d)，可见WY209和WY210可以有效保护EV71导致的细胞凋亡。

【实施例3】WY210对于EV71子代病毒产量的抑制作用

1、试验方法

对数生长期的RD细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID₅₀EV71感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗涤三次，加入含40μg/mL WY210的细胞维持液。48h后收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，TCID₅₀方法测定EV71病毒滴度。

2、试验结果

如图4所示，WY210处理的RD细胞相对于病毒对照组，其病毒滴度显著下降，说明了化合物对于EV71子代病毒产量强烈的抑制作用。

综上所述，具有新型结构的酯类化合物WY209和WY210具有较强的抑制EV71活性，其中WY210具有更佳的抑制效果，可以强烈抑制EV71病毒在RD细胞中的复制，有潜力制备一种临床上有效对抗EV71感染的药物。