一种丝素蛋白改性的骨水泥多孔支架及制备和应用的制作方法

本发明涉及一种生物医用材料技术领域的方法，具体是一种丝素蛋白改性的磷酸钙类骨水泥多孔支架及制备方法和应用，以自制的α-TCP为粉末主体，使用盐粒为致孔剂制备多孔支架后浸泡在丝素蛋白溶液中，取出后干燥使支架表面附着一层丝素蛋白，制备得到丝素蛋白表面改性的骨水泥多孔支架。

背景技术：

磷酸钙类骨水泥由于其具备良好的生物相容性以及骨诱导性，在骨损伤修复方面具有广阔的应用前景。磷酸钙类骨水泥通常由两种或以上磷酸钙盐的粉末混合后与固化液在一定的固液比例下调匀，发生水化反应，能在室温或人体环境中自固化，具有自由塑形、固化温和的特点。α-TCP [α相-磷酸三钙]常应用于磷酸钙类骨水泥的粉体，能与中性固化液在室温发生水化反应，生成主要成分为羟基磷灰石的磷酸钙骨水泥，与人体骨的无机成分相似。目前市场上对于磷酸钙类骨水泥的使用，一种是应用于微创手术的注射型骨水泥，一种是经过体外塑形固化后，制备成骨棒、骨块等骨水泥支架，用于开放式手术的骨损伤修复。其中，磷酸钙类骨水泥多孔支架由于增加了材料的表面积，一方面可为细胞粘附提供更大的空间，促进骨细胞生长，并允许血管组织在内部生长[Yao Jun, et al, Biomaterials, 2005]，另一方面有利于材料与体液充分接触，加快材料的降解。

骨损伤修复过程中，受创的毛细血管内皮分裂、增生，向损伤内部延伸，在血管内血液的冲击下逐渐形成管腔，再经过一系列过程形成相应的血管平滑肌及外膜，完成骨血管再生过程[Ausprunk DH, MicrovascRec, 1997]。血液的供应对骨组织再生有积极促进作用，充足的血供确保了骨折修复需要的血液细胞成分的释放。丝素蛋白具有良好的生物相容性和生物可降解性，对表皮细胞的生长具有促进作用，以丝素蛋白为支架构建材料的组织工程研究中，常将其作为一种膜修复材料广泛应用于血管、皮肤、人工韧带等组织的修复[王宏昕, 中国修复重建外科杂志, 2007]。

在磷酸钙类骨水泥的研究中，丝素蛋白常用于增强剂使用，通过丝素纤维与骨水泥粉末的复合，增加固化后骨水泥的力学性能，而忽视了丝素蛋白在血管修复方面的优势，大大限制丝素蛋白在骨修复上的应用。本发明针对以上背景，利用磷酸钙类骨水泥的骨传导性、骨诱导性的优势，同时结合丝素蛋白及骨水泥多孔结构在骨血管修复方面的优势，提出一种丝素蛋白改性的骨水泥多孔支架的制备方法，使骨细胞在材料上粘附生长的同时加速骨血管的修复，进而加速骨组织的愈合。

技术实现要素：

为克服现有技术的不足，本发明提供一种丝素蛋白改性的骨水泥多孔支架及制备和应用，开发出一种满足临床需求的新型骨修复材料。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：将摩尔比为2:1的磷酸氢钙与碳酸钙粉末充分混合；采用固相反应法，通过控制反应条件，制备得到作为骨水泥粉末主体的α-TCP粉末；研磨盐粒并过筛得到粒径大小100-300μm的盐颗粒，与α-TCP充分混合制备出骨水泥粉末；与固化液混合固化，放入37℃水浴浸泡24h使盐粒溶解得到骨水泥多孔支架；将该支架放入质量分数为5-30%的丝素蛋白溶液中浸泡24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，制备得到丝素蛋白表面改性的骨水泥多孔支架。

一种丝素蛋白改性的骨水泥多孔支架的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）采用固相反应法将原料磷酸氢钙与碳酸钙按摩尔比2:1充分混合后，在1250-1400℃煅烧2-4h并急速冷却至室温，制备α-TCP粉末，产物经湿法球磨控制粒径在2-4μm；

（2）以上述α-TCP粉末为主体，以粒径为100-300μm盐粒为致孔剂，质量分数为0.5-5%的磷酸氢二钠溶液作为骨水泥固化液，将粉末充分混合之后与固化液按一定比例调和并固化，于37℃水浴中浸泡除去致孔剂，制备骨水泥多孔支架；

（3）将上述多孔支架浸泡于质量分数为5-30%的丝素蛋白溶液中24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，制备得到丝素蛋白表面改性的骨水泥多孔支架。

步骤（1）所述的固相反应法的原料混合方式为使用无水乙醇为介质的湿法球磨，转速为400rpm，球磨时间为1-4h，球料比为质量比3:1。

步骤（1）所述的产物球磨方式为使用无水乙醇为介质的湿法球磨，转速为400rpm，球磨时间为6h，球料比为质量比4:1。

步骤（2）所述的致孔剂是经研磨后过筛所得，混合比例为质量分数10-50%，混合方式为使用研钵混合或干法球磨。

步骤（2）所述的骨水泥粉末与固化液的比例为1.0g/mL-2.0g/mL。

一种丝素蛋白改性的骨水泥多孔支架，其特征在于，根据上述任一所述方法制备得到。

一种丝素蛋白改性的骨水泥多孔支架的应用。

本发明包括以下步骤：

1、将磷酸氢钙与碳酸钙混合均匀，其为摩尔比2:1。所述混合方式为使用无水乙醇为混合介质的球磨混合，转速400rpm，球磨时间为1-4h，混合后的悬浊液通过旋转蒸发除去乙醇后放入60℃烘箱中干燥。

2、将干燥后的磷酸氢钙与碳酸钙混合物在1250-1400℃炉中锻烧2-4h后取出，在鼓风环境下急速冷却，得到α-TCP粉末，之后采用湿法球磨的方式得到粒径均一的α-TCP粉末，其粒径范围在2-4μm。干燥后备用。

3、将粗盐粒研磨后过筛，筛分出粒径大小在100-300μm范围内的盐颗粒。所述研磨方式可为使用研钵研磨或干法球磨。

4、配制质量分数为0.5-5%的磷酸氢二钠溶液作为骨水泥固化液。所述配制方法为室温下的搅拌溶解或超声助溶。

5、将α-TCP粉末与盐粒按质量比10-50%充分混合，与固化液按一定比例混合后填入模具，充分固化后放入37℃水浴浸泡24h，得到磷酸钙骨水泥多孔支架。所述粉末的混合方式可为使用研钵研磨或干法球磨；所述粉末与固化液的比例为1.0g/mL-2.0g/mL。

6、将骨水泥多孔支架放入质量分数为5-30%的丝素蛋白溶液中浸泡24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，制备得到丝素蛋白表面改性的骨水泥多孔支架。

使用羟基磷灰石骨水泥作为骨架，表面使用丝素蛋白改性，与人体骨结构更为相似；在骨修复过程中，材料多孔内部的丝素蛋白表面有利于血管细胞的粘附生长，加速骨血管的修复，同时骨细胞也利于在孔道中生长，进而促进骨组织的愈合。

本发明提供的骨水泥多孔支架的制备方法，其所用原料简单，制备过程简易，可大规模生产。该丝素蛋白改性的骨水泥多孔支架符合临床应用对综合性能的要求，且具备促进细胞生长的能力，在临床骨组织修复领域有广阔的应用前景。

本发明的优点在于：

1、使用丝素蛋白进行磷酸钙类骨水泥的表面改性，使其更利于血管表皮细胞的粘附，结合骨水泥多孔支架的内部结构，加速骨缺损修复过程中的骨血管新生，进而促进骨组织愈合。

2、制备方法简便，所用原料简单，适于大量生产。

附图说明

图1是本技术所制备骨水泥多孔支架的SEM电镜扫描结果，孔径大小为50-300nm。

图2是本技术所制备骨水泥多孔支架以NIH3T3细胞为对象的细胞增殖试验结果，测试方法为实施例1所述，其中样品①-③分别对应实施例2-4的骨水泥配方。

具体实施方式

以下实施例以发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。

实施例1

（1）α-TCP粉末制备：

按摩尔比2:1称量磷酸氢钙粉末和碳酸钙粉末，使用适量无水乙醇为介质湿法球磨，转速400rpm，球磨时间4h，球磨珠与粉末质量比为3:1。原料混合液通过旋转蒸发除去乙醇，置于60℃烘箱中干燥24h。将干燥后的粉末置于马弗炉中，1400℃煅烧2h后取出，在鼓风环境下急速冷却。将冷却后的粉末以无水乙醇为介质湿法球磨，转速400rpm，球磨时间为6h，球磨珠与粉末质量比为4:1。粉末悬浊液置于80℃烘箱中充分干燥，制备得到α-TCP粉末。

（2）丝素蛋白的制备：

将蚕丝脱胶处理，溶解在氯化钙、乙醇和去离子水的混合溶液中，经过透析得到丝素蛋白溶液，在60℃烘箱中自然干燥制备得到水溶性的丝素蛋白粉末。

（3）细胞增殖试验方法：

制备直径6mm，高2mm的多孔支架，在75%乙醇溶液中灭菌15min，用培养基浸泡过夜，试验组样品干燥后浸泡于不同浓度的丝素蛋白溶液中24h，取出后置于60℃烘箱中干燥；对照组为不含样品的空白对照，结果如图2（0）所示。将对照组和试验组样品置于96孔板中，每个样品设置6个平行样，将含有NIH3T3细胞10000个/mL的细胞培养液100μL滴加于样品孔中，培养24h、48h、72h。加入含体积分数10%cck-8试剂的培养基孵育2-4h，在450nm波长下测量紫外吸收，得到细胞增殖试验结果。

实施例2

将实施例1制备的α-TCP与粒径为100-300μm盐粒按质量比8：2混合，得到骨水泥粉末，将其与质量分数2%的磷酸氢二钠溶液按1.5g/mL的固液比进行调和，充分固化后置于37℃水浴浸泡24h除去盐粒，得到骨水泥多孔支架。将上述支架浸泡于质量分数10%的丝素蛋白溶液中24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，得到丝素蛋白改性的骨水泥多孔支架。其SEM电镜扫描结果如图1所示，孔隙率为38%，采用实施例1所述方法进行细胞增殖试验，结果如图2（①）所示。

实施例3

将实施例1制备的α-TCP与粒径为100-300μm盐粒按质量比7：3混合，得到骨水泥粉末，将其与质量分数2%的磷酸氢二钠溶液按1.5g/mL的固液比进行调和，充分固化后置于37℃水浴浸泡24h除去盐粒，得到骨水泥多孔支架。将上述支架浸泡于质量分数10%的丝素蛋白溶液中24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，得到丝素蛋白改性的骨水泥多孔支架。孔隙率为46%，采用实施例1所述方法进行细胞增殖试验，结果如图2（②）所示。

实施例4

将实施例1制备的α-TCP与粒径为100-300μm盐粒按质量比7：3混合，得到骨水泥粉末，将其与质量分数2%的磷酸氢二钠溶液按1.5g/mL的固液比进行调和，充分固化后置于37℃水浴浸泡24h除去盐粒，得到骨水泥多孔支架。将上述支架浸泡于质量分数20%的丝素蛋白溶液中24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，得到丝素蛋白改性的骨水泥多孔支架。孔隙率为45%，采用实施例1所述方法进行细胞增殖试验，结果如图2（③）所示。