本发明涉及医药领域，具体涉及三十烷醇作为COX-2和VEGF抑制剂，以及在制药及保健品中的应用。
背景技术：
：三十烷醇，分子式为C30H62O，结构式为CH3-(CH2)28-CH2-OH，CAS号：593-50-0。三十烷醇主要来源于米糠蜡、蜂蜡、甘蔗中，农业上作为广谱性植物生长促进剂。但在医药应用中，除古巴、美国以二十八烷醇为主要成分开发的保健品外，有关三十烷醇的报道很少。G.Thippeswamy等发表的文章“OctacosanolisolatedfromTinosporacordifoliadownregulatesVEGFgeneexpressionbyinhibitingnucleartranslocationofNF-<kappa>BanditsDNAbindingactivity”表明，二十八烷醇可抑制内皮细胞和艾氏腹水癌细胞增殖、鸡胚绒毛尿囊膜和大鼠角膜血管新生以及癌性腹水的分泌，其机制与二十八烷醇抑制肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)有关，但是关于三十烷醇并没有相关的报道。有关三十烷醇在药物中的应用，申请号为CN200710066112.7的中国专利公开了三十烷醇在制备治疗高血脂疾病中的应用，申请号为CN200610048846.8、CN200910146061.8的中国专利公开了三十烷醇对肝癌、肠癌、肺癌等具有不同程度的疗效，但其作用机制和靶点尚不明确。目前尚未检索到关于三十烷醇作为COX-2和VEGF抑制剂的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种COX-2和VEGF抑制剂。本发明的另一目的是提供三十烷醇作为COX-2和VEGF抑制剂的应用。本发明所述的COX-2和VEGF抑制剂由重量百分比5-95％的三十烷醇和余量的药用辅料组成。由于三十烷醇为单一活性成分，药用辅料仅只是作为赋型剂，所以三十烷醇在其中含量并不是重要的因素，只要能成药即可，一般为10-50％。所述的药用辅料为常用药用辅料，如：聚乙二醇、羧甲基纤维素钠中的一种或两种。三十烷醇也可以与其它药用成分如环磷酰胺配伍，作为COX-2和VEGF的抑制剂。三十烷醇的加入可以大大降低环磷酰胺的副作用。具体见后面的试验。本发明涉及三十烷醇为单一活性成分或者与其它药用成分配合作为制备COX-2和VEGF抑制剂的药物中的应用。本发明涉及三十烷醇为单一活性成分或者与其它药用成分配合作为制备COX-2和VEGF抑制剂的保健品中的应用。本发明首次发现三十烷醇具有抑制COX-2和VEGF的活性，通过抑制COX-2和VEGF的活性可以达到阻止癌细胞的增生和转移的作用。COX-2(环氧合酶-2)与肿瘤的发生发展关系密切，通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、促进肿瘤新生血管形成等机制，参与多种肿瘤的发生、发展，COX-2已成为肿瘤的一个重要的治疗靶分子。COX-2的过表达能够促进肿瘤组织中微血管的生成。作用于COX-2抑制剂的昔布类可用于预防和治疗肿瘤，美国FDA在1999年批准昔布类抗炎药用于人家族性腺瘤性息肉(FAP)辅助治疗，但其严重心血管副作用限制了它的应用，默克公司的罗非昔布已撤出市场。作用于VEGF抑制剂的贝伐单抗在2004年2月26日获得FDA的批准，是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药。血管内皮生长因子(VEGF)又称血管渗透性因子(VPF)，是血管生长因子中具有高度特异的促新生血管形成作用的因子，是COX-2促血管形成作用的最重要的相关因子，在肿瘤血管新生的过程中起着重要的作用，是肿瘤生长和转移过程中很重要的因素。COX-2可能通过PGs途径上调VEGF的表达，从而参与肿瘤组织中新生血管的生成，这可能是COX-2促进肿瘤生长、浸润、转移的机制。癌症免疫治疗是癌症治疗领域的研究热点，位于2013年《科学》十大突破之首。自然杀伤(NK)细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，属于一类独立的淋巴细胞。该细胞群是抗肿瘤的第一道防线，无需抗原预先致敏即可直接识别和杀伤肿瘤细胞，能发挥特异性杀伤靶细胞的作用，尤其是对多种肿瘤细胞有快速杀伤和溶解的作用。本发明阐明了三十烷醇通过选择性抑制COX-2和VEGF，发挥抗肿瘤作用。试验结果显示：三十烷醇可以通过选择性抑制COX-2发挥抗肿瘤作用，通过抑制VEGF的表达发挥抗新生血管生成的作用。同时，三十烷醇能够提高机体免疫功能，剂量依赖性的激活小鼠NK细胞的活性，同时能明显促进小鼠脾淋巴细胞的增殖和溶血素抗体的生成，拮抗环磷酰胺所致的白细胞数降低的作用。本发明揭示了三十烷醇作为单一活性成分或者与其它药用成分配合作为制备COX-2和VEGF抑制剂的药品和保健品中的应用。可以制成片剂、颗粒剂、硬胶囊、软胶囊、干混悬剂、冻干粉针剂、口服液、滴丸或口腔速崩片。三十烷醇作为单一活性成分其有效剂量范围为5mg-2000mg。药效学试验：1：三十烷醇对裸鼠COX-2表达的影响实验设备：5％CO2孵箱、无菌实验台、离心机、电冰箱、超低温冰箱、无菌细胞间、超纯水系统、液氮罐。主要试剂：台盼蓝、Tween-80(产品编号：T8360)、羧甲基纤维素钠(产品编号：C8621)、胎牛血清(南美血源，产品编号：FBS-12A-100)、胰蛋白酶(货品编号：M0043)、RPMI-1640培养基(产品编号：C11875500bt，GIBCO)、PBS、三十烷醇(昆明龙津药业股份有限公司，批号：20140716)、塞来昔布(产品编号：169590-42-5，武汉胜天宇生物科技有限公司)、免疫组化试剂盒:兔免疫组化试剂盒(编号：PV-9001，北京中杉金桥)、DABKIT3ml(产品编号：ZLI-9018，北京中杉金桥)；RabbitantiCOX-1/Cyclooxygenase-1Polyclonalantibody(产品编号：13393-1-AP，Proteintech)、COX-2环氧化物酶(产品编号：ZA-0515，北京中杉金桥)。主要材料：人结肠癌HT-29细胞株(重庆医科大学附属第一医院分子肿瘤及表观遗传学重庆市重点实验室赠送)；4～6周龄BALB/c雌性裸鼠30只(体重15-20g)，购自重庆医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK(京)2014-0004)。主要试剂的配制：受试化合物配制方法：0.5％羧甲基纤维素钠：精确称取羧甲基纤维素钠500mg加入煮沸的蒸馏水100ml，不断搅拌，直至液体澄清，常温静置一夜。三十烷醇剂量设置：高剂量组：精确称取200mg三十烷醇加入吐温-801ml充分搅拌混匀，加入0.5％羧甲基纤维素钠12.3ml，充分搅拌直至呈均匀一致的混悬液13.3ml，浓度为15mg/ml。中剂量组：精确称取200mg三十烷醇加入吐温-801ml充分搅拌混匀，加入0.5％羧甲基纤维素钠25.7ml，充分搅拌直至呈均匀一致的混悬液26.7ml，浓度为7.5mg/ml。低剂量组：精确称取200mg三十烷醇加入吐温-801ml充分搅拌混匀，加入0.5％羧甲基纤维素52.3ml，充分搅拌直至呈均匀一致的混悬液53.3ml，浓度为3.75mg/ml。阳性对照药物塞来昔布的配制：精确称取200mg塞来昔布粉末，加入吐温-801ml充分搅拌混匀，加入0.5％羧甲基纤维素钠25.7ml，充分搅拌直至呈均匀一致的混悬液26.7ml，浓度为7.5mg/ml。实验步骤：三十烷醇对裸鼠移植瘤生长的影响细胞培养及移植瘤模型的建立：用培养基悬浮，取10μl细胞悬液，加入台盼蓝10μl，细胞计数板进行计数活细胞。10mlPBS洗细胞，1000r/min，3min，3次。用不含血清的培养基将细胞制成单细胞悬液，调细胞浓度使每0.2ml细胞悬液含3×106个细胞。4-6周龄雌性裸鼠，体重15-20g，无菌条件下，以1ml注射器再次将细胞悬液混匀，抽取细胞悬液0.2ml，排尽空气备用。于拟成瘤点靠近尾端0.5-1cm处进针，缓慢将细胞悬液注入，共30只。种瘤后密切观察，待裸鼠成瘤后记录裸鼠体重和瘤体大小，观察裸鼠生长状况。种瘤后第10天裸鼠移植瘤成瘤率100％。待裸鼠移植瘤大小约50-100mm3，30只裸鼠分成5个小组，每组6只灌胃：三十烷醇低剂量组(37.5mg/kg.d)、中剂量组(75mg/kg.d)、高剂量组(150mg/kg.d)、塞来昔布组(75mg/kg.d)、空白对照组(生理盐水组)，每日1次。给药4周后颈椎脱位法处死裸鼠，取肿瘤组织。用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b)，然后计算以下指标：体积：V＝ab2/2；抑瘤率＝[(V对照组-V实验组)/V对照组]×100％。移植瘤标本的处理及免疫组化检测COX-1和COX-2的表达：移植瘤与正常组织分界清楚，呈鱼肉状、质软、易碎，PBS清洗，逐个编号后一部分放入标本管中，于液氮中保存。一部分于4％多聚甲醛中固定24-48h。标本充分固定后脱水、透明、包埋、切片以进一步处理。切片后行HE染色及按PV-9001免疫组化(Biotin-StrePtavidinHRPDetectionSystems)及ZLI-9018DABKit的操作步骤进行COX-1(抗体浓度1:200)、COX-2(抗体浓度1：200)的免疫组织化学染色。采用ImageProPlus软件测量各组高倍镜图片的平均OD值(总OD值/Area)。统计方法：采用IBMSPSSStatistics22统计软件对肿瘤大小和各组400倍图片的平均OD值(总OD值/Area)行单因素方差分析，组间两两比较采用Post-hoc(LSD)分析。以P<0.05为差异有统计学意义。实验结果：三十烷醇对裸鼠移植瘤生长的影响(表1)。表1各组裸鼠体积(mean±SDmm3)及抑瘤率％的表达组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组塞来昔布组裸鼠n66666体积799±430458±227656±221429±262729±289抑瘤率(％)42.6817.9046.30*8.76三十烷醇高剂量组与对照组比较，其肿瘤生长显著减慢，抑瘤率46.30％，*(P<0.05)。各组移植瘤COX-1、COX-2表达的比较(表2)。HE染色各组镜下均可见中间大片坏死组织，坏死边缘可见散在的炎症细胞，坏死组织边缘部分为未坏死的肿瘤组织。光镜下移植瘤细胞排列失去正常结构，细胞密集分布，细胞核蓝染，核质比例明显增大，细胞异型性显著。COX-1和COX-2染色，胞质中可见棕色或者黄色染色区域，为阳性染色。表2各组免疫组化的平均OD值用(mean±SD)表示对COX-1的免疫组织化学染色切片进行光密度值测定，方差分析显示，与对照组相比，各组COX-1的表达差别无统计学意义(P>0.05)。对COX-2的免疫组织化学染色切片进行光密度值测定，方差分析显示(表2)，与对照组相比，塞来昔布组、低剂量组、中剂量组、高剂量组COX-2的表达均显著减低，*(P<0.05)。实验结论：与对照组比较，高剂量组三十烷醇对裸鼠移植瘤的生长有显著抑制作用。三十烷醇各剂量组及塞来昔布组对HT-29裸鼠移植瘤COX-2的表达有抑制作用，但对COX-1的表达无抑制作用。三十烷醇与COX-2的相互作用模式预测，利用花生四烯酸与COX-2的共结晶结构1CVU，分子对接三十烷醇与COX-2的可能的结合模式(有两种)并与花生四烯酸的结合模式比较，结论是两者的结合模式非常相似，三十烷醇也可能是COX-2的抑制剂。2：三十烷醇抑制LOVO结肠癌细胞裸鼠移植瘤生长及转移实验实验设备：同上。主要实验试剂：同上。塞来昔布胶囊(西乐堡)(产品批号：M72189；分包装批号：N07162)、免疫组化试剂盒：兔免疫组化试剂盒(编号：SP-9001，北京中杉金桥)、VEGFAntibody50ul(产品编号：19003-1-AP，proteintech)；PTGS2Rabbitpolyclonalantibody50ul(产品编号：12375-1-AP，proteintech)、HE染色试剂盒(产品编号：M2314)、1％戊巴比妥钠。主要试剂的配制：同上。其中塞来昔布浓度为6mg/ml。主要材料：人结肠癌LOVO细胞株(重庆医科大学附属第一医院分子肿瘤及表观遗传学重庆市重点实验室赠送)；4～6周龄BALB/c雌性裸鼠50只(体重15-20g)，购自重庆医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK(京)2014-0004)。实验步骤：细胞复苏及培养：取冻存管，快速放入37℃温水中，轻轻摇动令其快速融化，待剩下黄豆大小时拿出，使余热将其融化。取出15ml离心管一只，预先加入5mlDMEM/F12完全培养基,1000r/min离心，3min，去上清液。取上述LOVO细胞加入1mlDMEM/F12完全培养基混匀，移入培养瓶中，加入4ml培养基补齐，放入CO2培养箱中静置培养。待培养基颜色变为黄色时需换夜，换液时间1天，传代时间为3天，按1:3的比例传。用LOVO细胞建立裸鼠移植瘤模型：用培养基悬浮，取10μl细胞悬液，加入台盼蓝10μl，细胞计数板进行计数。10mlPBS洗细胞，1000r/min，3min，3次。用不含血清的培养基将细胞制成单细胞悬液，调细胞浓度使每0.2ml细胞悬液含3×106个细胞。4-6周龄雌性裸鼠，体重15-20g，无菌条件下，以1ml注射器再次将细胞悬液混匀，抽取细胞悬液0.2ml，于拟成瘤点靠近尾端0.5-1cm处进针，缓慢将细胞悬液注入，拔针，碘伏棉签压迫进针点2min，共50只。种瘤后第10-14天裸鼠移植瘤成瘤率80％。裸鼠背部种瘤处出现球形、椭圆形、不规则的包块，边界清楚，质地较周围正常组织韧。种瘤后18日，将肿瘤平均体积为50-100mm3的35只裸鼠平均分为5组：三十烷醇高剂量组(150mg/kg.d)、中剂量组(75mg/kg.d)、低剂量组(37.5mg/kg.d)、塞来昔布组(60mg/kg.d)、空白对照组(生理盐水组)。分别按照剂量要求进行灌胃，每次灌胃体积为0.2ml，每日1次。实验结束计算肿瘤体积和抑瘤率。移植瘤标本处理：0.2ml的1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸鼠，颈椎脱臼法将裸鼠处死，取出移植瘤，多聚甲醛固定的组织通过脱水、透明、浸蜡和包埋等步骤制成石蜡包埋块。切片后HE染色，按SP-9001SPlinkDetectionKits(Biotin-StreptavidinHRPDetectionSystems)及ZLI-9018DABKit的操作步骤进行VEGF(抗体浓度1:200)的免疫组织化学染色。统计方法：同上。实验结果：三十烷醇对裸鼠移植瘤生长及转移的影响。低剂量组、中剂量组、高剂量组、塞来昔布组的抑瘤率分别为33.33％、52.05％、70.77％、61.60％。与对照组比较，低剂量组移植瘤体积无显著性差异(P>0.05)。中剂量组、高剂量组、塞来昔布组与对照组比较，其移植瘤生长显著减慢，*P<0.05，见表3。表3治疗结束后裸鼠肿瘤体积大小(mean±SDmm3)及其抑瘤率％组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组塞来昔布组裸鼠n77777体积mm31047±647698±448502±304306±237402±215抑瘤率％-33.3352.05*70.77*61.60*裸鼠肝脏：将裸鼠处死后，观察肝脏，可见肝脏上有大小不等的灰白色结节，对照组肝脏转移结节较大，数目很多，4只几乎布满肝脏，3只靠近肝脏边缘结节数目多，近中央结节数目较少，无法计数。低剂量组肝脏转移结节较多，有2只裸鼠肝脏布满结节，2只近肝脏边缘结节数目较多，无法计数，余下3只平均结节数目为5-10个。中剂量组和塞来昔布组肝脏转移结节较小，平均为2-7个/只。高剂量组肝脏转移结节较小，2只未见到结节，余下5只平均为2-3个/只。移植瘤及肝的HE染色：各组肿瘤组织于显微镜下均可见中间大片坏死组织，坏死边缘可见散在的炎症细胞，坏死组织边缘部分为未坏死的肿瘤组织。光镜下移植瘤细胞排列失去正常结构，杂乱排列，细胞密集分布或排成腺管状，细胞核蓝染，核质比例明显增大，细胞异型性显著。各组肝组织于显微镜下观察可见肝脏组织中出现不同于正常肝组织的形态不规则的团块状或片状细胞，细胞异型性较大，核浆比例大，细胞核大小不一。移植瘤VEGF的免疫组化结果：VEGF免疫组化分布范围较广，胞质、胞核和间质均有表达。对VEGF的免疫组织化学染色切片进行光密度值测定，方差分析显示，与对照组相比，小剂量组VEGF的表达降低，但无统计学意义(P>0.05)，塞来昔布组、中剂量组、高剂量组VEGF的表达均显著减低，*P<0.05，见表4。表4各组VEGF免疫组化图片的平均OD值用mean±SD表示组别样本量(n)平均IOD空白对照组70.10750±0.06755低剂量组70.07556±0.03401中剂量组70.04782±0.02808*高剂量组70.03952±0.02121*塞来昔布组70.05301±0.04789*实验结论：和阴性对照组相比，不同剂量组三十烷醇对转移性结肠癌裸鼠移植瘤的生长均有不同程度的抑制作用。高剂量组和中剂量组三十烷醇对LOVO细胞裸鼠移植瘤VEGF的表达有抑制作用，可抑制结肠癌裸鼠肝转移。3：三十烷醇对移植于裸鼠的人体肿瘤胃癌MNK-45的疗效实验实验材料：吐温80、0.5％CMC-Na、生理盐水。环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞制药有限公司，批号：11030921，以生理盐水溶解。瘤源：由上海医药工业研究院药理评价研究中心传代维持。瘤源：由上海医药工业研究院药理评价研究中心传代维持，将体外的细胞株转化至免疫缺陷裸小鼠体内传代待生长至第二代后使用。实验动物：裸小鼠由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供。合格证号：SCXK(沪)2003-0003。裸小鼠为6周龄。雌雄皆可，每次使用同一性别小鼠。动物数：试验组及阳性对照组裸小鼠每组6只，阴性对照组为12只。动物饲养环境：裸小鼠置于层流架中SPF条件饲养，所应用的饲料、垫料、笼具及接触的器械等均应高压消毒后使用。实验主要步骤：无菌条件下取体内生长旺盛的人体肿瘤第2代后异种移植模型为瘤源，制备成瘤块，于裸小鼠右腋皮下接种约2mm3/鼠，次日随机分组，待肿瘤触及约为100mm3开始给药，每隔3-5天动态测试各组荷瘤鼠肿瘤生长的大小及荷瘤鼠体重，用卡尺测量荷瘤鼠肿瘤的短径(a)及长径(b)，按(a2×b)/2公式计算肿瘤体积。实验约四周左右处死各组动物，剖取的肿瘤称重按下列公式计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率％＝[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％合并用药的效应根据金氏公式计算Q值：Q＝Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)Ea+b为合并用药的抑瘤率，Ea和Eb分别为A药和B药的抑瘤率。如Q值0.85-1.15为相加(+)，﹥1.15为增强(++)。表5三十烷醇对人胃癌MKN-45裸鼠异种移植模型抗肿瘤疗效与溶剂对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。表6三十烷醇合并环磷酰胺对人胃癌MKN-45裸鼠异种移植模型抗肿瘤疗效与溶剂对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。4：三十烷醇对小鼠脾淋巴细胞增殖及NK细胞活性的影响三十烷醇配制方法：精确称取所需样品，以少量吐温80助溶后逐渐加入0.5％CMCNa溶液待充分混匀后稀释至所需浓度即可。给药体积为0.5ml/20g鼠。实验材料：吐温80、0.5％CMC-Na。香菇多糖，武汉迪奥药业有限公司，批号20100202。DMEM完全培养基，内含10％新生牛血清(GIBCOBRL)、巯基乙醇、HEPES等。3H-TdR:放射性浓度：1mci/ml，购自上海原子核研究所。刀豆蛋白A：50μg/ml，购自Sigma公司。YAC-1细胞：上海医药工业研究院药理评价研究中心传代维持。实验动物：品系：C57BL/6(SPF级)，购于上海斯莱克实验动物责任有限公司，动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005，体重为18-20g/6周龄。性别：雄性。动物数：试验组、阴性对照组及阳性对照组每组10只。实验方法：NK细胞活性的测定：将C57BL/6小鼠随机分组，每组10只，按剂量连续给药两周，最后一次给药结束后处死小鼠，无菌条件下取脾脏，置于小容器中，用手术剪刀将脾脏剪碎，分离细胞，经几次自然沉降分离脾细胞，用DMEM培养基制成细胞悬液，将脾细胞调整至1×106/ml，加入100μl到96孔板中作为效应细胞。另取处于生长对数期的YAC-1细胞，调整细胞浓度为1×104/ml，作为靶细胞，以靶细胞与效应细胞之比为1:100的浓度加在96孔细胞培养板上，同时加入0.5μci/孔的3H-TdR同位素。每组设置10个复孔，在37℃二氧化碳培养箱中培养24小时，用多头细胞器收集细胞，在液闪仪上测定CPM值，计算特异性抑制百分率(Pi)表示NK细胞活性。其中Pi＝1-(实验组掺入CPM值/对照组掺入CPM值)×100％。小鼠脾淋巴细胞增殖的测定：将C57BL/6小鼠随机分组，每组10只，按剂量连续给药两周，最后一次给药结束后处死小鼠，无菌条件下取脾脏，置于小容器中，用手术剪刀将脾脏剪碎，分离细胞，经几次自然沉降分离脾细胞，用DMEM培养基制成细胞悬液，将脾细胞调整至1×107/ml，在无菌的96孔培养板中加入脾细胞100μl，同时加入1mg/ml的刀豆蛋白A50ul，在37℃二氧化碳培养箱中培养48小时后加入0.5μci/孔的3H-TdR同位素，继续培养24小时。该实验每组设置10个复孔，对照组用培养基代替脾细胞。培养结束后在多孔细胞收集器中收集细胞，5％TCA固定，无水乙醇脱水，液闪仪上测定CPM值。结果表明，三十烷醇样品能够剂量依赖性的激活小鼠NK细胞的活性，同时也能够明显促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。详见表7～8。表7三十烷醇对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。表8三十烷醇对小鼠NK细胞活性的影响组别CPM值Pi(％)三十烷醇高剂量组6856±939.3**66三十烷醇中剂量组6890.2±602.8**65三十烷醇低剂量组9759.8±648.0**51香菇多糖6276.4±559.5**68对照19919.9±622.8与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。5：三十烷醇对小鼠溶血素的影响实验材料：昆明种小鼠，雄性，18-20g，由上海斯莱克动物责任有限公司提供。合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验剂量：实验剂量设计为：150mg/kg，75mg/kg，37.5mg/kg。阳性药：香菇多糖，批号：20100202，生产单位：武汉迪奥药业有限公司。实验剂量：50g/kg。给药途径及容量：灌胃给药，0.5ml/20g。实验方法：小鼠随机分组，三十烷醇高、中、低各3个剂量组，阳性药组，空白模型组。每组10只。鸡红细胞用生理盐水洗涤3次，配成5％混悬液即可，补体以2只豚鼠血清混合，用生理盐水配成10％浓度。每鼠腹腔注射5％生理盐水鸡红细胞混悬液0.2ml进行免疫，同时开始给药，免疫后7日，最后一次给药1h摘眼球取血，离心，取血清用生理盐水稀释100倍，取稀释血清1ml，与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml混合，37℃恒温箱保温30min后，置0℃冰箱中中止反应。离心，取上清液于722分光光度计540nm处比色，测录光密度(OD)，另设不加血清的空白对照，取其上清液作为比色时调“0”的基准以OD值作为判定血清溶血素的指标，比较各组的差异。实验结果：三十烷醇高、中、低剂量组对小鼠溶血素抗体生成具有明显促进作用，说明该药可增强体液免疫，见表9。表9三十烷醇对小鼠溶血素的影响组别剂量(mg/kg)动物数(只)OD值三十烷醇高剂量组150102.611±0.646**三十烷醇中剂量组75102.477±0.595**三十烷醇低剂量组37.5102.250±0.702**阳性药50102.398±0.789**空白模型组-101.692±0.257各组与空白模型组比较：*P＜0.05；**P＜0.01。6：三十烷醇对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响实验材料：同上。实验方法：小鼠随机分组，每组10只。三十烷醇高、中、低各3个剂量组，阳性药、空白对照各一组。分组后第二天开始给药，连续给药1周，在最后一次给药后一小时小鼠腹腔内注射2％鸡红细胞(经去除纤维蛋白，生理盐水多次洗涤)0.2ml/只，4小时后处死小鼠，用生理盐水冲洗腹腔，收集冲洗液、离心，倾去上清液，收集细胞涂片，凉干后用瑞氏染色液染色，油镜下观察。计数100个巨噬细胞吞噬鸡红细胞数，按下公式计算。(1)吞噬百分率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞数，(2)吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞数/100个巨噬细胞数。实验结果：三十烷醇中、高剂量组具有促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用，且具有一定剂量相关性。阳性药也具有促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用，见表10。表10三十烷醇对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响各组与模型组比较：*P＜0.05；**P＜0.01。7：三十烷醇对环磷酰胺致Lewis小鼠白细胞数降低的升白作用实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，18-20g，由上海斯莱克动物责任有限公司提供。合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验材料：吐温80、0.5％CMC-Na。对照品：环磷酰胺，江苏恒瑞制药有限公司，批号11030921。瘤源：Lewis肺癌肿瘤模型由上海医药工业研究院药理评价研究中心传代维持。实验方法：联合环磷酰胺致荷瘤小鼠骨髓抑制模型的建立取生长旺盛的肿瘤，无菌条件下一匀浆法制备成细胞悬液约5～10×106/ml细胞浓度。每只小鼠右腋皮下接种0.2ml。接种第3天(150mg/kg)和第5天(100mg/kg)，除空白正常组合样品高剂量单独给药组外，其余各组分别给以CTX造成联合化疗致荷瘤小鼠骨髓抑制模型。分组和给药方法：随机取10只小鼠在实验开始时作为基础白细胞测试，将其余动物以Lewis肺癌接种造成移植性肿瘤模型并随机分组，每组10只动物，并于接种肿瘤当日开始给药。三十烷醇口服给药，CTX腹腔注射给药。(1)环磷酰胺组(接种后第3天，150mg/kg；接种后第5天，150mg/kg)。(2)三十烷醇+环磷酰胺组150mg/kg(接种当日开始给药，直至实验结束)。(3)三十烷醇组150mg/kg(接种当日开始给药，直至实验结束)。(4)空白组(接种当日开始给相应溶剂，直至实验结束)。观察指标：实验开始时随机取10只小鼠进行眼眶后静脉丛穿刺采血，血细胞自动分析仪(HEMAVET-950)测试血液常规。此后在环磷酰胺末次给药后的次日开始每3天随机取5只小鼠以上述相同方法采血测试血液常规，直至各组白细胞恢复正常。实验结果：结果在试验开始后的第6天，三十烷醇+环磷酰胺组动物的白细胞数为正常动物的109.09％，阳性对照环磷酰胺造模组动物的白细胞数降至正常动物的6.21％。实验表明三十烷醇组动物的白细胞数明显高于阳性对照环磷酰胺造模组动物的白细胞数，二组之间有显著性差异(P<0.01)。说明在此剂量和时相点三十烷醇+环磷酰胺组具有明显的拮抗环磷酰胺致Lewis肺癌小鼠白细胞数降低的作用。详见表11，图1。表11三十烷醇对环磷酰胺致荷瘤小鼠白细胞降低的升白作用试验与阴性对照比较**P<0.01，(白细胞的正常值范围1.8-10.7K/uL)。8：三十烷醇抗角叉菜胶致炎作用研究受试药物：低中高三个剂量组分别为50、100、200mg/kg。配制方法：将三十烷醇样品研磨成粉末状，称取2g，适量吐温-80乳化，生理盐水溶解并定容至50ml，制得浓度为40mg/ml的高剂量受试药，倍比稀释获得浓度分别为20mg/ml、10mg/ml的中剂量和低剂量受试物。给药容量：1ml/200g大鼠。对照品：吲哚美辛肠溶片，来源：上海信谊黄河制药有限公司，批号：120102，规格：25mg，药物剂量：10mg/kg。配制方法：取一片对照品，研磨成粉末，用5％的碳酸氢钠溶液溶解并定容至12.5ml，获得浓度为2mg/ml。给药容量：1ml/200g试剂名称：角叉菜胶，来源：Adamas-beta，批号：P1050992，配制方法：精确称取角叉菜胶0.15g，生理盐水将其溶解并稀释至15ml，即制得1％的角叉菜胶溶液。RatLTB4ELISAkit，批号：20131001A。实验动物：品系：SD大鼠，来源：上海斯莱克实验动物责任有限公司，动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005，体重：180-200g，性别：雄性，动物分组：实验前将动物按照体重随机分为5组(n＝8)，分别为模型组、阳性药组、三十烷醇高中低三个剂量组。实验方法：受试药三个剂量组每天灌胃一次，连续给药五天，第六天给药一小时后，大鼠麻醉，胸腔注射0.3ml1％的角叉菜胶。致炎5小时后，测量渗出液体积，取部分置入离心管中(含10M阿司匹林，4U/ml肝素)2000g离心10分钟后获得上清液，ELISA法测定LTB4浓度。实验结果：由表12可以看出，与模型组相比，吲哚美辛组可以非常明显地减少大鼠胸腔液体渗出(**P〈0.01)，三十烷醇低中高三个剂量组对大鼠胸腔液体积的减少也有非常显著的作用(**P〈0.01，**P〈0.01，**P〈0.01)，其中中、高剂量组显示出比阳性药更为明显的效果。另外，两次应用ELISA法，未检测出LTB4浓度，推测原因可能是试剂盒灵敏度不够，或者该试剂盒所示方法不适于测动物胸液中的LTB4水平。目前国内未购到如文献所示的运用同位素标记方法检测的试剂盒。表12三十烷醇对角叉菜胶诱导的大鼠胸腔渗出液体积变化(ml)与模型组比较：**P〈0.01。实验结论：三十烷醇三个剂量组均可以显著减少大鼠胸腔液体渗出，具有一定的抗炎作用。ELISA法未测出LTB4水平的变化。9：三十烷醇对棉球肉芽肿的影响受试药物：同上。对照品：同上。药物剂量：3mg/kg。配制浓度为2mg/5ml。实验用品：制备棉球，每个重量为50mg，灭菌后使用。实验动物：同上。实验方法：大鼠麻醉后腋下植入50mg棉球(经消毒)，按照药物剂量，每天灌胃1次，6天后处死取出棉球，经60℃烘干称重，比较重量。实验结果：由表13可以看出，与模型组相比，吲哚美辛组可以非常明显地减少棉球肉芽肿重量(**P〈0.01)，三十烷醇低中高三个剂量组对棉球肉芽肿重量的减少也有非常显著的作用(**P〈0.01，**P〈0.01，**P〈0.01)，并显示出一定的量效相关性。表13三十烷醇对棉球肉芽肿重量的影响(g)与模型组比较：**P〈0.01。实验结论：由表13看出，与模型组相比，三十烷醇三个剂量组均可以减少大鼠棉球肉芽肿重量，抑制增殖反应，三十烷醇对于炎症有一定的改善作用。附图说明图1为三十烷醇对环磷酰胺致荷瘤小鼠白细胞降低的白细胞动态变化图。具体实施方式实施例1：称取50g三十烷醇和150g聚乙二醇，80g羧甲基纤维素钠，混合，在55℃下熔融，搅拌，冷却后碾成粉。制成硬胶囊剂，共1000粒，每粒含三十烷醇50mg。实施例2：称取100g三十烷醇和250g聚乙二醇，120g羧甲基纤维素钠，混合，在55℃下熔融，搅拌，冷却后碾成粉。制成硬胶囊剂，共1000粒，每粒含三十烷醇100mg。当前第1页1 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