贝母素乙作为制备提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性药物的应用的制作方法

本发明涉及贝母素乙应用技术领域，是一种贝母素乙作为制备提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性药物的应用。

背景技术：

恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一。对于恶性肿瘤的治疗,主要采取以手术治疗、放射治疗、化学治疗等相结合的综合治疗方式。临床上目前治疗肿瘤的药物主要是化学药物，但是由于化学药物毒性大，在杀死肿瘤细胞的同时也可杀死人体自身免疫细胞，患者不良反应大，在临床使用中有很大的局限性。

化疗增敏剂是指采用微小剂量的该种物质与化疗药物合用即能使化疗效果有显著提高的药物。此类药物本身或在低剂量下无明显抗肿瘤作用，与化疗药物联用却能提高化疗药物疗效，且自身毒副作用小。目前，由于有些药物用量大，则对机体的毒性也随之增加，所以寻找低毒和不良反应少的化疗增敏剂对提高化疗治疗效果具有重要意义。

中医药治疗肿瘤是中国在肿瘤治疗领域的一大特色，现今中药方剂，中药提取物，中药单体等抗肿瘤作用越来越受到重视。由于有些药物用量大，则对机体的毒性也随之增加，近年研究发现，许多中药提取物及单体对肿瘤化疗有增敏作用，这类药物大多毒性较低，作用靶点多样，机体耐受性好，具有一定临床应用价值。

现今，许多中药都证明具有化疗增敏作用。白藜芦醇是非黄酮类多酚化合物，是植物为抵抗外界刺激如紫外线、真菌或机械损伤而产生的一种植物抗毒素。权芳等（白藜芦醇对缺氧环境中鼻咽癌细胞株CNE2的化疗增敏作用，中西医结合学报）研究发现，非细胞毒性剂量的白藜芦醇能够明显提高紫杉醇、顺铂和氟尿嘧啶对CNE2的细胞毒性作用，且具有剂量依赖性。葡萄籽多酚(grape seed polyphenols,GSP)是从葡萄籽中提取的一种天然植物多酚物质。体外研究表明,GSP具有清除自由基、抗氧化等多种生物活性。李丽等（葡萄籽多酚逆转人乳腺癌多药耐药性及其机制研究，中华普通外科杂志）发现葡萄籽多酚有明显的化疗增敏作用。许多天然多糖类化合物被认为具有抗肿瘤活性,侯华新等（银杏叶多糖在肿瘤放射、化疗治疗中的增敏作用研究，广西医科大学学报）研究发现银杏叶多糖对常用的化疗药物具有明显的协同效应,能提高它们对肿瘤细胞的抑制生长作用。另外，康莱特注射液、槲皮素、藻蓝蛋白也被证明有潜在的化疗增敏作用。甲基莲心碱是一种双节基异喹啉类生物碱,石书红等（甲基莲心碱对长春新碱抑制人胃癌细胞增值作用的影响，临床肿瘤学杂志）研究发现甲基莲心碱能从抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡两个方面来增强长春新碱（VCR）的抗肿瘤作用,且甲基莲心碱本身对胃癌细胞无明显毒性作用,是潜在的胃癌化疗增敏药物。

技术实现要素：

本发明提供了一种贝母素乙作为制备提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性药物的应用；本发明首次提出了贝母素乙作为制备提高食管癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞和肺癌细胞对化疗药物的敏感性药物的应用。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种贝母素乙作为制备提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性药物的应用，肿瘤细胞为食管癌细胞或/和肝癌细胞或/和乳腺癌细胞或/和宫颈癌细胞或/和肺癌细胞。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

上述食管癌细胞为食管癌Eca109细胞。

上述肝癌细胞为肝癌HepG2细胞。

上述乳腺癌细胞为人乳腺癌MCF7细胞。

上述宫颈癌细胞为人宫颈癌Hela细胞。

上述肺癌细胞为人肺癌A549细胞。

上述贝母素乙的用量为对肿瘤细胞的非毒性剂量。

本发明首次提出了贝母素乙作为制备提高食管癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞和肺癌细胞对化疗药物的敏感性药物的应用，贝母素乙联用化疗药物，可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，可以显著抑制食管癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞和肺癌细胞的增殖，为提高对食管癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌和肺癌的治疗效果提供了新手段。

附图说明

附图1为不同浓度贝母素乙作用72h后对肿瘤细胞存活率的影响。

附图2a为A549细胞的抑制率。

附图2b为Eca109细胞的抑制率。

附图2c为HepG2细胞的抑制率。

附图2d为MCF7细胞的抑制率。

附图2e为Hela细胞的抑制率。

附图3为贝母素乙联合阿霉素以及单用阿霉素处理肿瘤细胞的半数抑制浓度IC₅₀。

附图4a为A549细胞的结晶紫染色图。

附图4b为Eca109细胞的结晶紫染色图。

附图4c为HepG2细胞的结晶紫染色图。

附图4d为MCF7细胞的结晶紫染色图。

附图4e为Hela细胞的结晶紫染色图。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现技术中公知公用的化学试剂和化学用品。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：该贝母素乙作为制备提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性药物的应用，肿瘤细胞为食管癌细胞或/和肝癌细胞或/和乳腺癌细胞或/和宫颈癌细胞或/和肺癌细胞。

实施例2：作为实施例1的优化，食管癌细胞为食管癌Eca109细胞。

实施例3：作为实施例1的优化，肝癌细胞为肝癌HepG2细胞。

实施例4：作为实施例1的优化，乳腺癌细胞为人乳腺癌MCF7细胞。

实施例5：作为实施例1的优化，宫颈癌细胞为人宫颈癌Hela细胞。

实施例6：作为实施例1的优化，肺癌细胞为人肺癌A549细胞。

实施例7：作为上述实施例的优化，贝母素乙的用量为对肿瘤细胞的非毒性剂量。

以下为贝母素乙的药理试验：

1. 贝母素乙对、食管癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞的毒性测定

通过MTT比色法，检测贝母素乙对食管癌细胞（食管癌Eca109细胞）、肝癌细胞（肝癌HepG2细胞）、乳腺癌细胞（人乳腺癌MCF7细胞）、宫颈癌细胞（人宫颈癌Hela细胞）、肺癌细胞（人肺癌A549细胞）生长的抑制作用，不同浓度贝母素乙作用72h后对肿瘤细胞存活率的影响如图1所示。在后续的叙述中，食管癌Eca109细胞用Eca109细胞代替，肝癌HepG2细胞用HepG2细胞代替，人乳腺癌MCF7细胞用MCF7细胞代替，人宫颈癌Hela细胞用Hela细胞代替，人肺癌A549细胞用A549细胞代替。

通过图1实验结果证明，贝母素乙对这五种肿瘤细胞（Eca109细胞、HepG2细胞、MCF7细胞、Hela细胞、A549细胞）几乎无作用，在剂量为20ug/mL的贝母素乙的作用下，五种肿瘤细胞存活率均大于90%。所以，浓度小于20ug/mL时，认为贝母素乙对五种肿瘤细胞无细胞毒性作用，为贝母素乙对五种肿瘤细胞系的非毒性剂量，这样可以避免因细胞毒性作用或剂量过大导致的机体不能耐受。

敏感性实验

阿霉素为目前常用的化疗药物，本实验化疗药物选择阿霉素（ADR）。检测阿霉素（ADR）单剂以及非毒性剂量的贝母素乙联合化疗药物阿霉素(PMI+ADR)对肿瘤细胞（Eca109细胞、HepG2细胞、MCF7细胞、Hela细胞、A549细胞）的生长抑制率（抑制率，%）的影响，Eca109细胞、HepG2细胞、MCF7细胞、Hela细胞、A549细胞的抑制率如图2a至图2e所示（*p<0.05，**p<0.01）。贝母素乙联合阿霉素以及单用阿霉素处理肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC₅₀值，*p<0.05，**p<0.01）如图3所示。

通过2a至图2e所示可以看出，阿霉素联用贝母素乙对肿瘤细胞的抑制率高于阿霉素单剂对肿瘤细胞的抑制率，即阿霉素联用贝母素乙对肿瘤细胞处理后，使肿瘤细胞的存活率大大低于采用阿霉素单剂处理后的肿瘤细胞的存活率，说明贝母素乙联合阿霉素对肿瘤细胞的毒性增强。

通过图3可以看出，贝母素乙联合阿霉素处理肿瘤细胞的IC₅₀值低于单用阿霉素处理肿瘤细胞的IC₅₀值，说明贝母素乙联合阿霉素对肿瘤细胞的毒性增强。

由此试验可知，贝母素乙能够提高肿瘤细胞对阿霉素的敏感性。

结晶紫染色实验

通过结晶紫染色法，验证非毒性剂量贝母素乙与化疗药物阿霉素联用对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

取对数生长期的Eca109细胞、HepG2细胞、MCF7细胞、Hela细胞、A549细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集到离心管中，800rpm离心5min，重悬后计数，按照每孔1×10⁴个细胞接种于24孔细胞培养板中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养过夜。按照实验分组，加入不同的浓度ADR以及非毒性剂量的贝母素乙，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养7天,结晶紫染色，拍照，结果如图4a-图4e。在图4a中，包括4个组，分别为溶剂对照组（MOCK）、加入非毒性剂量的贝母素乙组（PMI）、加入ADR单剂组（ADR）、联用非毒性剂量的贝母素乙与阿霉素组（PMI+ADR），图4b-图4e的分组如图4a相同。

通过图4a至图4e可以看出，加入PMI+ADR组中的紫色细胞（图中显示为黑点及黑色区域）分布量明显比加入ADR单剂组的紫色细胞分布量要少，即加入PMI+ADR组中的紫色细胞（肿瘤细胞）的数量明显少于加入ADR单剂组的紫色细胞的数量，说明非毒性剂量贝母素乙与化疗药物阿霉素联用对肿瘤细胞增殖的抑制作用明显优于阿霉素单剂对肿瘤细胞增殖的抑制作用，即贝母素乙与化疗药物阿霉素联用能够提高肿瘤细胞对阿霉素的敏感性。

综上所述，本发明首次提出了贝母素乙作为制备提高食管癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞和肺癌细胞对化疗药物的敏感性药物的应用，贝母素乙联用化疗药物，可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，可以显著抑制食管癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞和肺癌细胞的增殖，为提高对食管癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌和肺癌的治疗效果提供了新手段。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。