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背景技术：
癌症继续是主要的全球健康负担。尽管在癌症的治疗方面有所进展，但一直存在对更有效且毒性更小的疗法的未满足的医疗需要，尤其对于患有对现有治疗剂有抗性的晚期疾病或癌症的那些患者。
免疫系统，特别是t细胞介导的细胞毒性，在肿瘤控制中的作用是公认的。有越来越多的证据表明t细胞在癌症患者中控制肿瘤生长和存活，无论是在该疾病的早期和晚期阶段。然而，肿瘤特异性t-细胞应答很难在癌症患者中上升和维持。
迄今为止受到显著关注的t细胞通路通过毒性t淋巴细胞抗原-4(ctla-4，cd152)、程序性死亡配体1(pd-l1，也被称为b7-h1或cd274)、和ox40(cd134；tnfrsf4)发信号。
ctla4在活化的t细胞上表达，并随着cd28介导的t细胞激活作为共抑制剂以抑制t细胞应答。ctla4被认为在tcr接合之后调节幼稚和记忆性t细胞的早期激活幅度，并且是影响抗肿瘤免疫和自身免疫两者的中央抑制途径的一部分。ctla4专门在t细胞中表达，并且其配体cd80(b7.1)和cd86(b7.2)的表达主要限于抗原提呈细胞、t细胞、和其他免疫介导的细胞。已经报道了阻断ctla4信号通路的拮抗性抗ctla4抗体增强t细胞激活。一个这样的抗体易普利姆玛在2011年被fda批准用于转移性黑色素瘤的治疗。另一个抗ctla4抗体曲美木单抗，在iii期临床试验中测试了对于晚期黑色素瘤的治疗，但相比当时的标准治疗(替莫唑胺或达卡巴嗪)没有显著增加患者的整体存活率。
pd-l1也是涉及控制t-细胞激活的受体和配体的复杂系统的一部分。在正常组织中，pd-l1在t细胞、b细胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓源性肥大细胞以及不同非造血细胞上表达。它的正常功能是通过与它的两个受体程序性死亡1(又称为pd-1或cd279)和cd80(又称为b7-1或b7.1)的相互作用来调节t-细胞激活与耐受之间的平衡。pd-l1还通过肿瘤来表达并且在多个部位上起作用以帮助肿瘤避开由宿主免疫系统进行的检测和消除。pd-l1在宽范围的癌症中高频率地表达。在一些癌症中，pd-l1的表达与存活降低和不利预后相关联。阻断b7-h1与它的受体之间的相互作用的抗体能够在体外解除pd-l1依赖性免疫抑制作用并且增强抗肿瘤t细胞的细胞毒性活性。medi4736是针对人pd-l1的能够阻断pd-l1与pd-1和cd80受体两者的结合的人单克隆抗体。
ox40是主要见于活化cd4+和cd8+t细胞、调节t细胞(treg)以及自然杀伤(nk)细胞上的一种肿瘤坏死因子受体(tnfr)。在活化的cd4+和cd8+t细胞上通过ox40发信号导致细胞因子产生的增强、颗粒酶和穿孔素释放、以及效应和记忆t细胞池的扩增。此外，在treg细胞上的ox40信号传导抑制treg的扩增，关闭对treg的诱导并且阻断treg抑制功能。
尽管在过去十年在开发用于对抗癌症和其他疾病的策略中做出了显著的进步，但是患有晚期、难治性和转移性疾病的患者具有有限的临床选择。化疗、放射、和高剂量化疗已成为剂量限制。仍然存在对新的毒性更少的方法和具有更好的疗效、更长的临床益处、和改进的安全性特性的治疗的大量未满足的需求，特别是对于患有对现有的治疗具有抗性的晚期疾病或癌症的那些患者。
发明概述
在一方面，本发明提供了一种在受试者(例如，人类受试者)中治疗实体瘤的方法，该方法包括向该受试者给予抗-pd-l1抗体(例如，medi4736)或其抗原结合片段、抗-ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)或其抗原结合片段、和ox40激动剂(例如，medi6383)。
在另一方面，本发明提供了一种在受试者(例如，人类受试者)中治疗实体瘤的方法，该方法包括向该受试者给予medi4736或其抗原结合片段、曲美木单抗或其抗原结合片段、和medi6383。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物含有有效量的抗-pd-l1抗体(例如，medi4736)或其抗原结合片段、抗-ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)或其抗原结合片段、和ox40激动剂(例如，medi6383)、以及药学上可接受的赋形剂。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物含有有效量的medi4736或其抗原结合片段、曲美木单抗或其抗原结合片段、和medi6383或其活性片段、以及药学上可接受的赋形剂。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒含有根据本文所述的任何其他方面的药物组合物和用于治疗癌症的说明书(例如，根据本文所述的任何其他方面的方法)。
在本文所述的任何方面的各种实施例中，该ox40激动剂是一种或多种ox40配体融合蛋白(例如，medi6383)或抗-ox40抗体。
在本文所述的任何方面的各种实施例中，该抗-pd-l1抗体是medi4736。
在本文所述的任何方面的各种实施例中，该抗-ctla-4抗体是曲美木单抗。
在本文所述的任何方面的各种实施例中，这些给予使存活期增加。在各种实施例中，与单独medi4736、单独曲美木单抗、或单独med6383的给予相比，这些给予导致存活期的增加。在另外的实施例中，与medi4736和曲美木单抗、medi4736和medi6383、以及曲美木单抗和medi6383的给予相比，这些给予导致存活期的增加。
在本文所述的任何方面的各种实施例中，这些给予使肿瘤体积减小。在各种实施例中，与单独medi4736、单独曲美木单抗、或单独med6383的给予相比，这些给予导致肿瘤体积的减小。在另外的实施例中，与medi4736和曲美木单抗、medi4736和medi6383、以及曲美木单抗和medi6383的给予相比，这些给予导致肿瘤体积的减小。
在本文所述的任何方面的各种实施例中，抗-pd-l1抗体(例如，medi4736)或其抗原结合片段的给予是通过静脉内输注进行的。在本文所述的任何方面的各种实施例中，抗-ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)或其抗原结合片段的给予是通过静脉内输注进行的。在本文所述的任何方面的各种实施例中，ox40激动剂(例如，medi6383)或其活性片段的给予是通过静脉内输注进行的。在本文所述的任何方面的各种实施例中，将该药物组合物被配制用于静脉内给予。
在本文所述的任何方面的各种实施例中，该实体瘤是卵巢癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾细胞癌、肺癌、或非小细胞肺癌(例如，鳞状或非鳞状非小细胞肺癌)中的一种或多种。在此描述的任何方面的不同的实施例中，该受试者是人患者。
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下面的参考文献为技术人员提供了本发明所用的多个术语的通用定义：singleton等人，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology[微生物学和分子生物学词典](第2版，1994年)；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology[剑桥科学与技术词典)(walker编辑，1988年)；theglossaryofgenetics[遗传学词汇]，第5版，rieger等人(编辑)，springerverlag[施普林格出版社](1991年)；以及hale与marham，theharpercollinsdictionaryofbiology[哈珀柯林斯生物学词典](1991年)。除非另外指明，如在此使用的以下术语具有以下赋予它们的含义。
“抗肿瘤活性”意指任何降低或稳定肿瘤细胞的增殖或存活的生物学活性。在一个实施例中，该抗肿瘤活性是抗肿瘤免疫应答。
“免疫调节剂”意指增强免疫应答(例如抗肿瘤免疫应答)的试剂。本发明的示例性免疫调节剂包括抗体，如抗-ctla-4抗体、抗-pd-l1抗体及其片段；以及蛋白质，如ox40配体融合蛋白或其片段。在一个实施例中，该免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
“ox40多肽”意指与ncbi登录号np_003318具有至少约85％氨基酸一致性的多肽或其片段。ox40是受体tnfr超家族中的在抗原活化的哺乳动物cd4+和cd8+t淋巴细胞的表面上表达的成员。参见，例如，paterson等人，molimmunol[分子免疫学]24，1281-1290(1987)；mallett等人，emboj[欧洲分子生物学学会杂志]9，1063-1068(1990)；和calderhead等人，jimmunol[免疫学杂志]151，5261-5271(1993)。ox40还被称为cd134、act-4以及act35。ox40受体序列是本领域中已知的并且例如以genbank登录号：aab33944或cae11757提供。
以下提供了示例性人ox40氨基酸序列(seqidno：18)：
“ox40配体”意指与ncbi登录号np_003317具有至少约85％氨基酸一致性并且特异性结合ox40受体的多肽或其片段。参见，例如，baump.r.等人emboj[欧洲分子生物学学会杂志].13：3992-4001(1994))。术语ox40l包括整个ox40配体、可溶性ox40配体、以及包含ox40配体的共价地连接到第二部分例如蛋白结构域的功能活性部分的融合蛋白。还包括在ox40l的定义内的是与天然存在的ox40l在氨基酸序列上不同但是保留特异性结合到ox40受体的能力的变体。还包括在ox40l的定义内的是增强ox40的生物活性的变体。ox40配体序列在本领域中是已知的并且例如以genbank登录号：np_003318提供。
以下提供了示例性人ox40配体氨基酸序列(seqidno：19)：
mervqpleenvgnaarprfernklllvasviqglglllcftyiclhfsalqvshrypriqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl
“ox40激动剂”意指与ox40受体特异性地相互作用并且增加ox40受体的生物活性的ox40配体。令人希望的是，该生物活性增加至少约10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。在某些方面，如在此所披露的ox40激动剂包括ox40结合多肽，诸如抗ox40抗体(例如，ox40激动剂抗体)、ox40配体、或这些分子的片段或衍生物。
“ox40抗体”意指特异性结合ox40的抗体。ox40抗体包括对ox40具有特异性的单克隆抗体和多克隆抗体以及其抗原结合片段。在某些方面，如在此所述的抗ox40抗体是单克隆抗体(或其抗原结合片段)，例如鼠类、人源化或全人单克隆抗体。在一个具体实施例中，该ox40抗体是ox40受体激动剂，诸如由温伯格(weinberg)等人，免疫学治疗杂志(jimmunother)29，575-585(2006)所描述的小鼠抗人ox40单克隆抗体(9b12)。在其他实施例中，特异性结合到ox40的抗体或其抗原结合片段结合到与mab9b12相同的ox40表位。
“ox40配体融合蛋白(ox40lfp)”意指特异性结合ox40受体并增加免疫应答的蛋白质。在一个实施例中，ox40配体融合蛋白结合到ox40受体通过加强t细胞识别来增强肿瘤抗原特异性免疫应答。示例性ox40配体融合蛋白在标题为“三聚体ox40免疫球蛋白融合蛋白和使用方法”(“trimericox40immunoglobulinfusionproteinandmethodsofuse”)的美国专利7,959,925中有所描述。参见，例如，美国专利7,959,925，seqidno.8(seqidno：20)：
latdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkellgggsikqiedkieeilskiyhieneiarikkligerghgggsnsqvshryprfqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl其他ox40配体融合蛋白例如在美国专利号6，312，700中有所描述。在一个实施例中，ox40配体融合蛋白增强肿瘤特异性t细胞免疫性。在一个实施例中，ox40配体融合蛋白是medi6383。
“pd-l1多肽”意指与ncbi登录号np_001254635具有至少约85％氨基酸一致性并且具有pd-1和cd80结合活性的多肽或其片段。
“pd-l1核酸分子”意指编码pd-l1多肽的多核苷酸。示例性pd-l1核酸分子序列以ncbi登录号nm_001267706提供。
“抗-pd-l1抗体”意指选择性结合pd-l1多肽的抗体。示例性抗-pd-l1抗体描述于例如us20130034559/us8779108和us20140356353，其通过引用结合在此。medi4736是示例性抗pd-l1抗体。其他抗pd-l1抗体包括bms-936559(美施贵宝公司(bristol-myerssquibb))和mpdl3280a(罗氏公司(roche))。
medi4736vl(seqidno：1)
eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik
medi4736vh(seqidno：2)
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsrywmswvrqapgkglewvanikqdgsekyyvdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycareggwfgelafdywgqgtlvtvss
medi4736vhcdr1(seqidno：3)
rywms
medi4736vhcdr2(seqidno：4)
nikqdgsekyyvdsvkg
medi4736vhcdr3(seqidno：5)
eggwfgelafdy
medi4736vlcdr1(seqidno：6)
rasqrvsssyla
medi4736vlcdr2(seqidno：7)
dassrat
medi4736vlcdr3(seqidno：8)
qqygslpwt
“ctla-4多肽”意指与基因库登录号aal07473.1具有至少85％的氨基酸序列一致性的多肽或其具有t细胞抑制活性的片段。以下提供了aal07473.1的序列(seqidno：21)：
gi|15778586|gb|aal07473.1|af414120_1ctla-4[智人]
maclgfqrhkaqlnlatrtwpctllffllfipvfckamhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkatevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyvidpepcpdsdfllwilaavssglffysflltavslskmlkkrsplttgvyvkmpptepecekqfqpyfipin
“ctla-4核酸分子”意指编码ctla-4多肽的多核苷酸。示例性ctla-4多核苷酸以基因库登录号aal07473提供。
“抗-ctla-4抗体”意指选择性结合ctla-4多肽的抗体。示例性的抗ctla-4抗体描述于例如美国专利号6,682,736；7,109,003；7,123,281；7,411,057；7,824,679；8,143,379；7,807,797；和8,491,895中(其中，曲美木单抗是11.2.1)，这些专利通过引用结合在此。曲美木单抗是示例性抗ctla-4抗体。以下提供了曲美木单抗的序列。
曲美木单抗，美国专利号6,682,736
曲美木单抗vl(seqidno：9)
psslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakv
曲美木单抗vh(seqidno：10)
gvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardprgatlyyyyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvh
曲美木单抗vhcdr1(seqidno：11)
gftfssygmh
曲美木单抗vhcdr2(seqidno：12)
viwydgsnkyyadsv
曲美木单抗vhcdr3(seqidno：13)
dprgatlyyyyygmdv
曲美木单抗vlcdr1(seqidno：14)
rasqsinsyld
曲美木单抗vlcdr2(seqidno：15)
aasslqs
曲美木单抗vlcdr3(seqidno：16)
qqyystpft
如在本披露中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论它是在体外或在体内生产的。该术语包括但不限于：多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、以及接合抗体。除非用术语“完整”另外修饰，如在“完整抗体”中，出于本披露的目的，术语“抗体”还包括抗体片段如fab、f(ab′)2、fv、scfv、fd、dab和保留抗原结合功能(即特异性结合例如ctla-4或pd-l1的能力)的其他抗体片段。典型地，这类片段将包括抗原结合结构域。
术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”是指包括负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸的抗体分子的一部分。在抗原很大的情况下，抗原结合结构域可以仅结合到该抗原的一部分。负责与抗原结合结构域特异性相互作用的抗原分子的一部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域典型地包括抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)，然而，它不一定必须包括两者。例如，所谓的fd抗体片段仅由vh结构域组成，但是仍然保留完整抗体的一些抗原结合功能。
抗体的结合片段通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解来产生。结合片段包括fab、fab′、f(ab′)2、fv以及单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体以外，抗体应理解为其每个结合位点是相同的。使用酶(木瓜蛋白酶)来消化抗体的结果是两个相同的抗原结合片段，又称为“fab”片段和“fc”片段，它们不具有抗原结合活性但具有结晶的能力。用酶(胃蛋白酶)来消化抗体的结果是f(ab′)2片段，其中该抗体分子的两个臂保持链接并且包括两个抗原结合位点。f(ab′)2片段具有交联抗原的能力。当在此使用时，“fv”是指保留了抗原识别和抗原结合位点的抗体的最小片段。当在此使用时，“fab”是指包括轻链的恒定结构域和重链的chi结构域的抗体的片段。
术语“mab”是指单克隆抗体。本发明的抗体包括但不限于：全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；fab、fab′、单链v区片段(scfv)、融合多肽、和非常规抗体。
在此披露中，“包括(comprises、comprising)”、“包含(containing)”、“具有(having)”等具有美国专利法赋予它们的含义并且可以意指“包括(includes、including)”等；“基本上由...组成(consistingessentiallyof或consistsessentially)”同样具有美国专利法赋予的含义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新颖特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。
如在此使用的术语“确定”、“评定”、“测定”、“测量”和“检测”是指定量和定性确定，并且正因如此，术语“确定”在此与“测定”、“测量”等可互换使用。其中定量确定为目的时，使用短语分析物以及类似物的“量的确定”。其中定性和/或定量确定为目的时，使用短语“确定分析物的水平”或“检测”分析物。
“参比”意指比较的标准。
“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、羊或猫。
在此所提供的范围被理解成对该范围内的所有值的简写。例如，一个1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字的组合或子范围，该组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
如在此所使用的术语“治疗(treat、treating、treatment等)”是指减少或改善障碍和/或与其相关的症状。将被理解的是，尽管不能排除，但是治疗障碍或病症并不要求完全地消除该障碍、病症或与其相关的症状。
除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“或”被理解为包括在内。除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”被理解为单数的或复数的。
除非确切规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。约可以被理解为在声明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非从上下文显而易见，在此提供的所有数值被该术语约修饰。
在此变量的任何定义中对化学基团清单的叙述包括将所述变量定义为任何单个基团或所列基团的组合。对在此变量或方面的实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。
可以将在此提供的任何组合物或方法与在此提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种进行组合。
附图简要说明
图1a-1f显示，相比药剂的单一疗法和双重组合疗法，用抗-ctla-4抗体、抗-pd-l1抗体、和ox40配体融合蛋白的组合治疗在减小肿瘤体积和增加存活期方面更有效。图1a是描绘研究组随时间的平均肿瘤体积的图。图1b显示描绘同种型对照(左图)和未经治疗的受试者(右图)随时间的单个肿瘤体积的图。图1c显示描绘用抗-ctla-4单克隆抗体(ctla-4mab；左图)；抗-pd-l1单克隆抗体(pd-l1mab；中图)；和ox40配体融合蛋白(mox40lfp；右图)治疗的受试者随时间的单个肿瘤体积的图。图1d显示描绘用抗-ctla-4和抗-pd-l1单克隆抗体(ctla-4mab+pd-l1mab；上部，左图)；抗-pd-l1单克隆抗体与ox40(pd-l1mab+mox40lfp；上部，右图)；和抗-ctla-4单克隆抗体与ox40配体融合蛋白(ctla-4mab+mox40lfp；底部，左图)；以及抗-ctla-4和抗-pd-l1单克隆抗体和ox40(ctla-4mab+pd-l1mab+mox40lfp)的组合治疗的受试者随时间的单个肿瘤体积的图。图1e是显示在未经治疗的、同种型对照、ctla-4mab、pd-l1mab、和mox40lfp研究组随时间的存活百分比的图。图1f是显示在ctla-4mab+pd-l1mab、同种型对照、ctla-4mab+mox40lfp、pd-l1mab+mox40lfp、以及ctla-4mab+pd-l1mab+mox40lfpfp研究组中随时间的存活百分比的图。每个组中11只c57bl/6小鼠在第1天皮下接种(sc)mca205细胞。在第11、15、18、和22天腹膜内给予(ip)对照样品(同种型对照)和测试样品抗-ctla-4mab和抗-pd-l1mab；在第11和15天腹膜内给予测试样品mox40lfp。对测试样品治疗的和同种型对照治疗的动物之间进行了比较，并且通过在第6.6章节中描述的方法使用图板棱柱(graphpadprism)6.0软件分析了组间差异的统计显著性。误差条代表平均值的标准误差。ip＝腹膜内的；sc＝皮下的；tgi＝肿瘤生长抑制。
发明详述
本发明的特征是对治疗癌症有用的组合物和方法，其包括抗-ctla-4抗体、抗-pd-l1抗体、和ox40激动剂(例如，ox40配体融合蛋白)的组合。如本文下面所报道的，用这些药剂的治疗在小鼠肿瘤模型中减小了肿瘤体积并且增加了存活期。
在此提供了用于治疗实体瘤的方法。所提供的方法包括给予有效量的medi4736或其抗原结合片段、曲美木单抗或其抗原结合片段、和ox40配体融合蛋白或其活性片段。在各种实施例中该实体瘤是，但不限于卵巢癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾细胞癌、以及肺癌(例如，非小细胞肺癌(nsclc))。有三个主要的nsclc亚型：鳞状细胞癌、腺癌和大细胞(未分化)癌。其他亚型包括腺鳞癌和肉瘤样癌。
抗-肿瘤疗法
在此提供了用于治疗癌症的方法，这些方法包括给予抗-ctla4抗体、抗-pd-l1抗体、和ox40激动剂(例如，ox40配体融合蛋白、ox40激动剂抗体)。给予抗-ctla4抗体、抗-pd-l1抗体、和ox40配体融合蛋白导致在小鼠肿瘤模型中肿瘤体积的减小和存活期的增加。在某些方面，对患有实体瘤的患者给予抗-ctla4抗体(例如，曲美木单抗)、抗-pd-l1(medi4736)、和ox40配体融合蛋白(例如，medi6383)。在某些方面，根据在此提供的这些方法，抗-ctla4抗体(例如，曲美木单抗)、抗-pd-l1(medi4736)、和ox40配体融合蛋白(例如，medi6383)的给予是通过肠胃外(例如，静脉内输注或皮下注射)。在某些方面，将抗-ctla4抗体(例如，曲美木单抗)、抗-pd-l1(medi4736)、和ox40配体融合蛋白(例如，medi6383)作为单个药物组合物给予。
使用癌症疗法(包括抗-ctla4抗体、抗-pd-l1抗体、和ox40激动剂)的有效治疗包括，例如，在原发性肿瘤部位处或一个或多个转移中，降低癌症的进展速率、阻滞或稳定肿瘤或转移生长、肿瘤收缩、和/或肿瘤消退。在一些方面中，肿瘤生长的降低或阻滞可以是统计学上显著的。可以通过与基线处的患者肿瘤的生长、针对预期的肿瘤生长、针对基于大的患者群体的预期肿瘤生长或针对对照群体的肿瘤生长进行比较来测量肿瘤生长的减少。在其他实施例中，本发明的这些方法增加存活。
对给予癌症疗法(包括抗-ctla4抗体、抗-pd-l1抗体、和ox40配体融合蛋白)的临床应答可以使用临床医生已知的诊断技术来评估，这些诊断技术包括但不限于磁共振成像(mri)扫描、x-射线照相成像、计算机断层照相(ct)扫描、流式细胞术或荧光激活的细胞分选器(facs)分析、组织学、宏观病理学、以及血液化学，这些临床应答包括但不限于可通过elisa、ria和色谱法检测到的变化。
t细胞调控通路
有越来越多的证据表明t细胞在癌症患者中控制肿瘤生长和存活，无论是在该疾病的早期和晚期阶段。然而，肿瘤特异性t-细胞应答很难在癌症患者中上升和维持。
受到显著关注的t细胞调控通路通过毒性t淋巴细胞抗原-4(ctla-4，cd152)、程序性死亡配体1(pd-l1，也被称为b7h-1或cd274)、和ox40(cd134；tnfrsf4)发信号。
ctla-4在活化的t细胞上表达，并随着cd28介导的t细胞激活作为共抑制剂以抑制t细胞应答。ctla-4被认为在tcr接合之后调节幼稚和记忆性t细胞的早期激活幅度，并且是影响抗肿瘤免疫和自身免疫两者的中央抑制途径的一部分。ctla-4在t细胞上表达，并且其配体cd80(b7.1)和cd86(b7.2)的表达主要限于抗原呈递细胞、t细胞、和其他免疫介导的细胞。据报道阻断ctla-4信号通路的拮抗性抗ctla-4抗体增强t细胞激活。一个这样的抗体易普利姆玛在2011年被fda批准用于转移性黑色素瘤的治疗。另一个抗ctla-4抗体曲美木单抗，在iii期试验中测试了对于晚期黑色素瘤的治疗，但相比当时的标准治疗(替莫唑胺或达卡巴嗪)没有显著增加患者的总体存活。
pd-l1也是涉及控制t-细胞激活的受体和配体的复杂系统的一部分。在正常组织中，pd-l1在t细胞、b细胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓源性肥大细胞以及不同非造血细胞上表达。它的正常功能是通过与它的两个受体程序性死亡1(又称为pd-1或cd279)和cd80(又称为b7-1或b7.1)的相互作用来调节t-细胞激活与耐受之间的平衡。pd-l1还通过肿瘤来表达并且在多个部位上起作用以帮助肿瘤避开由宿主免疫系统进行的检测和消除。pd-l1在宽范围的癌症中高频率地表达。在一些癌症中，pd-l1的表达与存活降低和不利预后相关联。阻断pd-l1与它的受体(例如pd-1)之间的相互作用的抗体能够在体外解除pd-l1依赖性免疫抑制作用并且增强抗肿瘤t细胞的细胞毒性活性。
ox40(cd134；tnfrsf4)是主要见于活化的cd4+和cd8+t细胞、调节t细胞(treg)、以及自然杀伤(nk)细胞上的一种肿瘤坏死因子受体(tnfr)(croft等人，2009)。ox40具有一种已知的内源性配体ox40配体(ox40l；cd152；tnfsf4)，其以三聚体形式存在并且可以聚集ox40，从而产生t细胞内的有效细胞信号传导事件(croft等人，2009)。在活化的cd4+和cd8+t细胞上通过ox40发信号导致细胞因子产生的增强、颗粒酶和穿孔素释放、以及效应和记忆t细胞池的扩增(jensen等人，2010)。此外，在treg细胞上的ox40信号传导抑制treg的扩增、关闭对treg的诱导并且阻断treg抑制功能(voo等人，2013；vu等人，2007)。
免疫组织化学研究和早期流式细胞术分析显示，ox40在浸润广泛的人类癌症的t细胞上表达(baruah等人，2011；curti等人，2013；ladanyi等人，2004；petty等人，2002；ramstad等人，2000；sarff等人，2008；vetto等人，1997)。在肿瘤浸润性淋巴细胞上的ox40表达与若干种人类癌症中的较长存活期相关，表明ox40信号可以在建立抗肿瘤免疫应答中发挥重要的作用(ladanyi等人，2004；petty等人，2002)。
在各种非临床小鼠肿瘤模型中，ox40的激动剂(包括抗体和ox40配体融合蛋白)已成功使用，具有满意的结果(kjaergaard等人，2000；ndhlovu等人，2001；weinberg等人，2000)。通过ox40激动剂共刺激t细胞促进抗肿瘤活性在一些情况下是持久的，从而针对随后的肿瘤激发提供持久的保护(weinberg等人，2000)。treg-细胞抑制和效应t细胞的共刺激被证明对于ox40激动剂的肿瘤生长抑制是必要的(piconese等人，2008)。
抗-pd-l1抗体
medi4736是示例性抗-pd-l1抗体，该抗体对于pd-l1有选择性并且阻断了pd-l1与pd-1和cd80受体的结合。medi4736可以在体外解除pd-l1介导的对人t-细胞激活的抑制，并且通过t-细胞依赖性机制在异种移植物模型中抑制肿瘤生长。
关于用于在此提供的方法中的medi4736(或其片段)的信息可以见于美国专利号8,779,108，其披露内容通过引用以其全文结合在此。medi4736的片段可结晶(fc)结构域在igg1重链的恒定结构域中包含三重突变，该三重突变减少与负责介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的补体组分c1q和fcγ受体的结合。
用于在此提供的这些方法中的medi4736和其抗原结合片段包括重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的medi4736或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的medi4736或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包括上文所示的kabat定义的cdr1、cdr2和cdr3序列，并且其中该轻链可变区包括上文所示的卡巴特定义的cdr1、cdr2和cdr3序列。本领域技术人员将能够容易地鉴定本领域技术人员已知的chothia定义的、abm定义的或其他的cdr定义。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的medi4736或其抗原结合片段包括如在美国专利号8,779，108中所披露的2.14h9opt抗体的可变重链和可变轻链cdr序列，该专利通过引用以其全文结合在此。
抗-ctla-4抗体
特异性结合ctla-4并抑制ctla-4活性的抗体可用于增强抗肿瘤免疫应答。关于用于在此提供的方法中的曲美木单抗(或其抗原结合片段)的信息可以见于us6,682,736(其中它被称为11.2.1)，该专利的披露内容通过引用以其全文结合在此。曲美木单抗(又称为cp-675,206、cp-675、cp-675206、和替西木单抗(ticilimumab))是一种人类igg2单克隆抗体，该单克隆抗体对于ctla-4有高度选择性并阻断了ctla-4与cd80(b7.1)和cd86(b7.2)的结合。它已被证明导致体外免疫激活，并且用曲美木单抗治疗的一些患者已表现出肿瘤消退。
用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗包括重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包括上文所示的氨基酸序列，该重链可变区包括上文所示的氨基酸序列。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包括上文所示的kabat定义的cdr1、cdr2和cdr3序列，并且其中该轻链可变区包括上文所示的卡巴特定义的cdr1、cdr2和cdr3序列。本领域技术人员将能够容易地鉴定本领域技术人员已知的chothia定义的、abm定义的或其他的cdr定义。在一个特定方面，用于在此提供的方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包括如在us6,682,736中所披露的11.2.1抗体的可变重链和可变轻链cdr序列，该专利通过引用以其全文结合在此。
其他抗-ctla-4抗体描述于例如us20070243184中。在一个实施例中，该抗ctla-4抗体是易普利姆玛，也称为mdx-010；bms-734016。
ox40激动剂
在通过抗原引发过程中或在该引发后不久，ox40激动剂与cd4+t细胞上的ox40受体相互作用，从而导致cd4+t细胞对该抗原的应答增加。与对单独抗原的应答相比，ox40激动剂与抗原特异性cd4+t细胞上的ox40受体相互作用可以增加t细胞增殖。与ox40激动剂不存在的情况相比，对抗原的升高的应答可以维持实质上更长的时间段。因此，经由ox40激动剂的刺激通过加强抗原例如肿瘤细胞的t细胞识别来增强抗原特异性免疫应答。ox40激动剂例如在美国专利号6,312,700、7,504,101、7,622,444以及7,959,925中有所描述，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。在癌症治疗中使用这些激动剂的方法例如在wo/2013/119202中和在wo/2013/130102中有所描述，这些专利中的每一个通过引用以其全文结合在此。
ox40激动剂包括但不限于ox40结合分子，例如结合多肽，例如ox40配体(“ox40l”)或ox40结合片段、变体或其衍生物(如可溶性细胞外配体结构域和ox40l融合蛋白)以及抗ox40抗体(例如，单克隆抗体如人源化单克隆抗体)或其抗原结合片段、变体或衍生物。抗ox40单克隆抗体的实例例如在美国专利号5,821,332和6,156,878中有所描述，这些专利的披露内容通过引用以其全部内容结合在此。在某些实施例中，该抗ox40单克隆抗体是9b12或其抗原结合片段、变体或衍生物，如weinberg，a.d.等人，jimmunother[免疫学治疗杂志]29，575-585(2006)中所描述，该文献通过引用以其全文结合在此。
在某些方面，本披露提供一种包含抗体vh和抗体vl的人源化抗-ox40抗体或其抗原结合片段，其中该vl包括与参考氨基酸序列diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwyqqkpgkapklliyytsklhsgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgsalpwtfgqgtkveik(seqidno：22)或diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwyqqkpgkavklliyytsklhsgvpsrfsgsgsrtdytltisslqpedfatyycqqgsalpwtfgqgtkveik(seqidno：23)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％一致性的氨基酸序列
在一方面，本披露提供一种包含抗体vh和抗体vl的人源化抗ox40抗体或其抗原结合片段，其中该vl包含氨基酸序列diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwyqqkpgkapklliyytsklhsgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgsalpwtfgqgtkveik(seqidno：22)，并且该vh包含氨基酸序列qvqlqesgpglvkpsqtlsltcavyggsfssgywnwirkhpgkgleyigyisyngityhnpslksritinrdtsknqyslqlnsvtpedtavyycarykydydgghamdywgqgtlvtvss(seqidno：24)。
在某些方面，本披露提供一种包含抗体重链或其片段和抗体轻链或其片段的人源化抗-ox40抗体或其抗原结合片段，其中该重链包含氨基酸序列
qvqlqesgpglvkpsqtlsltcavyggsfssgywnwirkhpgkgleyigyisyngityhnpslksritinrdtsknqyslqlnsvtpedtavyycarykydydgghamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno：25)，并且该轻链包含氨基酸序列diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwyqqkpgkapklliyytsklhsgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgsalpwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno：26)。
在其他实施例中，特异性结合到ox40的抗体或其抗原结合片段结合到与mab9b12相同的ox40表位。
由morris等人.，molimmunol[分子免疫学].2007年5月，44(12)：3112-3121对示例性人源化ox40抗体进行了描述，并且该抗体具有以下序列(seqidno：27)：
aplatdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkellgggsikqiedkieeilskiyhieneiarikkligerghgggsnsqvshryprfqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl
9b12是鼠类igg1，针对人ox40(cd134)的细胞外结构域的抗ox40mab(weinberg，a.d.等人，jimmunother[免疫学治疗杂志]29，575-585(2006))。由于9b12引发对于ox40信号传导的激动剂应答的能力、稳定性以及其通过杂交瘤的高水平产生，所以从一系列抗ox40单克隆抗体中选择9b12。对于在临床应用中的使用，将9b12mab用磷酸盐缓冲盐水(ph7.0)平衡，并且通过渗滤将它的浓度调节至5.0mg/ml。
“ox40配体”(“ox40l”)(也不同地称为肿瘤坏死因子配体超家族成员4、gp34、tax转录活化糖蛋白1、和cd252)在很大程度上被发现于抗原呈递细胞(apc)，并且可以在活化的b细胞、树突细胞(dc)、朗格汉斯细胞、浆细胞dc、和巨噬细胞上被诱导(croft，m.，(2010)annrevimmunol[免疫学年鉴]28：57-78)。其他细胞，包括活化的t细胞、nk细胞、肥大细胞、内皮细胞和平滑肌细胞可以在响应于炎性细胞因子(id.)中表达ox40l。ox40l特异性结合到ox40受体。人蛋白在美国专利6,156,878中有所描述。小鼠ox40l在美国专利5,457,035中有所描述。ox40l表达于细胞的表面上，并包括细胞内、跨膜和细胞外受体结合结构域。ox40l的功能活性可溶形式可以通过缺失细胞内和跨膜结构域来产生，如例如在以下专利中所描述的：美国专利号5,457,035；6,312,700；6,156,878；6,242,566；6,528,055；6,528,623；7,098,184；以及7,125,670，其披露内容出于所有目的结合在此。ox40l的功能活性形式是保留特异性结合到ox40的能力的形式，即具有ox40“受体结合结构域”的形式。一个实例是人ox40l的氨基酸51至183。确定ox40l分子或衍生物特异性结合到ox40的能力的方法在以下进行讨论。制备和使用ox40l以及其衍生物(诸如包含ox40l结合结构域的衍生物)的方法在以下专利中有所描述：美国专利号6,156,878；6,242,566；6,528,055；6,528,623；7,098,184；以及7,125,670，这些专利还描述包含连接到其他肽的ox40l可溶形式的蛋白质，如人免疫球蛋白(“ig”)fc区，这些蛋白质可以产生来促进ox40配体从培养细胞的纯化，或者增强在体内给予给哺乳动物之后分子的稳定性(还参见，美国专利号5,457,035和7,959,925，这两者均通过引用以其全文结合在此)。
如在此使用的，术语“ox40l”包括整个ox40配体、可溶性ox40配体、和ox40配体的功能性活性部分。在ox40l的定义内还包括的是ox40配体变体，其氨基酸序列与天然存在的ox40配体分子不同，但其保留特异性结合到ox40受体的能力。这些变体在以下专利中有所描述：美国专利号5,457,035；6,156,878；6,242,566；6,528,055；6,528,623；7,098,184；以及7,125,670。在相关的实施例中，本披露提供已经丧失特异性结合ox40的能力的ox40l的突变体，例如氨基酸51至183，其中人ox40l的受体结合域的位置180处的苯丙氨酸已被替换为丙氨酸(f180a)。
ox40激动剂包括融合蛋白，在该融合蛋白中，ox40l的一个或多个结构域共价地连接到一个或多个另外的蛋白结构域。可用作ox40激动剂的示例性ox40l融合蛋白在美国专利号6,312,700中有所描述，该专利的披露内容通过引用以其全文结合在此。在一个实施例中，ox40激动剂包括自组装成多聚体(例如，三聚体或六聚体)ox40l融合蛋白的ox40l融合多肽。这样的融合蛋白例如在美国专利号7,959,925中有所描述，该专利通过引用以其全文结合在此。该多聚体ox40l融合蛋白在增强受试者(尤其是人受试者)的抗原特异性免疫应答方面表现出增加的效力，这是由于其自发地组装成高度稳定的三聚体和六聚体的能力。
在另一个实施例中，能够组装成多聚体形式的ox40激动剂包括在n末端至c末端方向上包含以下各项的融合多肽：免疫球蛋白结构域，其中该免疫球蛋白结构域包括fc结构域、三聚化结构域，其中该三聚化结构域包括卷曲螺旋三聚化结构域；以及受体结合结构域，其中该受体结合结构域是ox40受体结合结构域，例如ox40l或ox40结合片段、其变体或衍生物，其中该融合多肽可以自组装成三聚体融合蛋白。在一个方面中，能够组装成多聚体形式的ox40激动剂能够结合到ox40受体并且刺激至少一种ox40介导的活性。在某些方面，该ox40激动剂包含ox40配体的细胞外结构域。
能够组装成多聚体形式的ox40激动剂的三聚化结构域用于促进单个ox40l融合多肽分子自组装成三聚体蛋白。因此，具有三聚化结构域的ox40l融合多肽自组装成三聚体ox40l融合蛋白。在一个方面中，该三聚化结构域是异亮氨酸拉链结构域(zipperdomain)或其他卷曲螺旋多肽结构。示例性卷曲螺旋的三聚化结构域包括：traf2(
medi6383是特异性结合到人ox40受体(tnfr家族成员)并通过人ox40受体触发信号传导的人ox40配体igg4p融合蛋白。medi6383由三个不同的结构域构成：(1)形成同源三聚体并结合ox40受体的人ox40配体细胞外受体结合结构域(rbd)；(2)使ox40配体rbd的同源三聚体结构稳定的从tnfr相关因子2衍生的异亮氨酸拉链三聚化结构域；以及(3)人igg4片段可结晶γ(fcγ)结构域，该结构域促进融合蛋白在结合到ox40受体时的fcγ受体聚集，并且在铰链区(igg4p)包含丝氨酸至脯氨酸取代以提升两组ox40配体rbd同源三聚体的稳定性。
在具体的实施例中，ox40激动剂被修饰以增加其血清半衰期。例如，ox40激动剂的血清半衰期可以通过与异源分子如血清白蛋白、抗体fc区或peg缀合来增加。在某些实施例中，ox40激动剂可以与其他治疗剂或毒素缀合以形成免疫缀合物和/或融合蛋白。在某些方面，ox40激动剂可以进行配制以便有助于给予且促进活性剂的稳定性。
抗体
选择性结合ctla-4和pd-l1并且抑制ctla-4和pd-l1的结合或活化的抗体可用于本发明方法。选择性结合并活化ox40的抗体在本发明的这些方法中是有用的。
一般而言，抗体的制备可以例如使用传统的杂交瘤技术(kohler和milstein(1975)nature[自然]，256：495-499)、重组dna方法(美国专利号4,816,567)、或用抗体、文库进行的噬菌体展示(clackson等人(1991)nature[自然]，352：624-628；marks等人(1991)，j.mol.biol.[分子生物学杂志]，222：581-597)。对于其他抗体生产技术，还参见antibodies：alaboratorymanual[抗体：实验室手册]，编辑harlow等人，coldspringharborlaboratory[冷泉港实验室]，1988。本发明不限于任何具体的来源、起源物种、生产方法。
完整抗体，又称为免疫球蛋白，典型地是四聚体糖基化蛋白质，该四聚体糖基化蛋白质由每个大约25kda的两条轻(l)链和每个大约50kda的两条重链(h)构成。被指定为λ链和κ链的两种类型的轻链被发现于抗体中。根据重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分为五个大类：a、d、e、g、和m，并且有些可进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、和iga2。
不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型在本领域中是公知的。对于抗体结构的综述，参见哈洛(harlow)等人，见上文。简单地说，每个轻链由一个n-末端可变结构域(vl)和一个恒定结构域(cl)构成。每个重链由一个n-末端可变结构域(vh)，三个或四个恒定结构域(ch)和铰链区构成。最邻近vh的ch结构域被指定为ch1。vh和vl结构域由称为框架区(fr1、fr2、fr3、和fr4)的相对保守序列的四个区域组成，这些框架区为称为互补性决定区(cdr)的高变序列的三个区域形成一个支架。cdr包含大多数负责与抗原特异性相互作用的残基。三个cdr被称为cdr1、cdr2和cdr3。重链上的cdr组分被称为h1、h2和h3，而轻链上的cdr组分相应地被称为l1、l2、和l3。cdr3和特别是h3，是抗原结合结构域中分子多样性的最大来源。例如，h3可以是短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸残基。
fab片段(抗原结合片段)由通过恒定区之间的二硫键共价连接的vh-ch1和vl-cl结构域组成。为了克服fv中非共价连接的vh和vl结构域在宿主细胞中共表达时离解的倾向，可构建一个所谓的单链(sc)fv片段(scfv)。在scfv中，柔性和足够长的多肽将vh的c末端链接至vl的n-末端或将vl的c末端链接至vh的n-末端。最通常地，一个15残基的(gly4ser)3肽(seqidno：28)可用作接头，但是其他接头在本领域中也是已知的。
抗体多样性是编码可变区和各种体细胞事件的多个种系基因的组合装配的结果。体细胞事件包括具有多样性(d)的可变基因区段和连接(j)基因区段的重组来构成一个完整的vh区以及可变基因区段和连接基因区段的重组来构成一个完整的vl区。重组过程本身是不精确的，导致在v(d)j交叉点的氨基酸的缺失或添加。多样性的这些机制发生在抗原暴露之前的发育的b细胞中。抗原刺激后，b细胞中表达的抗体基因经历体细胞突变。
基于种系基因区段的估计的数目、这些区段的随机重组和随机vh-vl配对，可产生多达1.6×107个不同的抗体(fundamentalimmunology[基础免疫学]，第3版，paul编著，ravenpress[雷文出版社]，纽约州纽约市，1993)。当将促进抗体多样性(如体细胞突变)的其他方法考虑在内时，据认为可以潜在地产生多于1×1010个不同的抗体(immunoglobulingenes[免疫球蛋白基因]，第2版，编辑jonio等人，academicpress，sandiego，calif.[加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社]，1995年)。因为许多方法涉及抗体多样性，独立地产生的抗体在多个cdr中将具有相同或甚至基本上相似的氨基酸序列是极不可能的。
在此提供了示例性抗-ctla-4和抗-pd-l1cdr的序列。用于携带cdr的结构将大体上是一个抗体重链或轻链或其一部分，其中该cdr位于对应于天然存在的vh和vl的cdr的位置。可以确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置，例如，如描述于kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest[免疫学感兴趣的蛋白质序列]，第91-3242号，nationalinstitutesofhealthpublications，bethesda，md.[马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院出版物]，1991年。
本发明的抗体(例如，抗-ctla-4、抗-pd-l1、抗-ox40)可以任选地包括抗体恒定区或其部分。例如，vl结构域可以具有在其c-末端附接的抗体轻链恒定结构域，包括人cκ或cλ链。类似地，基于vh结构域的特定的抗原结合结构域可以具有附接一个免疫球蛋白重链的全部或一部分，该免疫球蛋白重链起源于任何抗体同位素，例如igg、iga、ige和igm，和任何该同位素子类，其包括但不限于igg1和igg4。
本领域的普通技术人员将认识到，本发明的抗体可用于检测、测量和抑制与ctla-4和pd-l1有些不同的蛋白质。这些抗体预计有望保持结合的特异性，只要靶蛋白质包括与至少100、80、60、40、或20个连续氨基酸的任何序列(如在此所述)具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、或更高一致性的序列。百分比一致性是通过标准比对算法来确定，这些标准比对算法例如像altshul等人(1990，j.mol.biol.[分子生物学杂志]，215：403-410)描述的基本局部比对工具(blast)，needleman等人(1970，分子生物学杂志，48：444-453)的算法，或迈耶斯(meyers)等人(1988，comput.appl.biosci.[计算机应用生物科学]，4：11-17)的算法。
除了序列同源性分析，可以进行表位作图(参见，例如，epitopemappingprotocols[表位作图实验方案]，编辑morris，humanapress[胡玛纳出版社]，1996)和二级和三级结构分析以鉴定由所披露的抗体假定的具体3d结构和它们与抗原的复合物。这些方法包括但不限于：x射线晶体学(engstom(1974)biochem.exp.biol.[生物化学实验生物学]，11：7-13)和本披露抗体的虚拟表现形式的计算机建模(fletterick等人(1986)computergraphicsandmolecularmodeling[计算机图形学和分子建模]，在currentcommunicationsinmolecularbiology[分子生物学现代通讯]中，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.[冷泉港实验室，纽约州冷泉港])。
衍生物
本发明的抗体(例如抗-ctla-4、抗-pd-l1、抗-ox40)可以包括这些序列的变体，其保留了特异性结合它们的靶标的能力。这些变体可以由熟练的技术人员通过使用本领域中公知的技术从这些抗体的序列中衍生而来。例如，可以在fr和/或cdr中制造氨基酸取代、缺失、或添加。虽然fr的改变一般被设计来改进抗体的稳定性及免疫原性，而cdr的改变典型地被设计来增加抗体对它的靶标的亲和力。fr的变体还包括天然存在的免疫球蛋白同种异型。这些亲和力增加的变化可凭经验通过涉及改变cdr和测试其靶标的亲和抗体的常规技术来确定。例如，可以在所披露的cdr中的任何一个中制造保守的氨基酸取代。可以根据antibodyengineering[抗体工程]，第2版，牛津大学出版社，编辑在borrebaeck，1995年中描述的方法进行各种改变。这些包括但不限于由在序列内编码功能上等同的氨基酸残基的不同密码子的取代改变的核苷酸序列，从而产生“沉默”的变化。例如，非极性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸以及组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
本发明的抗体的衍生物和类似物可以通过本领域中公知的各种技术来生产，这些技术包括重组的和合成的方法(maniatis(1990)molecularcloning，alaboratorymanual[分子克隆，实验室手册]，第2版，冷泉港实验室，纽约州冷泉港；和bodansky等人(1995)thepracticeofpeptidesynthesis[肽合成的实践]，第2版，施普林格出版社，德国柏林)。
在一个实施例中，用于制造为本发明vh结构域的氨基酸序列变体的vh结构域的方法包括在当前披露的vh结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代、或插入一个或多个氨基酸的一个步骤，任选地将这样提供的vh结构域与一个或多个vl结构域组合，并测试该vh结构域或vh/vl组合或特异性结合抗原的组合。可使用类似方法，其中将在此披露的vl结构域的一个或多个序列变体与一个或多个vh结构域组合。
由stemmer(nature[自然](1994)370：389-391)也披露了类似改组或组合技术，stemmer描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术但观察到该方法可用于产生抗体。
在进一步的实施例中，人们可以使用一个或多个选择的vh和/或vl基因的随机诱变产生携带源自在此所披露的序列的一个或多个序列的新颖的vh或vl区。gram等人(proc.nat.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊](1992)89：3576-3580)描述了一种这样的技术，易错pcr。
可使用的另一个方法是将诱变引导至vh或vl基因的cdr。barbas等人(proc.nat.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊](1994)91：3809-3813)和schier等人(j.mol.biol.[分子生物学杂志](1996)263：551-567)披露了这些技术。
类似地，一个或多个或所有三个cdr可以接合至vh或vl结构域的谱系中，然后针对对ctla-4或pd-l1特异的抗原结合片段对这些结构域进行筛选。
免疫球蛋白可变结构域的一部分将包括大致上如在此阐述的cdr中的至少一个，以及任选地，来自如在此阐述的scfv片段的干预框架区。该部分可以包括fr1和fr4中的一个或两个的至少约50％，该50％是fri的c-末端50％和fr4的n-末端50％。可变结构域的实质性部分的n-末端或c-末端端部的另外残基可以是通常不与天然存在的可变结构域区域相关联的那些残基。例如，通过重组dna技术构建抗体可以导致由所引入的接头编码的n-或c-末端残基的引入，以便促进克隆或其他操纵步骤。其他操纵步骤包括引入接头以便将可变结构域接合到另外的蛋白质序列，这些蛋白质序列包含免疫球蛋白重链恒定区、其他可变结构域(例如在双抗体的产生中)、或蛋白质标记，如在以下更详细地讨论的。
熟练的技术人员将认识到，本发明的抗体可以包括抗原结合片段，该抗原结合片段仅包含来自vl或vh结构域的单个cdr。这些单链特异性结合结构域中的任一个可以用于筛选能够形成一个双结构域特异性抗原结合片段的互补结构域，该抗原结合片段能够例如结合到ctla-4和pd-l1。
在此所述的本发明的抗体(例如，抗-ctla-4和/或抗-pd-l1)可连接至另一功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(白蛋白、另一种抗体等)。例如，这些抗体可以通过化学交联或通过重组方法连接。这些抗体还可以按以下专利中所列出的方式连接至多种非蛋白质聚合物例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯中的一种：美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337。抗体可以通过共价轭合至聚合物来进行化学修饰，例如增加其循环半衰期。附接这些抗体的示例性聚合物和方法还在美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285，和4,609,546。
所披露的抗体还可以改变以具有与天然模式不同的糖基化模式。例如，一个或多个碳水化合物部分可以被删除和/或一个或多个糖基化位点可以被添加到原始抗体。将糖基化位点添加到当前披露的抗体可以通过改变氨基酸序列以包含本领域中已知的糖基化位点共有序列来实现。在抗体上增加碳水化合物部分的数量的另一种方式是通过使糖苷与抗体的氨基酸残基进行化学或酶促偶联。这些方法描述在wo87/05330中以及在aplin等人(1981)crccrit.rev.biochem.[crc生物化学关键评论]，22：259-306中。将任何碳水化合物部分从抗体除去可以通过化学或酶促方法来实现，例如，如hakimuddin等人(1987)，arch.biochem.biophys.[生物化学与生物物理学集刊]，259：52；以及edge等人(1981)anal.biochem.[分析生物化学]，118：131；以及通过thotakura等人(1987)meth.enzymol.[酶学方法]，138：350所描述的。抗体也可以用可检测或功能标记来加标记。可检测标记包括放射性标记，如131i或99tc，可使用常规化学来将它们附接至抗体。可检测标记还包括酶标记，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。可检测标记进一步包括化学部分(如生物素)，其可经由结合至特定同源可检测部分(例如标记的抗生物素蛋白)来检测。
在本发明的范围内涵盖cdr序列仅在非本质上与在此所阐述的抗体不同的抗体。典型地，一个氨基酸被具有类似电荷、疏水性或立体化学特征的相关氨基酸取代。这些取代将在技术人员的普通技能之内。不像在cdr中，可以在fr中进行更多实质性的改变，而不对抗体的结合性质造成不利影响。对fr的改变包括但不限于人源化非人衍生的或工程化对于抗原接触或对于稳定结合位点是重要的的某些框架残基，例如，改变恒定区的类或亚类、改变可以改变效应子功能(如fc受体结合)的特定氨基酸残基(例如，如描述在美国专利号5,624,821和5,648,260；以及lund等人(1991)j.immun[免疫学杂志].147：2657-2662以及morgan等人(1995)immunology[免疫学]86：319-324中的)、或改变恒定区衍生的种类。
本领域的技术人员将理解，以上所述的改变不是全部详尽的，并且由于本披露的传授，许多其他的改变将对熟练的技术人员是显而易见的。
组合疗法
使用本发明的组合，如在此提供的抗-ctla-4抗体、抗-pd-l1抗体或其抗原结合片段、和ox40激动剂或其抗原结合片段来治疗患有实体瘤的患者可以导致加和效应或协同效应。如在此使用，术语“协同”是指组合疗法(例如，抗-ctla-4抗体、抗-pd-l1抗体、或其抗原结合片段、和ox40配体融合蛋白的组合)。
组合疗法(例如，抗-ctla-4抗体、抗-pd-l1抗体或其抗原结合片段、和ox40配体融合蛋白的组合)的协同效应允许使用更低剂量的一种或多种治疗剂和/或向患有实体瘤的患者以更小的频率给予所述治疗剂。利用更低剂量的治疗剂和/或以更少频率给予所述疗法的能力减少与向受试者给予所述疗法相关的毒性而不降低所述疗法在实体瘤的治疗中的功效。此外，协同效应可以导致治疗剂在实体瘤的管理、治疗或改善中改进的功效。治疗剂的组合的协同效应可避免或减少与使用任一单一疗法相关的不良或不需要的副作用。
在组合疗法中，抗-ctla-4抗体、抗-pd-l1抗体或其抗原结合片段、和ox40配体融合蛋白的组合可以任选地被包括在相同的药物组合物中，或可以被包括在一种或多种单独的药物组合物中。在某些方面，根据本披露的药用组合物包含药学上可接受的、无毒性的、无菌的载体，如生理盐水、无毒性的缓冲剂、防腐剂等。用于在此披露的治疗方法中使用的合适配制品在例如，remington′spharmaceuticalsciences[雷明顿氏药物科学])mackpublishingco.[mack出版公司]，第16版(1980)中有所描述。
试剂盒
本发明提供了用于增强抗肿瘤活性的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒包括含有抗-ctla-4抗体、抗-pd-l1抗体、和ox40激动剂(例如，ox40配体融合蛋白)的治疗性组合物。
在一些实施例中，该试剂盒包括一个包含治疗性组合物的无菌容器；此类容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管子、袋子、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其他适合的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容纳药物的其他材料制成。
如果需要的话，该试剂盒进一步包括用于给予本发明的治疗组合的说明书。在具体实施例中，这些说明书包括以下各项中的至少一种：治疗剂的描述；用于增强抗肿瘤活性的剂量日程表和给予；注意事项；警告信息；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。这些说明书可以直接打印在容器(当存在时)上，或作为标签应用于容器，或作为单独的页、小册子、卡片、或在容器中或一起提供的文件夹。
除非另外指明，本发明的实施采用很好地处在熟练的技术人员的见识范围之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这些技术在文献中已被充分解释，例如“molecularcloning：alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]”，第2版(sambrook，1989)；“oligonucleotidesynthesis[寡核苷酸合成]”(gait，1984)；“animalcellculture[动物细胞培养]”(freshney，1987)；“methodsinenzymology[酶学方法]”、“handbookofexperimentalimmunology[实验免疫学手册]”(weir，1996)；“genetransfervectorsformammaliancells[用于哺乳动物细胞的基因转移载体]”(miller和calos，1987)；“currentprotocolsinmolecularbiology[当前分子生物学方法]”(ausubel，1987)；“pcr：thepolymerasechainreaction[pcr：聚合酶链式反应]”(mullis，1994)；“currentprotocolsinimmunology[免疫学现代实验方案]”(coligan，1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，并且按照这样，可以被考虑用于制作和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。
给出以下的实例是为了给本领域普通技术人员提供如何准备和使用测定、筛选和本发明的治疗方法的一个完整的披露和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。
实例
实例1.ox40配体融合蛋白、抗-ctla-4抗体、和抗-pd-l1抗体的组合抑制同源模型中癌细胞系的生长
在mca205，小鼠同源肉瘤模型中，将mox40lfp(小鼠ox40配体融合蛋白)、抗-pd-l1(10f.9g2)、和抗-ctla-4(9d9)的抗肿瘤活性作为单一疗法、作为双重组合疗法、或作为三重组合疗法进行评估。相比给予对照样品或给予单独的上述药剂中的任一种或以双重组合给予，mox40lfp与10f.9g2和9d9的组合给予导致更高的抗肿瘤活性。
如下获得测试样品：抗-ctla-4(9d9，bioxcell公司，西黎巴嫩，新罕布什尔州)；抗-pd-l1(10f.9g2，bioxcell公司，西黎巴嫩，新罕布什尔州)；和ox40lfp(小鼠ox40l融合蛋白，米迪缪尼有限公司(medimmune)，盖瑟斯堡，马里兰州)。medi6383、medi4736、和曲美木单抗分别不识别小鼠ox40、pd-l1、或ctla-4。产生了鼠类ox40配体igg1融合蛋白(mox40lfp)，该融合蛋白结合小鼠ox40、触发ox40进行信号传导、并且被用作medi6383的替代小鼠ox40激动剂。10f.9g2是针对小鼠pd-l1的可商购的大鼠igg2b抗体；并且9d9是针对小鼠ctla-4的可商购的小鼠igg2b抗体。因此，预期作用和/或活性对应于在人类中的作用和/或活性(例如，当使用人抗体、氨基酸序列等时)。如下获得对照样品：ox40lfpy182a(具有y至a的氨基酸取代的小鼠ox40配体融合蛋白，米迪缪尼有限公司，盖瑟斯堡，马里兰州)；小鼠igg2b同种型对照(mpc-11，bioxcell公司，西黎巴嫩，新罕布什尔州)；和大鼠igg2b同种型对照(mpc-11，bioxcell公司，西黎巴嫩，新罕布什尔州)。y182a突变体小鼠ox40l小鼠igg1融合蛋白对照包括在受体结合结构域中位置182处具有单个氨基酸突变(y至a的氨基酸变化)的mox40lfp，该mox40lfp防止mox40l结合小鼠ox40，但不影响mox40l的总体结构。ox40lfpy182a不结合天然的小鼠或人ox40，并且因此充当用于ox40l：ox40相互作用的阴性对照。
在c57bl/6小鼠中建立如下mca205同源肿瘤。mca205细胞获得自普罗维登斯癌症中心(providencecancercenter)(波特兰，俄勒冈州)，并且使其在rpmi1640培养基(洛斯维公园纪念研究所(roswellparkmemorialinstitute)1640培养基，生命技术公司(lifetechnologies)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中生长，该1640培养基补充有10％胎牛血清(生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。mca205是化学诱导的小鼠软组织肉瘤肿瘤细胞。通过将悬浮于0.1ml磷酸盐缓冲盐水中的2.5×105mca205细胞皮下(sc)注射至7至9周龄雌性c57bl/6小鼠(哈兰实验室公司，印第安纳波利斯，印第安纳州)的右侧翼来建立同种异体移植物。c57bl/6(总共108只)雌性小鼠用于此研究。移植后11天，在肿瘤长到每个组平均体积为185mm3±1mm3之后随机分配c57bl/6小鼠。将组名称、动物数目、剂量水平和剂量时间表呈现于表1中。
表1研究设计：mca205同源模型
f＝雌性；同种型对照混合物含有分别具有migg2b、rigg2b、和migg1的fc结构域的克隆mpc-11、ltf2、和mox40lfpy182a；ip＝腹膜内；m/f＝雄性/雌性；mab＝单克隆抗体；mox40lfp＝鼠类ox40配体鼠类igg1融合蛋白；na＝不可用，因为这些动物未经治疗；roa＝给予途径。
a剂量体积：0.2ml。
通过腹膜内的(ip)注射给予所有测试样品和对照样品。没有动物替换。针对不良的临床体征每天监测、且针对体重每两周监测小鼠的一般健康状况。如果注意到后肢麻痹、呼吸窘迫、20％体重损失、肿瘤体积大于2000mm3或溃烂或坏死的肿瘤，立即通过用co2窒息人道地将动物处死。所有实验均按照aaalac和米迪缪尼有限公司iacuc指南进行以便进行人道治疗和实验动物照料。
每周三次或两次使用卡尺测量肿瘤，并且使用以下公式：肿瘤体积＝[长度(mm)×宽度(mm)2]/2(其中长度被定义为较长的边，并且宽度被定义为垂直于长度的较短的边)来计算肿瘤体积。每个组的抗肿瘤作用被表示为肿瘤生长抑制(tgi)，其如下计算：百分比tgi＝(1-t/c)×100，其中，t＝末次剂量后来自治疗组的最终肿瘤体积，并且c＝末次剂量后来自对照组的最终肿瘤体积。如果治疗后没有可测量的肿瘤，则肿瘤生长应答被归类为完全应答(cr)。
单因子方差分析(one-wayanova)被用于确定平均肿瘤体积差异。在显著的f测试的情况下，使用邓尼特的(dunnett’s)或sidak’s多重比较试验(适用时)。适用时，对肿瘤体积应用log10转化来解释异方差性。p值＜0.05被认为是显著的。使用对数秩检验(logranktest)来比较成对的存活曲线。将bonferroni校正应用于多重比较以控制总i型错误率(familywiseerrorrate)。用于windows的prism6.03用来进行分析。p值＜0.05(未调整的)被认为是显著的。
相比未经治疗的和同种型对照组小鼠，用mox40lfp、抗-ctla-4mab、和抗-pd-l1mab作为单一药剂来治疗小鼠组，导致mca205肿瘤细胞的生长降低(表2，图1a)。相比用每一种单独的对应药剂，用抗-ctla-4mab和抗-pd-l1mab的组合对小鼠进行治疗导致mca205肿瘤细胞的肿瘤生长的水平相似(表2，图1a)。相比单独的抗-pd-l1mab和单独的抗-ctla-4mab、或相比对照组、但不与单独的mox40lfp相比，用mox40lfp与抗-pd-l1mab或抗-ctla-4mab的组合对小鼠进行治疗使mca205肿瘤细胞的生长降低(表2，图1a)。相比对照组、单独的每种治疗剂、或这些药剂中的任何两种的组合，用mox40lfp与抗-pd-l1mab和抗-ctla-4mab的组合对小鼠进行治疗使mca205肿瘤细胞的生长降低(表2，图1a)。
表2在mca205同源模型中的治疗组、在第25天的百分比tgi、和完全应答者的数目
ip＝腹膜内；na＝不可用的；tgi＝肿瘤生长抑制；v＝体积。
an＝11
b对于mox40lfp，所有动物在第11和15天接受200μl测试样品ip，并且对于抗-ctla-4mab和抗-pd-l1mab，所有动物在第11、15、18、和22天接受200μl测试样品ip。
c％tgi＝[1-(治疗组的平均肿瘤v)÷(同种型对照组的平均肿瘤v)]×100
d在研究结束时具有肿瘤体积测量被记录为0的组的动物的数目。
通常在同源模型中观察到各个动物之间的反应异质性。然而，当用于组合疗法时，对mox40lfp、抗-ctla-4mab、和抗-pd-l1mab的应答增加从各个动物肿瘤生长曲线图(图1b-1d)中是显而易见的。由于大肿瘤尺寸，在第45天对未经治疗的和同种型对照治疗的动物实施安乐死(图1b)。
相对于用单独的抗体作为单一疗法在相同的剂量水平下进行的治疗，抗-ctla-4mab与抗-pd-l1mab的组合给予没有导致抗肿瘤活性增加(如通过百分比tgi和cr数目定义的)(表2，图1c)。与用抗-ctla-4mab治疗的11只小鼠中的0只和用单独的抗-pd-l1mab治疗的11只小鼠中的1只相比，在组合疗法的组中的11只小鼠中都没有观察到完全应答(表2)。
相对于用单独的mox40lfp作为单一疗法在相同剂量水平下进行的治疗，抗-ctla-4mab与mox40lfp的组合给予导致相似的抗肿瘤活性(如通过相似的百分比tgi和cr数目定义的)(表2，图1d)；相对于用单独的抗-ctla-4mab作为单一疗法在相同剂量水平下进行的治疗，导致更高的抗肿瘤活性(如通过百分比tgi和cr数目定义的)(表2，图1d)。与用抗-ctla-4mab治疗的11只小鼠中的0只和经单独的mox40lfp治疗的11只小鼠中的2只相比，在组合疗法的组中的11只小鼠中有5只观察到完全应答(表2)。
相对于用单独的药剂作为单一疗法或双重疗法组合在每种处于相同剂量水平下进行的治疗，抗-ctla-4mab和抗-pd-l1mab一起与mox40lfp的组合给予导致抗肿瘤活性增加(如通过更高的tgi和更多数目的cr定义的)(表2，图1d)。与用抗-ctla-4/pd-l1mab组合治疗的11只小鼠中的0只、经抗-ctla-4/mox40lfp组合治疗的11只小鼠中的5只、和经抗-pd-l1/mox40lfp组合治疗的11只小鼠中的3只相比，在三重组合的组中的11只小鼠中有8只观察到完全应答(表2)。
未经治疗的小鼠或给予同种型对照或抗-ctla-4mab的小鼠均未存活到研究结束，其中小鼠的中位存活时间分别是23天、23天、和29天(图1e)。对于每种药剂，抗-pd-l1mab或mox40lfp的给予导致中位存活时间增加至31天。在分别给予抗-pd-l1mab和mox40lfp之后，11只小鼠中的1只和11只小鼠中的2只存活到研究结束(在第70天)(图1e)。
当在相同剂量水平下用作单一疗法时，相对于用单独的任一种抗体进行的治疗，抗-ctla-4mab与抗-pd-l1mab的组合给予没有导致活性增加(图1f)。当与29天(抗-ctla-4mab)和31天(抗-pd-l1mab)相比时，中位存活时间是31天。没有动物存活到该研究结束。
当在相同剂量水平下用作单一疗法时，相对于用单独的任一种抗体进行的治疗，抗-ctla-4mab与mox40lfp的组合给予导致活性增加(图1f)。当与31天(抗-pd-l1mab)和31天(mox40lfp)相比时，中位存活时间是45天。另外，当与11只小鼠中的1只(抗-pd-l1mab)和11只小鼠中的2只(mox40lfp)相比时，在抗-pd-l1mab/mox40lfp组合的组中的11只小鼠中有3只存活到研究结束。
相对于用单独的任一种药剂或用这些药剂的双重组合在相同剂量水平下进行的治疗，抗-ctla-4与抗-pd-l1mab和mox40lfp的组合给予导致活性增加(图1f)。由于存活到研究结束的动物数目，对于三重组合的组计算中位存活时间是不可能的。另外，当与用抗-ctla-4/pd-l1mab组合治疗的11只小鼠中的0只(p＝0.0002；显著的)、用抗-ctla-4/mox40lfp组合治疗的11只小鼠中的5只(p＞0.05；不显著的)、以及用抗-pd-l1/mox40lfp组合治疗的11只小鼠中的3只(p＝0.21；不显著的)相比(使用针对多重比较的bonferonni调整，对存活曲线进行成对比较)时，在三重组合的组中的11只小鼠中有8只存活到研究结束(图1f)。
其他实施例
从前述说明中，将显而易见的是，可以对在此所述的发明作出变更和修改以使其适应于各种用途和状况。这些实施例也在下述权利要求的范围内。
在此变量的任何定义中对要素清单的叙述包括将所述变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或次组合)。本文中的实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。
本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用以与如同每份单独的专利和出版物具体地且个别地指出通过引用结合相同的程度结合在此。
序列表
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序列表
<110>米迪缪尼有限公司
<120>用于治疗瘤形成的治疗组合和方法
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<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400>27
alaproleualathrasplysthrhisthrcysproprocysproala
151015
progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro
202530
lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval
354045
valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval
505560
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65707580
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165170175
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275280285
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<221>来源
<223>/注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400>28
glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser
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