一种慢性低灌注帕金森病小鼠模型及其制备方法与装置与流程

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种慢性低灌注帕金森病小鼠模型及其制备方法与装置。

背景技术：

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的一种中老年神经系统变性疾病。随着我国老龄化进程的不断加快，其发病率逐年攀升。有关帕金森病患病率的调查研究结果显示，目前我国帕金森病患者高达200多万，65岁以上老年人群中其患病率约为2％。据不完全统计预计到2030年，我国罹患帕金森病患者的人数可达500万，由此可见帕金森病带来的社会负担尤为堪忧。认知功能障碍在帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)中较为常见，包括PD轻度认知功能障碍(Mild cognitive impairment in Parkinson's disease,PD-MCI)和帕金森病痴呆(Parkinson's disease dementia,PDD)。研究发现以认知功能障碍为代表的非运动症状的发生率高达98.6％，其中18.9％-52％的PD患者可发生PD-MCI，而在非痴呆PD患者中，PD-MCI的发生率可高达55％。前瞻性长期随访研究提示，每年约有6％-15％的PD-MCI患者可进展为PDD，62％的PD-MCI患者可在4年内进展为PDD。PDD不仅给家庭和社会带来沉重负担，还显著增加PD患者的致残风险、死亡率和病死率。此外，PD-MCI作为PD认知功能正常和PD痴呆间的一种过渡状态，对其临床特性、病情演变及病理机理的深入研究，有助于评估PD认知功能障碍的临床转归，对其早期诊断和早期防治也具有重要的临床意义和应用价值。

帕金森病的实验动物模型已有多种，包括小鼠大鼠的外科损伤或6-羟多巴立体定向注射毁损的模型等。80年代初期，有吸毒者在自己合成海洛因过程中采取捷径，缩短了反应时间并增高了反应温度，以这种简化工艺制成的海洛因在给人注射后，产生了震颤、僵直、面部表情呆滞等类似PD的表现，经过分析，这种合成物中含有1-甲基-4-苯基-4-氧哌啶(MPPP)和1-甲基-4-苯基1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)。Burns等【Burns RS,Chiueh CC,Markey SP,Ebert M H,Jacobowitz DM,Kopin IJ.A primate model of parkinsonism:selective dest ruction of dopaminergic neurons in the pars compacta of the substantia nigra by N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine.Proceedings of the National Ac ademy of Sciences of the United States of America.1983；80(14):4546-4550.】在1983年首次报道了利用MPTP制成的非人灵长类动物PD模型。此后又有人陆续报道了基因工程模型、免疫损伤模型、除草剂模型、鱼藤酮模型、LPS模型以及利用脑立体定向技术脑内毁损或给药等方法制备PD动物模型。

MPTP为强脂溶性化合物，极易透过血-脑脊液屏障，但在大脑和小脑中分布较少，MPTP本身没有毒性，可以选择性的浓集于黑质周围，被胶质细胞摄取后，在单胺氧化酶B催化下转化为相应的二氢吡啶(MPDP+)，MPDP+随之氧化为1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)，MPP+通过DAT进入DA能神经元，抑制TH活性，减少DA的合成，通过抑制线粒体氧化呼吸链、增加自由基的生成及氧化应激等导致SN DA能神经元凋亡。非人灵长类动物对MPTP最为敏感，MPTP在非人灵长类如猴身上引起的生化和细胞的改变与PD病人非常相似，只有非人灵长类才能精确的模拟PD的运动障碍，但由于经济、伦理道德的限制等原因，灵长类的模型在世界范围内的少数应用。但是大鼠对MPTP不敏感，尽管如此，增加MPTP的用量同样可以复制出大鼠PD模型，因此，MPTP对动物模型的效应取决于给药的形式及剂量。因此MPTP小鼠模型成为应用最普遍的PD动物模型，其是研究PD神经病理和神经生化改变的最有用的动物模型。

尽管通过不同方式及途径给药，可使得MPTP随血液循环进入中脑黑质等区域，损伤多巴胺能神经元，模拟帕金森病人中脑黑质多巴胺能神经元的缺失。以上方法虽然可以诱导出典型的帕金森病行为症状，但存在明显的弊端：行为症状不稳定；极少表现出非运动症状。

因此，有必要研究得到一种稳定的帕金森病小鼠模型。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种慢性低灌注帕金森病小鼠模型的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的慢性低灌注帕金森病小鼠模型。

本发明的再一目的在于提供一种用于制备慢性低灌注帕金森病小鼠模型的装置。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种慢性低灌注帕金森病小鼠模型的制备方法，包括如下步骤：对双侧颈总动脉缩窄的小鼠采用丙磺舒与MPTP(1-甲基-4-苯基1,2,3,6-四氢吡啶，1-Methyl-4-Pheny l-1,2,3,6-Tetrahy dropyridine)联合给药，得到慢性低灌注帕金森病小鼠模型。

所述双侧颈总动脉缩窄的小鼠优选通过如下步骤制备得到：是通过一种用于制备慢性低灌注帕金森病小鼠模型的装置制备得到，该装置包括用于缠绕在小鼠双侧颈总动脉上的微型弹簧线圈和用于辅助将微型弹簧线圈缠绕到小鼠双侧颈总动脉上的弯钩；通过弯钩将微型弹簧线圈分别缠绕于小鼠双侧颈总动脉上，得到双侧颈总动脉缩窄的小鼠。通过所述用于制备慢性低灌注帕金森病小鼠模型的装置制备得到的双侧颈总动脉缩窄的小鼠稳定，成功率高。

所述的微型弹簧线圈的内径比小鼠双侧颈总动脉的外径小，从而微型弹簧线圈缠绕在小鼠双侧颈总动脉上，颈总动脉血管变窄，血流通过量小，造成脑部血流的持续低灌注。

所述的微型弹簧线圈的内径优选为0.18mm。

所述的微型弹簧线圈的主要成分如下：碳0.8～0.85％(w/w)、硅0.12～0.32％(w/w)，锰0.3～0.6％(w/w)、磷0.025％(w/w)、硫0.025％(w/w)及铜0.2％(w/w)，线圈表面镀金。

所述的微型弹簧线圈优选为由5个螺距为0.5mm的线圈组成，线圈材料的粗细为0.08mm，全长2.5mm，内径为0.18mm。

所述的弯钩有利于快速将微型弹簧线圈缠绕到小鼠双侧颈总动脉上，提高小鼠模型的成功率。

所述的弯钩包括钩尖和钩柄，钩尖的一端与钩柄连接，钩尖的另一端的端头为非锐利结构，从而不易伤害到小鼠组织。

所述的非锐利结构优选为球形。

所述的弯钩的材质为透明材料材质，从而有利于观察；优选为玻璃。

所述的给药的方式优选为腹腔注射。

所述的丙磺舒与MPTP联合给药优选通过如下步骤实现：先给小鼠腹腔注射丙磺舒注射液，30min后再腹腔注射MPTP注射液，每次丙磺舒与MPTP联合注射的间隔为3.5天，共注射10次。

所述的丙磺舒的注射量优选为250mg/kg。

所述的丙磺舒注射液优选通过如下方法制备得到：将丙磺舒粉剂溶于DMSO溶剂中，得到丙磺舒注射液。

所述的丙磺舒注射液的浓度优选为150mg/ml。

所述的MPTP的注射量优选为25mg/kg。

所述的MPTP注射液优选通过如下方法制备得到：将MPTP粉剂溶于生理盐水中，得到MPTP注射液。

所述的MPTP注射液的浓度优选为2.5mg/ml。

所述的MPTP保存温度优选为-20℃。

所述的小鼠优选为C57BL/6小鼠。

所述的小鼠优选为5-6周龄的小鼠。

一种慢性低灌注帕金森病小鼠模型，通过上述制备方法得到。

所述的慢性低灌注帕金森病小鼠模型在参与帕金森病的病理过程机制的研究和药物开发中的应用。

一种用于制备慢性低灌注帕金森病小鼠模型的装置，包括用于缠绕在小鼠双侧颈总动脉上的微型弹簧线圈和用于辅助将微型弹簧线圈缠绕到小鼠双侧颈总动脉上的弯钩。使用该装置更易于制备得到慢性低灌注帕金森病小鼠模型。

所述的微型弹簧线圈的内径优选为0.18mm。

所述的微型弹簧线圈的主要成分如下：碳0.8～0.85％(w/w)、硅0.12～0.32％(w/w)，锰0.3～0.6％(w/w)、磷0.025％(w/w)、硫0.025％(w/w)及铜0.2％(w/w)，线圈表面镀金。

所述的微型弹簧线圈优选为由5个螺距为0.5mm的线圈组成，线圈粗细为0.08mm，全长2.5mm，内径为0.18mm。

所述的弯钩有利于快速将微型弹簧线圈缠绕到小鼠双侧颈总动脉上，提高小鼠模型的成功率。

所述的弯钩包括钩尖和钩柄，钩尖的一端与钩柄连接，钩尖的另一端的端头为非锐利结构，从而不易伤害到小鼠组织。

所述的非锐利结构优选为球形。

所述的弯钩的材质为透明材料材质，从而有利于观察；优选为玻璃。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明构建动物模型的方法操作简便、安全；成功率高；得到的模型小鼠模拟认知障碍表现典型。

附图说明

图1为微型弹簧线圈结构示意图；其中，图(A)为左视图；图(B)为主视图。

图2为微型弹簧线圈制备颈总动脉缩窄示意图；其中，1-颈外动脉、2-颈内动脉、3-枕动脉、4-迷走神经、5-颈总动脉、6-胸锁乳突肌、7-微型弹簧圈。

图3为玻璃弯钩的结构示意图。

图4为颈总动脉缩窄前后实体图；其中，图(A)为颈总动脉缩窄前，图(B)为颈总动脉缩窄后。

图5为小动物B超机检测脑动脉血流灌注的图像图。

图6为Bielschowsky银染图像图；其中，图(A)为对照组小鼠胼胝体部，白质结构致密，排列整齐；图(B)为PD轻度认知功能障碍+双侧颈总动脉狭窄组小鼠，白质纤维连续性破坏，局部白质破坏现象较为显著。

图7为伊文思蓝(EB)实验检测图像图；其中，图(A)为对照组EB渗透情况；图(B)为PD轻度认知功能障碍+双侧颈总动脉狭窄组小鼠EB渗透情况。观察伊文思蓝的渗漏情况来探讨各小鼠血脑屏障的渗透性。

图8为透射电镜检测图像图；其中，图(A)为对照组小鼠透射电镜检测图像；图(B)为PD轻度认知功能障碍+双侧颈总动脉狭窄组小鼠组，除了有内皮细胞结构损伤外，还可见内皮细胞紧密连接中断，以及基底膜裂现象。

图9为CD34免疫组化染色照片图；其中，图(A)为FITC绿色荧光所占的体积代表脑血浆容量，进而反应各组小鼠管网；图(A)为对照组小鼠，小鼠血管连接紧密，密度均匀致；图(B)为PD轻度认知功能障碍+双侧颈总动脉狭窄组小鼠组，血管连接稀疏，血管网络分布不均匀。

图10为TH免疫组化染色图；其中，图(A)为对照组小鼠黑质TH染色情况。图(B)为PD轻度认知功能障碍+双侧颈总动脉狭窄组小鼠组黑质TH染色情况。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1本发明动物模型的制备

一、材料

1.实验动物

实验用动物为82只雄性C57BL/6小鼠，5-6周龄，体重为18-22g，均购自中山大学实验动物中心。

2、微型弹簧圈

购置于日本Sawane Spring Co.(Shizuoka,Japan)，主要成分如下：碳0.8～0.85％(w/w)、硅0.12～0.32％(w/w)，锰0.3～0.6％(w/w)、磷0.025％(w/w)、硫0.025％(w/w)及铜0.2％(w/w)，线圈表面镀金。该微型弹簧线圈由5个螺距为0.5mm的线圈组成，线圈材料的粗细为0.08mm，全长2.5mm，内径为0.18mm。

3、玻璃弯钩

玻璃弯钩包括钩尖和钩柄，钩尖的一端与钩柄连接，钩尖的另一端为球形，钩尖；钩尖与钩柄结合处的角度小于90°。

二、建模的方法

1.实验动物饲养

小鼠的饲养在SPF级实验室完成(温度为22-25℃，相对湿度40-70％，12小时昼/夜节律)。供应充足的食物和饮用水，定期对饲养间进行消毒处理，并对实验小鼠进行隔离，禁止与实验无关人员进入饲养间。实验过程遵循动物伦理原则，所有动物的实验程序均按照伦理委员的要求严格执行，并符合中华人民共和国制定的《实验动物管理条例》(1996年修订)。

2.建模前脑血流灌注评估

首先，用2％(v/v)的异氟烷进行吸入麻醉，使其保持一定的心率和呼吸。待小鼠进入轻中度麻醉(即镇痛效果较佳，麻醉持续时间长，对心血管和呼吸系统抑制轻)阶段后，按visualsonies/vevo770TM高分辨小动物超声仪器的要求，将其固定于超声操作台上。颈部去毛，涂以超声耦合剂(恒迪牌医用超声耦合剂)，将系统配套的RMV707B型高频超声探头与小鼠颈部紧密接触。在记录系统的心血管模式下，设置相应的频率(15MHz)，对小鼠双侧颈总动脉缩窄端的远心端进行实时血管超声检测，测定速度时间积分(velocity time integral,VTI)来评定小鼠颈总动脉缩窄前后血管内血流的峰度值，通过计算VTI的平均值来评价其建模前脑部血流灌注情况。

3.建模前准备

建模前12小时开始禁食水，直至建模，并称量实验小鼠体重。

4.模型构建过程

5.1小鼠低灌注模型的制备

腹腔注射4％(w/v)水合氯醛(1～1.2ml/10g)来麻醉小鼠，待小鼠进入深度麻醉后，将其仰卧放置在操作台上，固定四肢及头部。暴露小鼠的双侧颈总动脉。在靠近右侧颈总动脉近、远心端分别穿以尼龙线，将其两端游离。随后用眼科镊小心将微型弹簧线圈(如图1所示)放在颈总动脉下边，然后用一玻璃弯钩(如图3所示)牵引颈总动脉，使之与周围组织产生一定的空隙，并另用一玻璃弯钩引导微型弹簧线圈，使其缠绕在右侧颈总动脉上面(如图2所示)。观察小鼠的情况并观察30min后，用相同的方法将微型弹簧线圈套在左侧颈总动脉上。然后检查微型弹簧线圈是否完全缠绕在双侧颈总动脉上、两端是否有游离。其中小鼠用内径为0.18mm的微型弹簧线圈进行缩窄双侧颈总动脉，颈总动脉缩窄前后实体图如图4所示。

4.2 MPTP的配制

取100mg MPTP(1-甲基-4-苯基1,2,3,6-四氢吡啶)粉剂溶于40ml的生理盐水中，配成浓度为2.5mg/ml的MPTP注射液，分装后放于-20℃保存备用。

4.3丙磺舒的配制

按需要取适量的丙磺舒粉剂溶于DMSO溶剂中，配成浓度为150mg/ml的丙磺舒注射液，需现用现配。

4.4 PD模型的制备

先腹腔注射250mg/kg丙磺舒，30min后再腹腔注射25mg/kg MPTP，每次丙磺舒与MPTP联合注射的间隔为3.5天，共注射10次。

5.建模后饲养

按照建模前饲养条件饲养。25只小鼠的双侧颈总动脉接受了内径为0.18mm线圈的缩窄，其中3只小鼠在术后24小时内死亡，该组小鼠死亡率为12％。而对照组中，10只小鼠均存活下来直至实验结束。结果发现，0.18mm线圈组小鼠的存活率均显著低于对照组(P<0.01)。此外0.18mm缩窄组小鼠的死亡均发生在术后术后24小时内。

6.建模后脑血流灌注评估

首先，用2％(v/v)的异氟烷进行吸入麻醉，使其保持一定的心率和呼吸。待小鼠进入轻中度麻醉阶段后，按visualsonies/vevo770TM高分辨小动物超声仪器的要求，将其固定于超声操作台上。颈部去毛，涂以超声耦合剂，将系统配套的RMV707B型高频超声探头与小鼠颈部紧密接触。在记录系统的心血管模式下，设置相应的频率，对小鼠双侧颈总动脉缩窄端的远心端进行实时血管超声检测，测定速度时间积分(velocity time integral,VTI)来评定小鼠颈总动脉缩窄前后血管内血流的峰度值，通过计算不同时间点VTI的平均值来评价其脑部血流灌注情况。结果如图5所示，B超结果提示，C57小鼠的颈总动脉平均直径为0.41±0.06mm，本发明中选取的钢琴线圈内径为0.18mm，人为缩窄的幅度可达52％-57％。小鼠缩窄后远心端血管内血流的峰度值提示，使用0.18mm线圈后，缩窄2hr后血流下降最为明显，可减低到正常的66.19±3.53％(P＜0.01vs对照组＝，随着缩窄时间的延长，血流逐渐恢复，28天后血流可恢复到正常的91.94±6.05％。

三、建模后行为学检测(Morris水迷宫行为学测定，Morris water maze)和结果

Morris水迷宫是一个直径为120cm，水深30cm的白色圆形塑料水桶，按照东、南、西、北四个方位将水池等距划分为四个象限，并在目标象限的中心位置距水下0.5-1cm处放置一个隐藏式平台(9×9cm²)。每次训练之前，在水池中注入新鲜流质牛奶，以保证小鼠不能通过水面观察到平台的具体位置。水温(24±1℃)、平台位置及水池外参照物在训练过程中保持不变。

1.定位航行实验：每只小鼠连续测试4天，每天测试4次(trial)，每次从4个不同象限的入水点面向池壁将小鼠放入水中，观察记录小鼠寻找到平台所需的时间(即逃避潜伏期escape latency)。小鼠在60s内找到平台后，允许其在平台上停留15s；若小鼠在60s内无法找到平台，实验者将其引至平台上，停留休息15-20s，这时潜伏期记录为60s。

2.空间探索试验：所有小鼠完成定位航行测试后，将平台撤除，然后将小鼠通过原平台所在象限的对侧象限的入水点面向池壁放入水中，进行空间探索试验(probe trial)。记录60s内小鼠的游泳轨迹，分析小鼠在目标(target)象限的停留时间和穿越目标象限的次数。每次实验情况均用实时跟踪拍摄记录，并用EnthoVision XT 7.0软件进行分析(Noldus,Netherlands)。

3.行为学检测的结果：双侧颈总动脉狭窄帕金森病小鼠的逃避潜伏期随着训练天数增加而减少，说明小鼠在游泳训练中均具有一定的学习能力。双侧颈总动脉缩窄可造成PD模型小鼠的认知能力均显著下降、空间探索能力显著下降。

四、建模后脑组织病理组织学检测

1.脑组织取材

完成水迷宫训练后，小鼠经腹腔注射4％(w/v)水合氯醛(1～1.5ml/10g)进行麻醉，待小鼠深度麻醉后，剪开其胸腔充分暴露心脏，用小镊子夹住左心室心尖部位，在心尖偏左侧的左心室处插入插管，缓慢上行至升主动脉部，随后固定整个输液系统，同时剪开右心耳，肝脏，快速滴入含有1％(w/v)肝素的预冷生理盐水约50ml～80ml，直至右心耳流出清亮液体为止。然后输注4％(w/v)的多聚甲醛的PBS液，先快后慢，持续灌注40min，直至小鼠全身僵直后立即开颅取脑，组织块固定在4％(w/v)多聚甲醛待用。

2.脑组织病理检查：

将取出的脑组织立即放于置于4℃的4％(w/v)多聚甲醛液固定24小时。取出脑组织，参照小鼠脑解剖图谱，每间隔1mm切取脑厚片，标记左右并编号。将脑厚片置于4％(w/v)的多聚甲醛液中，固定8小时后，进行石蜡包埋并制备3um石蜡切片，行Bielschowsky银染、伊文思蓝(EB)实验、透射电镜、CD34、TH免疫组化染色，结果如图6～10所示，Bielschowsky银染提示双侧颈总动脉缩窄可造成帕金森病小鼠胼胝体、内囊及视束部位白质纤维不同程度的损伤，表现为白质纤维明显稀疏以及出现大量空泡。其中，以胼胝体部白质损伤最明显，内囊部白质损伤程度较胼胝体部位轻，视束部位白质的损伤相对较轻。伊文思蓝(EB)实验提示双侧颈总动脉缩窄可造成帕金森病小鼠EB的含量显著增加(P<0.01vs PDCN)，说明低灌注可加速帕金森病小鼠BBB的损伤。透射电镜结果提示双侧颈总动脉缩窄可造成帕金森病小鼠内皮细胞肿胀，内皮结构受损，细胞间紧密连接破坏，还可见内皮细胞紧密连接中断，以及基底膜断裂现象。CD34来标记残存及新生血管的内皮细胞，以期观察小鼠血管内皮细胞的损伤情况。对照组CD34免疫阳性的血管内皮细胞表达致密，分布均匀。双侧颈总动脉的缩窄可致帕金森病小鼠血管内皮细胞表达稀疏，缺失较为明显，提示血管内皮细胞的损伤。TH免疫组化染色提示双侧颈总动脉缩窄帕金森病小鼠，黑质部位酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)阳性细胞数量减少，该部位染色密度显著下降，说明双侧颈总动脉的缩窄可致帕金森病小鼠黑质部DA能神经元减少。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。