针对猪流感病毒的基于纳米粒子的疫苗策略的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年5月26日提交的美国临时申请no.62/166,344的权益，该美国临时申请据此全文以引用方式并入本文。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在政府支持下进行的，授权号no.2013-67015-20476，由美国国立食品与农业研究院(nationalinstituteoffoodandagriculture)提供资金。美国政府在本发明中享有部分权利。

背景技术：

猪流感是由正粘病毒科(orthomyxoviridaefamily)的甲型流感病毒(iav)引起的猪急性呼吸道感染。目前，h1n1、h1n2和h3n2亚型的iav在猪中引起大部分感染。由于猪既存在禽类iav受体(α2,3gal)，又存在人类iav受体(α2,6gal)，所以可能潜在地充当不同iav的“混合器”。感染流感的猪中的急性临床体征包括高热、厌食、呼吸窘迫、流鼻涕和咳嗽。流感在养猪业中通过发病、身体增重损失、上市时间延长、对支原体和猪生殖与呼吸综合征(prrs)这样的继发性细菌和病毒感染的易感性、药物和兽医费用而造成重大经济损失。一些猪流感病毒(swiv)也可以从猪传播给人类，从而产生公共健康风险。例如，2009年，除了因年度季节性流感感染造成的约50万人死亡之外，h1n1猪流感病毒感染了全球人口的约20％并导致约20万人死亡。

接种疫苗是控制流感最有效的手段之一。目前可商购获得用于猪的猪流感疫苗。由于正在传播的流感病毒在动物中的突变率很高，所以该领域中商业疫苗的功效总是很差。商业多价疫苗与佐剂在肌内共同施用作为初免-加强免疫策略，提供了同源保护，但异源保护的效果很弱。肌内接种疫苗不会诱导所需水平的局部粘膜抗体免疫应答和细胞免疫应答；另外，还有关于灭活疫苗加重呼吸疾病的报道。因此，由于猪流感对养猪业造成持续的经济负担并且产生人畜共患传播的潜在风险，所以有必要研发存在广泛交叉保护性的疫苗平台。

技术实现要素：

本文公开了用于治疗或预防受试者中的猪流感的方法和组合物。具体地，本文公开了一种包含灭活的猪甲型流感病毒和聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(plga)纳米粒子的免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述组合物和/或纳米粒子还包含佐剂。

在一些实施方案中，所述灭活的猪甲型流感病毒为猪甲型流感病毒的h1n1、h1n2或h3n2毒株。

还公开了在药学上可接受的载体中包含所公开的免疫原性组合物的疫苗。

还公开了一种在猪中诱发针对猪甲型流感病毒的免疫应答的方法，包括向猪施用所公开的疫苗。

在一些实施方案中，经鼻内施用所述疫苗。

在附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据下面的描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目标和优点将显而易见。

附图说明

图1：plga-kagnp的体外物理表征及其在apc成熟中的作用。(a)plga-kag的表面形态(10k倍放大率)。(b)plga-kag的尺寸分布。基于确定200个纳米粒子的尺寸来计算百分比。(c)plga-kag在4周时期内的体外蛋白释放曲线。用plga-kag治疗对猪(d)modc和(e)巨噬细胞上的共刺激分子cd80/86的表达的影响。通过单因素方差分析(onewayanova)，然后是tukey事后比较检验(tukey’spost-hoctest)来分析数据。星号是指两个指示的猪组之间的统计学显著差异(*p<0.05；**p<0.01；并且***p<0.001)。

图2：用plga-kag进行过疫苗接种的猪在受攻击前的细胞免疫应答和体液免疫应答。重新刺激在dpv35/dpc0初免-加强免疫疫苗接种之后分离的pbmc，并且确定针对(a)同源疫苗病毒(swivh1n2)和(b)异源攻击病毒(swivh1n1)的特异性淋巴细胞增殖。在dpc0通过流式细胞术分析确定pbmc中的以下细胞的频率：(c)cd3+cd4+cd8α+细胞；(d)cd3+cd4+cd8αβ+细胞；(e)cd3+δ+γδt细胞。对于体液免疫应答评估，确定了针对同源疫苗病毒(swivh1n2)，在1:200的稀释度下，(f)血浆中的hi滴度和(g)血浆中的igg抗体应答。通过单因素方差分析，然后是tukey事后比较检验来分析数据。星号是指两个指示的猪组之间的统计学差异(*是指p<0.05；**是指p<0.01；并且***是指p<0.001)。

图3：plga-kag疫苗接种的鼻内途径减轻了由猪中的异源病毒攻击引起的临床流感。(a)使用多剂量递送装置，用kag或plga-kag作为雾状物经鼻内对猪进行疫苗接种。(b)每日在攻击后记录猪的直肠体温。

图4：用plga-kag进行过疫苗接种并且用强毒性病毒攻击过的猪中的肺病变减轻。示出了每个实验猪组的代表性肺部照片：(a)用箭头指示肉眼可见的肺实质化病变；(b)由h&e染色的微观肺切片；以及(c)免疫组织化学分析肺切片的swiv抗原。

图5：代表性的流式细胞术图形示出了猪淋巴细胞的设门模式。用swivh1n1重新刺激在dpc6从用plga-kag进行过疫苗接种并用病毒攻击过的猪分离的pbmc，并且用golgiplug/阻断剂加以处理，接着使用猪特异性淋巴细胞表面标记、随后是细胞内ifnγ进行免疫染色，最后估计了活化(ifnγ+)淋巴细胞亚群的频率。示出了用cd4α、cd8α、cd8β和ifnγ染色的同种型和淋巴细胞特异性标记的设门模式，该模式用于鉴别cd3-ifnγ+细胞、cd3-cd4-cd8α+ifnγ+细胞、cd3+ifnγ+细胞、cd3+cd4+cd8α-ifnγ+细胞、cd3+cd4+cd8α+ifnγ+细胞以及cd3+cd4-cd8αβ+ifnγ+细胞。

图6：用plga-kag进行过疫苗接种并用病毒攻击过的猪中的淋巴细胞回忆应答显著增强。在尸检当天(dpc6)，用疫苗或攻击病毒重新刺激分离的pbmc，并且通过流式细胞术确定活化(ifnγ+)淋巴细胞的频率。淋巴细胞的平均频率：对来自所有实验猪组的(a)cd3+ifnγ+，(b)cd3-ifnγ+，(c)cd3+cd4+cd8α+ifnγ+，(d)cd3+cd4+cd8α-ifnγ+，(e)cd3+cd4-cd8αβ+ifnγ+和(f)cd3-cd4-cd8α+ifnγ+进行了定量。每个条指示7或9只猪的所指示淋巴细胞亚群的平均频率±sem。通过单因素方差分析，然后是tukey事后比较检验来分析数据。星号是指两个指示的猪组之间的统计学显著差异(*p<0.05；**p<0.01；并且***p<0.001)。

图7：用plga-kag进行过疫苗接种并用病毒攻击过的猪中的ifnγ分泌和回忆t细胞应答增强。用疫苗或攻击病毒重新刺激在dpc6分离的pbmc三天。(a)收获细胞培养物上清液，并且通过elisa确定分泌的ifnγ的水平。依据以下淋巴细胞的频率示出仅用plga-kag进行过疫苗接种且重新刺激过(swivh1n1或h1n2)或未受刺激(细胞对照，cc)的猪的pbmc中的回忆细胞应答：(b)cd3+ifnγ+；(c)cd3+cd4-cd8αβ+ifnγ+；以及(d)细胞培养物上清液中的分泌的ifnγ。虚线上方示出的细胞百分比表示无刺激时的特异性回忆t细胞应答。每个条指示7或9只猪的所指示淋巴细胞亚群的平均频率±sem。通过单因素方差分析，然后是tukey事后比较检验来分析数据。星号是指两个指示的猪组之间的统计学显著差异(*p<0.05；**p<0.01)。

图8：进行过疫苗接种并用病毒攻击过的猪中的体液免疫应答。猪的(a)未稀释鼻拭子中以及1:200稀释的(b)bal液和(c)肺溶胞产物样本中针对攻击swivh1n1的iga抗体应答。在1:200稀释的(d)血浆和(e)bal液样本中针对swivh1n1的igg应答。(f)bal液和(g)血浆中的hi滴度，以及bal液样本中的(h)vn滴度。通过单因素方差分析，然后是tukey事后比较检验来分析数据。星号是指两个指示的猪组之间的统计学显著差异(*p<0.05；***p<0.001)。

具体实施方式

本文公开了用于治疗或预防受试者中的猪流感的方法和组合物，这些方法和组合物涉及将灭活的猪甲型流感病毒与纳米粒子组合。

术语“受试者”是指为施用或治疗的目标的任意个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人类患者或兽医患者。术语“患者”是指接受临床医生(例如内科医生)治疗的受试者。

“免疫原性组合物”是适合施用于人类或动物受试者(例如，在实验环境中)，能够诱发例如针对病原体(诸如猪甲型流感病毒)的特异性免疫应答的物质组合物。因此，免疫原性组合物包含一种或多种抗原(例如完全纯化的病毒或其抗原性亚基，例如多肽)或抗原表位。免疫原性组合物还可以包含能够诱发或增强免疫应答的一种或多种附加组分，诸如赋形剂、载体和/或佐剂。在某些情况下，施用免疫原性组合物以诱发免疫应答，该免疫应答保护受试者对抗由病原体诱导产生的症状或病症。在一些情况下，通过在受试者暴露于病原体之后抑制该病原体的复制，来预防(或者治疗，例如减轻或改善)由该病原体引起的症状或疾病。在本公开的上下文中，术语“免疫原性组合物”将被理解为涵盖旨在出于诱发针对病毒的保护性或姑息性免疫应答的目的而向受试者或受试者群体施用的组合物(即，疫苗组合物或疫苗)。

“抗原”是可以刺激动物中产生抗体和/或t细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射、吸收或以其他方式引入到动物中的组合物。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。术语“表位”或“抗原决定簇”是指b细胞和/或t细胞对其作出应答的抗原上的位点。“优势抗原表位”或“优势表位”是针对其产生了功能上显著的宿主免疫应答(例如，抗体应答或t细胞应答)的那些表位。因此，就针对病原体的保护性免疫应答而言，优势抗原表位是在被宿主免疫系统识别时导致产生保护以免宿主患上由该病原体引起的疾病的那些抗原部分。术语“t细胞表位”是指在与适当的mhc分子结合时被t细胞特异性结合(经由t细胞受体)的表位。“b细胞表位”是被抗体(或b细胞受体分子)特异性结合的表位。抗原也可以影响先天性免疫应答。

“免疫应答”是免疫系统的细胞(诸如b细胞、t细胞或单核细胞)对刺激的应答。免疫应答可以是b细胞应答，其导致特异性抗体(诸如抗原特异性中和抗体)产生。免疫应答也可以是t细胞应答，诸如cd4+t细胞应答或cd8+t细胞应答。在某些情况下，所述应答对特定抗原是特异性的(即，“抗原特异性应答”)。免疫应答也可以包括先天性应答。如果抗原衍生自病原体，则抗原特异性应答是“病原体特异性应答”。“保护性免疫应答”是抑制病原体的有害功能或活性、减轻病原体感染或减少病原体感染所引起的症状(包括死亡)的免疫应答。可以例如通过在噬斑减少测定法或elisa中和测定法中抑制病毒复制或噬斑形成，或者通过在活体内测量对病原体攻击的抗性，来测量保护性免疫应答。

本文所公开的免疫原性组合物适用于预防、改善和/或治疗由病毒感染引起的疾病。

缩写“kag”代表被杀死的抗原，并且表示被杀死或灭活的病毒。灭活的病毒包含一种或多种免疫原性病毒蛋白，因此灭活的病毒可以被认为是被杀死的抗原。

缩写“np-kag”代表纳米粒子-被杀死的抗原。该缩写表示被纳米粒子包封的灭活的猪流感病毒。

如本文所用，术语“病毒样粒子”或“vlp”是指非复制的病毒外壳。vlp通常由与病毒表面衣壳结构相关联的一种或多种病毒蛋白组成。vlp可以在所述蛋白在适当的表达系统中重组表达时自发地形成。vlp在施用给动物时可以是免疫原性的，因此可以在动物中引起保护性或治疗性免疫应答。用于产生vlp的方法在本领域中通常是已知的，并且在下文更全面地讨论。在重组表达病毒蛋白之后是否存在vlp可以使用本领域中已知的常规技术来检测，诸如通过电子显微术、生物物理表征等。参见例如baker等人，biophys.j.(1991)60:1445-1456；hagensee等人，j.virol.(1994)68:4503-4505。例如，vlp可以通过密度梯度离心来分离并且/或者通过特征性密度条带效应来鉴别。

术语“治疗”是指对患者进行的意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍的医疗管理。该术语包括积极治疗，即治疗特别指向疾病、病理状况或障碍的改善，并且还包括病因治疗，即治疗指向去除相关疾病、病理状况或障碍的病因。此外，该术语包括姑息治疗，即治疗被设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理状况或障碍；预防性治疗，即治疗指向最小化或者部分抑制或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍的发展；以及支持治疗，即治疗用于补充另一种指向改善相关疾病、病理状况或障碍的特定疗法。

术语“预防”是指预先阻止或减慢疾病或病症的发作、或者降低疾病或病症的严重程度的治疗。因此，如果某种治疗可以治疗具有某种疾病症状的受试者中的这种疾病，则该种治疗还可以预防尚未遭受所述症状中的一些或全部症状的受试者中的这种疾病。

本文所述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以包含一种或多种纳米粒子。纳米粒子(与术语“纳米载体”可互换使用)的示例包括但不限于由一种或多种聚合物组成的纳米载体。在一些实施方案中，所述一种或多种聚合物为水溶性的非粘性聚合物。在一些实施方案中，聚合物为聚乙二醇(peg)或聚氧化乙烯(peo)。在一些实施方案中，所述聚合物为聚亚烷基二醇或聚亚烷基氧化物。在一些实施方案中，所述一种或多种聚合物为可生物降解的聚合物。在一些实施方案中，所述一种或多种聚合物为生物相容性聚合物，该生物相容性聚合物是水溶性的非粘性聚合物和可生物降解的聚合物的缀合物。在一些实施方案中，所述可生物降解的聚合物为聚乳酸(pla)、聚(乙醇酸)(pga)或聚(乳酸/乙醇酸)(plga)。在一些实施方案中，纳米载体由peg-plga聚合物组成。

在一些实施方案中，纳米载体通过自组装形成。自组装是指使用将以可预见的方式自身取向、从而可预见地且可再现地形成纳米载体的组分形成纳米载体的过程。在一些实施方案中，使用两亲生物材料形成纳米载体，所述两亲生物材料自身相对于彼此取向以形成尺寸、成分和成分布置可预见的纳米载体。在一些实施方案中，纳米载体为微米粒子、纳米粒子或皮米粒子。在一些实施方案中，微米粒子、纳米粒子或皮米粒子是自组装的。

在一些实施方案中，纳米载体具有正ζ电势。在一些实施方案中，纳米载体在中性ph下具有净正电荷。在一些实施方案中，纳米载体在其表面处包含一个或多个胺部分。在一些实施方案中，胺部分是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施方案中，胺部分是脂族胺。在一些实施方案中，纳米载体包含含胺聚合物。在一些实施方案中，纳米载体包含含胺脂质。在一些实施方案中，纳米载体包含在中性ph下带正电荷的蛋白质或肽。在一些实施方案中，纳米载体是乳胶粒子。在一些实施方案中，在其表面上具有一个或多个胺部分的纳米载体在中性ph下具有净正电荷。

纳米粒子可以帮助递送灭活的猪甲型流感病毒并且/或者也可以是免疫原性的。递送可以到达所关注的特定部位，例如粘膜。在一些实施方案中，纳米粒子可以建立灭活的猪甲型流感病毒的定时释放以增强和/或延长免疫应答。在一些实施方案中，纳米粒子与灭活的猪甲型流感病毒缔合，使得组合物可以诱发免疫应答。该缔合可以是例如其中纳米粒子与灭活的猪甲型流感病毒包埋或包封在一起。所谓包埋，意味着纳米粒子中物理包裹着灭活的猪甲型流感病毒。在一些实施方案中，灭活的猪甲型流感病毒通过水/油/水乳液法被包埋在纳米粒子内。在一些实施方案中，纳米粒子为聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(plga)。取决于用于聚合的丙交酯与乙交酯的比率，可以获得和利用不同形式的plga。这些形式典型地关于所用的单体的比率加以鉴别(例如，plga75:25鉴别为组成是75％乳酸和25％乙醇酸的共聚物)。在本发明中可以使用不同的比率，例如90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90，以及高于这些比率和在这些比率之间的数值。合适的纳米粒子的附加示例包括甲壳素(chitosin)，磷酸钙，各种细菌如大肠杆菌(e.coli)、分枝杆菌(mycobactera)、钩端螺旋体以及它们的混合物的脂质。在一个实施例中，所述组合物可以通过混合约180mgplga与约5mg灭活的猪甲型流感病毒(或约36mgplga与1mg灭活的猪甲型流感病毒)而得到。灭活的猪甲型流感病毒的包埋(包封)效率可以变化。在一个实施方案中，基于包埋中所使用的总猪甲型流感病毒蛋白的量计算，纳米粒子有50％至55％发生包埋/包封。包埋的灭活的猪甲型流感病毒可以作为包埋/包封的抗原与未包埋/未包封的抗原的混合物施用，或者可以进一步纯化包埋/包封的抗原。

在一些实施方案中，抗原来源于灭活或被杀死的猪甲型流感病毒。在一个实施方案中，用紫外光灭活或杀死猪甲型流感病毒。其他灭活手段包括化学灭活、热灭活或放射灭活。

任何适当免疫原性的灭活猪甲型流感病毒或猪甲型流感病毒抗原都可以用于所述组合物中。例如，猪甲型流感病毒抗原可以是猪甲型流感病毒表面糖蛋白。免疫原性抗原的示例包括重组得到的血凝素、神经氨酸苷酶、核衣壳和基质蛋白。猪甲型流感病毒抗原可以重组得到。

公开了包含病毒样粒子(vlp)和纳米粒子的组合物。所公开的组合物可以包含免疫原性的vlp。vlp类似于病毒，但并不具有感染性，因为其不含有任何病毒遗传物质。病毒结构蛋白(诸如衣壳)的表达可以促成vlp的自组装。vlp可以在多种细胞培养系统中产生，所述细胞培养系统包括哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母和植物细胞。例如，vlp可以由杆状病毒或植物系统产生。vlp可以是免疫原性的。所公开的纳米粒子中的任一种都可以用于包埋猪甲型流感病毒vlp。例如，公开了包埋在plga纳米粒子中的猪甲型流感病毒vlp。

本文描述了在载体中包含本文所公开的免疫原性组合物的疫苗，其中所述疫苗针对猪甲型流感病毒感染提供保护。如本文所用的术语“免疫原性载体”可以指增强第二多肽或其片段、变体或衍生物的免疫原性的第一多肽或其片段、变体或衍生物。“免疫原性载体”可以融合到或者缀合/偶合到所需的多肽或其片段。参见例如欧洲专利no.ep0385610b1，其全文以引用方式并入本文，用于教示将多肽融合、缀合或偶合到载体。“免疫原性载体”的示例是plga。在一些实施方案中，疫苗可以包含载体和由plga包封的全病毒灭活的猪甲型流感病毒。

公开了示例性的免疫原性组合物，例如疫苗组合物。另外，本文所述的组合物可以包含一种或多种免疫刺激剂。免疫刺激剂实质上是指增强或加强对外源性抗原的免疫应答(由抗体或细胞介导)的任何物质。一种优选类型的免疫刺激剂包括佐剂。大多数佐剂包含被设计用于保护抗原免于快速分解代谢的物质，诸如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答刺激剂，诸如脂质a、由百日咳博德特氏菌(bortadellapertussis)或结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)衍生的蛋白质。某些佐剂是可商购获得的，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(difcolaboratories,detroit,mich.)；merck佐剂65(merckandcompany,rahway,n.j.)；as-2(glaxosmithkline,philadelphia,pa.)；铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；可生物降解的微球体；单磷酰脂质a和quila。细胞因子诸如gm-csf，白细胞介素-2、-7、-12和其他类似的生长因子也可以用作佐剂。

佐剂组合物可以是诱导抗炎免疫应答(抗体或细胞介导的)的组合物。因此，高水平的抗炎细胞因子(抗炎细胞因子)可以包括但不限于白介素4(il-4)、白介素5(il-5)、白介素10(il-10)和转化生长因子β(tgfβ)。任选地，抗炎应答将由cd4+t辅助细胞介导。已有人指出细菌鞭毛蛋白具有佐剂活性(mcsorley等人，j.immunol.169:3914-19,2002)。还公开了编码可以在佐剂组合物中使用的鞭毛蛋白的多肽序列。

任选地，与所公开的组合物一起使用的佐剂提高脂多糖(lps)应答性。示例性的佐剂包括但不限于单磷酰脂质a(mpl)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(agp)，包括但不限于rc-512、rc-522、rc-527、rc-529、rc-544和rc-560(corixa,hamilton,mont.)。

此外，佐剂组合物可以是主要诱导th1型免疫应答的组合物。高水平的th1型细胞因子(例如ifn-γ、tnfα、il-2和il-12)往往有利于诱导对所施用抗原的细胞介导的免疫应答。相比之下，高水平的th2型细胞因子(例如il-4、il-5、il-6和il-10)往往有利于诱导体液免疫应答。在应用如本文所提供的疫苗后，受试者将支持包括th1型应答和th2型应答在内的免疫应答。任选地，th1型细胞因子的水平将增加到比th2型细胞因子的水平更大的程度。这些细胞因子的水平可以使用标准测定法轻松地评估。th2型细胞因子的水平可以增加到比th1型细胞因子的水平更大的程度。

用于主要诱发th1型应答的某些佐剂包括例如单磷酰脂质a(优选地为3-去-邻-酰化单磷酰脂质a)与铝盐佐剂的组合，所述铝盐佐剂可购自corixacorporation(seattle,wash.；参见例如美国专利no.4,436,727、no.4,877,611、no.4,866,034和no.4,912,094，这些专利据此以引用方式并入，用于教示前述内容)。含cpg的寡核苷酸(其中cpg二核苷酸未甲基化)也主要诱导th1应答。此类寡核苷酸是众所周知的，并且在例如wo96/02555、wo99/33488以及美国专利no.6,008,200和no.5,856,462中有所描述。还描述了免疫刺激性dna序列，例如由sato等人，science273:352,1996所描述。另一种佐剂包括皂苷(诸如quila)或其衍生物，包括qs21和qs7(aquilabiopharmaceuticalsinc.,framingham,mass.)；七叶素；洋地黄皂苷；或者丝石竹(gypsophila)皂苷或藜麦(chenopodiumquinoa)皂苷。其他制剂可以在佐剂组合中包含多于一种皂苷，所述佐剂组合例如包含qs21、qs7、quila、β-七叶素或洋地黄皂苷的组中的至少两种物质的组合。

皂苷制剂还可以与下列物质组合：由壳聚糖或其他多阳离子聚合物、聚交酯和聚交酯乙交酯共聚物粒子、基于聚-n-乙酰氨基葡萄糖的聚合物基质组成的疫苗运载体；由多糖或经化学修饰的多糖组成的粒子；脂质体和基于脂质的粒子；由甘油单酯组成的粒子，等等。皂苷还可以在胆固醇存在下配制以形成颗粒结构，诸如脂质体或免疫刺激复合物(iscom)。另外，皂苷可以连同聚氧乙烯醚或酯一起配制成非颗粒溶液或悬浮液，或者颗粒结构诸如薄层(paucilamelar)脂质体或iscom。皂苷还可以与赋形剂诸如carbopol^tm(noveon,cleveland,ohio)一起配制以增加粘度，或者可以与粉末赋形剂诸如乳糖一起以干粉形式配制。

任选地，佐剂系统包括单磷酰脂质a和皂苷衍生物的组合，诸如qs21和3d-mpl.佐剂的组合，如wo94/00153中所述，或者其中qs21用胆固醇猝灭的较低反应原性组合物，如wo96/33739中所述。其他制剂包含水包油乳液和生育酚。另一种佐剂制剂在水包油乳液中采用了qs21、3d-mpl.rtm.佐剂和生育酚，这种制剂在wo95/17210中有所描绘。

另一种强化的佐剂系统涉及含cpg的寡核苷酸和皂苷衍生物的组合，尤其在wo00/09159中公开了cpg和qs21的组合。任选地，该制剂另外包含水包油乳液和生育酚。

在所公开的组合物中使用的附加的示例性佐剂包括：montamideisa720(seppic,france)、saf(chiron,calif.,unitedstates)、iscoms(csl)、mf-59(chiron)、sbas系列佐剂(例如sbas-2或sbas-4，可购自glaxosmithkline,philadelphia,pa.)、detox(enhanzyn^tm)(corixa,hamilton,mont.)、rc-529(corixa,hamilton,mont.)和其他氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(agp)，诸如待审的美国专利申请序列号08/853,826和09/074,720中描述的那些，这两份专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文，以及聚氧乙烯醚助剂，诸如wo99/52549a1中所述的那些。

本文描述了在猪中诱发针对猪甲型流感病毒的免疫应答的方法，包括向猪施用本文所公开的组合物。所述免疫应答可以为保护性的。该方法还可以包括向猪施用强毒性猪甲型流感病毒以监测疫苗功效。

本文描述了减轻猪的生殖或呼吸衰竭的方法，包括向猪施用本文所公开的疫苗或组合物。该方法还可以包括向猪施用强毒性猪甲型流感病毒以监测疫苗功效。还描述了在猪中刺激免疫应答的方法，包括：向猪施用本文所提供的疫苗或组合物。

还描述了可以用于在经免疫且经同源病毒攻击过的猪中相比被杀死的猪甲型流感病毒疫苗抗原(k-ag)，增加(例如增加0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍等)体液和细胞介导的对猪甲型流感病毒的免疫应答的方法和组合物。本文所述的方法和组合物也可以用于在免疫的、同源病毒攻击过的猪中与被杀死的猪甲型流感病毒疫苗抗原(k-ag)相比，提供肺和血液中的病毒中和抗体与iga应答的显著增加(例如增加0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍等)。本文所述的方法和组合物也可以用于与对照猪组相比，向用nano-kag进行过疫苗接种的猪的肺溶胞产物和血清提供较高水平(例如增加0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍等)的ifn-γ和il-12，以及较低水平的免疫抑制介质(il-10和tgf-β)(例如降低0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍等)。本文所述的方法和组合物也可以用于向来自用nano-kag进行过疫苗接种的猪的肺、血液、bal、tbln和血液的单核细胞提供频率增加(例如，增加0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍等)的富含cd4⁺细胞、cd8⁺细胞、cd4⁺cd8⁺t细胞、γδt细胞、骨髓细胞和树突细胞的级分。所述方法和组合物也可以用于提供foxp3⁺t调节细胞的减少(例如减少0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍等)。所述组合物和方法也可以用于提供对plga纳米粒子包埋的猪甲型流感病毒被杀死的疫苗的鼻内递送，该疫苗在粘膜部位和全身部位诱发足以清除猪中的病毒血症的免疫应答。

还提供了可以用于提供针对猪甲型流感病毒的全身和粘膜保护性免疫应答的组合物和方法，所述免疫应答可以在感染后早期例如感染后三周、两周和一周(包括1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天)清除病毒血症。

所述疫苗或组合物还可以按例如介于100μg/猪和1mg/猪之间的剂量施用。其他示例包括包含50μg/猪和500μg/猪的剂量。所述组合物或疫苗可以例如以单剂量或以两个或更多个剂量施用。在一个实施方案中，两个剂量以两周间隔施用。可以例如经鼻内施用所述组合物或疫苗。替代免疫途径的附加示例包括肌内、皮下、鼻内滴入和鼻内气溶胶递送。

所述组合物和方法也可以按具有小于1×10⁸tcid50的猪甲型流感病毒的疫苗或免疫原剂量使用。还提供了小于1×10⁷、1×10⁶和1×10⁵tcid50的猪甲型流感病毒的剂量。本文进一步公开，每个剂量可以是大约5×10⁶tcid50的猪甲型流感病毒。还提供了介于1×10⁸tcid50的猪甲型流感病毒和1×10⁵tcid50的猪甲型流感病毒之间、介于1×10⁷和1×10⁵tcid50的猪甲型流感病毒之间，以及介于1×10⁶和5×10⁶tcid50的猪甲型流感病毒之间的剂量的示例。所述剂量可以来源于经紫外线处理的猪甲型流感病毒。所述剂量可以作为减少的病毒单剂量施用，以诱发保护性免疫应答。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可以作出各种修改。相应地，其他实施方案在以下权利要求的范围内。

实施例

实施例1：用可生物降解的纳米粒子递送灭活的猪流感病毒疫苗通过细胞介导的免疫力在猪中提供异源保护

材料和方法

细胞和病毒：将稳定的无支原体madin-darby犬肾上皮细胞(mdck，crl-2285，atcc，va)在5％co2温育箱内维持在37℃的补充有10％胎牛血清(sigma)和真菌抗生素(gibco)的杜氏改良伊格尔培养基(dmem)(gibco)中。将猪流感病毒(swiv)的野外分离株sw/oh/fah10-1/10(h1n2-δ1种系)(alia等人，2012.vetmicrobiol158:60-68)和sw/oh/24366/2007(h1n1-γ)(yassinehm等人，2009.vetmicrobiol139:132-139)分别用于灭活的病毒疫苗的制备和对猪的攻击感染。h1n2病毒(sw/oh/fah10-1/10)具有来源于2009年大流行的h1n1的np基因和m基因(alia等人，2012.vetmicrobiol158:60-68)；并且a/swine/ohio/24366/07是从猪分离的人畜共患病毒，并且还在cdc中显示与俄亥俄州县集市中相关的人类病毒具有100％相同的基因组序列(yassinehm等人，2009.vetmicrobiol139:132-139)。swiv库(第3代)从fahrp(wooster,ohio)的储存库获得。通过以moi0.005感染并且维持在补充有1μg/mltpck-胰蛋白酶(sigma,mo)的无血清dmem中，而使这两种病毒在mdck细胞上增殖。

疫苗制备：收获swiv分离株sw/oh/fah10-1/10(h1n2-δ1)的培养液，通过以2000×g离心30分钟使其澄清以去除细胞碎片，然后使用pellicon-2盒式过滤器(millipore,ma)浓缩10倍，接着使用optima^tml-100xp超速离心机(beckmancoulter)，用20％蔗糖作为垫层以107,000xg不间断地超速离心分离4小时。将病毒沉淀悬浮在含有蛋白酶抑制剂(sigma,mo)的pbs中，滴定并储存在-80℃下。使用双乙烯亚胺(bei)(sigma,mo)，通过在37℃下用10mmbei处理6小时将病毒灭活，然后用10mm硫代硫酸钠(sigma,mo)在37℃下额外处理2小时以中和未使用的bei，病毒灭活在mdck细胞中得到证实。使用微bca蛋白测定试剂盒(thermoscientific,ma)，依据制造商的方案估计病毒沉淀中的总蛋白浓度。

通过如先前所述的水/油/水复乳液溶剂蒸发技术将失活的swiv抗原(kag)包封在plga-np中(binjawadagib等人，2014.intjnanomedicine9:679-694；hiremathj等人，2016.plosone11:e0151922)。简言之，使用高强度超声波处理器(sonicsandmaterialsinc.,ct)以30％占空比和输出控制3处理30秒，而将500μlpbs和250μl具有蛋白质稳定剂的2％(w/v)聚乙烯醇(pva)中的5mgkag、50μl20％蔗糖(w/v)和50μl20％mg(oh)2(w/v)乳化在4.5ml二氯甲烷中的180mgplga聚合物溶液中。将所得的油包水(w/o)初级乳液倾注到23ml2％w/vpva(sigma)和2ml12.5％(w/v)泊洛沙姆188(sigma,mo)的混合物中，以形成水性溶液。将混合物等分到两根管中，再次超声乳化60秒以获得次级水/油/水乳液，然后通过在寒冷环境中(4℃)以400rpm磁力搅拌过夜使其乳化，从而允许有机溶剂蒸发。使用冷的无菌milli-q水，通过以10,976×g离心(beckmancoulter，fx6100转子)30分钟，而将所得的聚合物粒子洗涤三次。最后，将plga-np沉淀悬浮在-80℃下冷冻的含5％蔗糖的milli-q水中，冷冻干燥(labconco,mo)18至20小时，然后将等分试样储存在-20℃下。包封在plga-np中的失活kag此后被称作plga-kag。

plga-kag的表征：在使用quorumq150ts溅射镀膜仪(lewes,uk)镀覆2nm铱之后，通过feiquanta250扫描电子显微镜(sem,kyoto,japan)检查粒度和形态。使用imagej图像软件(nationalinstitutesofhealth,md)表征纳米粒子的尺寸分布，每个图像平均具有200个纳米粒子。使用zetasizernano(malverninstrumentsltd.,worchester,uk)，利用准弹性光散射实验(qels)来测量纳米粒子的ζ电势。在分析之前，使用探头超声波仪(ultrasonic处理器vc130pb(sonicsvibracell,ct))将100μgnp悬浮在冷的纳米纯水中并使其充分分散。为了获得ζ电势的平均值，进行了三次独立测量。估计了蛋白包封率和第0、1、3、5、7、10、15、20、25和30天的体外蛋白释放曲线，并且使用先前描述的方法(binjawadagib等人，2014.intjnanomedicine9:679-694；hiremathj等人，2016.plosone11:e0151922)将其表达为swiv抗原在每个时间点的累积释放百分比。

由plga-kag在体外活化apc：在体外实验中使用来自健康无流感2月龄猪的分离的外周血单核细胞(pbmc)和支气管肺泡灌洗液(bal)细胞来表征plga-kag。为了产生单核细胞衍生的dc(modc)，对来自pbmc的cd172⁺细胞进行磁分选并用细胞因子gm-csf(50ng/ml)和il-4(25ng/ml)(kingfisherbiotech,mn)处理一周。将bal细胞(50万)和modc(10万)在5％co2温育箱内与下列物质一起，在37℃下培养24小时：(i)仅有富含10％fbs的rpmi(e-rpmi)；(ii)e-rpmi中的kag(2μg/ml)；(iii)plga-kag(相当于2μg/mlkag的np)；或(iv)e-rpmi中的plga-np(np的当量)。固定受刺激的细胞，使用cd172a和cd80/86抗体进行免疫染色，然后通过流式细胞术(bdfacsariaii,bdpharmingenca)采集50,000个事件并使用flowjo软件(treestar,or)加以分析。

实验设计、接种疫苗、病毒攻击和样本收集：如先前所述在我们位于oardc的bsl2设施中饲养剖宫产禁食初乳(cdcd)且用牛初乳喂养的大白-杜洛克杂交繁育的4至5周龄小猪(n＝32)(hiremathj等人，2016.plosone11:e0151922)，并将其用于我们的研究。小猪被证实对于针对流感病毒亚型h1n1和h1n2的血凝(hi)抗体为血清反应阴性，将这些小猪随机分为4个实验组(n＝7至9只猪/组)(表1)。按照俄亥俄州立大学实验室动物护理和使用学术委员会的标准对猪进行饲养、接种和安乐死。4至5周时对动物进行疫苗接种，3周后加强，并且加强2周后实施攻击。用悬浮在2mldmem中并且使用多剂量递送装置(primatechusa,nc(图3a)作为雾状物递送的相当于10⁷tcid50的h1n2kag或plga-kag对猪进行疫苗接种，然后使用2ml异源h1n1swiv(6×10⁶tcid50)进行攻击，1ml经鼻内施用，而另外1ml经气管内施用(yassinehm等人，2009.vetmicrobiol139:132-139)。

在接种疫苗后第0天、第21天和第35天即dpv0、dpv21和dpv35收集血浆样本。从攻击日到安乐死期间，每天观察两次猪的临床体征，并且每天记录直肠温度。在攻击后第4天和第6天即dpc4和dpc6，在含抗生素的2mldmem中收集鼻拭子样本。在dpc6对猪实施安乐死，并在尸检期间检查肺部并对肉眼可见的病变评分(khatrim等人，2010.jvirol84:11210-11218)。收集血液样本和bal液样本，并将血浆和bal液的等分试样储存在-80℃下。收集bal液的方式为：通过气管注入20mlpbs(含2％edta)，然后在轻轻按摩所有肺叶之后收集bal液。为了制备肺溶胞产物，将来自右肺尖肺叶的1gm肺组织放入3mldmem(含蛋白酶抑制剂)中均质化，并且离心后收集上清液，并且如先前所述将等分试样储存在-80℃下(renukaradhyagj等人，2010.viralimmunol23:457-466)。将肺组织固定在10％中性缓冲福尔马林中，以便进行组织病理学评估和免疫组织化学评估。在dpc0和dpc6分离pbmc，并且在用swiv刺激时用于细胞增殖测定，以及用于流式细胞术分析。

细胞增殖测定和流式细胞术测定：在dpc0，使用细胞滴度96水性非放射性增殖测定试剂盒(promega,wi)，依据制造商的说明在pbmc中实施抗原特异性t细胞的增殖。简言之，将每孔1×10⁶个pbmc铺板在96孔u形底板(greinerbio-one,nc)的100μle-rpmi培养基中。在疫苗制备和猪攻击中使用的swivh1n2和h1n1这两者，在100μl中分别以moi0.1(1×10⁵tcid50/孔)用于刺激。将板置于5％co2温育箱内在37℃下温育，并且72小时之后将板以2000rpm离心2分钟，并收集上清液，并向细胞沉淀中加入100μle-rpmi和20μlmts+pms溶液，并在37℃的5％co2温育箱内再温育4小时。使用elisa读板仪(spectramaxplus384，moleculardevices,ca)记录490nm处的光密度(od)。刺激指数(si)通过将受刺激的pbmc的od除以同一只猪的细胞对照的od来确定，并且将每个组的7至9只猪的平均si值彼此进行比较。在dpc0，还评估了未受刺激的pbmc，以通过流式细胞术分析确定不同t细胞亚群的频率。

在dpc6，用swivh1n2和h1n1以moi0.1重新刺激猪的pbmc，并且如上所述进行细胞增殖。通过elisa分析从经重新刺激的pbmc的72小时培养物收获的上清液中的ifn-γ，然后对细胞进行免疫分型，并且如先前所述通过流式细胞术分析细胞以确定活化的t细胞亚群的频率(hiremathj等人，2016.plosone11:e0151922)。简言之，用2％猪血清封闭pbmc并且用猪淋巴细胞特异性的经纯化的缀合荧光染料或生物素的mab进行表面标记，之后用荧光染料标记的抗小鼠同种型特异性或链霉亲和素抗体处理。对于细胞内ifnγ染色，在用或不用指定的刺激剂处理的pbmc的最后6小时温育过程中加入golgiplugtm(bdbiosciences,ca)和brefeldina(sigma,mo)。用1％多聚甲醛固定表面免疫染色的细胞，并且用细胞透化缓冲液(85.9％去离子水、11％不含ca2⁺或mg2⁺的pbs、3％甲醛溶液和0.1％皂苷)在4℃下透化过夜。洗涤细胞，并且使用在含有0.1％皂苷的荧光活化细胞分选(facs)缓冲液中的缀合荧光染料的抗猪ifnγ或其同种型对照mab(bdbiosciences,ca)进行免疫染色。使用流式细胞仪bdariaii(bdbiosciences,ca)采集经免疫染色的细胞，并且使用flowjo软件(treestar,or)进行分析。所有特定的细胞群体频率以总cd3⁺/cd3^-淋巴细胞的百分比表示。在流式细胞术中使用的抗体有：抗猪cd3(southernbiotech,al)、cd4α(southernbiotech,al)、cd8α(southernbiotech,al)、cd8β(bdbiosciences,ca)、δ链(bdpharmingen,ca)、单核细胞/粒细胞抗体(cd172a，southernbiotech,al)和cd152-muig(ancell,mn)。

病毒滴定：将含有tpck-胰蛋白酶(1μg/ml)的无血清dmem中的测试样本的系列10倍稀释液一式四份地转移到在96孔细胞培养板中培养过夜的单层mdck细胞。将板置于5％co2温育箱中在37℃下温育48小时，并使用80％丙酮的水溶液固定，然后使用iav核蛋白特异性一级抗体(#m058，calbioreagents,ca)、接着使用缀合alexafluor488的山羊抗小鼠igg(h+l)抗体(lifetechnologies,or)进行免疫染色。使用荧光显微镜(olympus,ny)记录免疫荧光，并且使用reed和muench方法计算感染性病毒滴度((reedlj等人，1938.theamericanjournalofhygiene27(3):493-497)。

抗体滴定：如先前所述确定血凝抑制(hi)滴度和特异性抗体水平(hiremathj等人，2016.plosone11:e0151922)。简言之，首先确定swivh1n1的ha单位，然后将病毒原液稀释以获得50μl体积的8个ha单位，并将其用于标准hi测定。将血浆样本和bal液样本在56℃下温育30分钟，以使先天性补体活性失活。用于hi测定的血浆和bal液的起始稀释度为1:2。通过elisa测定鼻拭子、bal液、肺溶胞产物和血浆这些样本中的swiv特异性igg和iga抗体。简言之，将平底高结合力96孔板(greinerbio-one,nc)用半纯化预滴定的swivh1n1或h1n2抗原(5μg/ml)包被，然后在4℃下温育过夜。室温下用含5％脱脂奶的pbst将板封闭2小时，然后用pbst洗涤三次。将在2.5％脱脂奶中稀释的样本以50μl/孔一式两份地添加，并在室温下温育2小时。洗涤三次后，以50μl/孔添加与hrp缀合的山羊抗猪iga(bethyllaboratoriesinc.,tx)或与hrp缀合的山羊抗猪igg(γ)(kpl,md(这两种抗体均在含2.5％脱脂奶的pbst中以1:1000稀释)并且在室温下温育2小时。通过以50μl/孔加入过氧化物酶底物溶液b和tmb过氧化物酶底物(kpl,md)的1:1混合物，来以量热方式发起ag-ab反应。在10至20分钟后，加入1m磷酸(50μl/孔)使反应停止。使用spectramax微板读数器在450nm处测量光密度(od)，然后在从不同处理组的平均od减去空白od之后获得校正的od值。bal液中的病毒中和滴度(vnt)使用先前描述的程序确定(hiremathj等人，2016.plosone11:e0151922)。

组织病理学分析和免疫组织化学分析：用苏木精和伊红将猪的肺尖肺叶、心脏肺叶和膈肺叶的5μm切片染色，并且如先前所述用显微镜检查组织病理学改变(khatrim等人，2010.jvirol84:11210-11218)。单核炎性细胞(mnc)以及由死亡脱落的上皮细胞和mnc组成的支气管渗出物在支气管周围和血管周围的聚积评分如下：0，相比正常无变化；0.5，存在变化，但非常轻微；1，相比正常存在微小变化；2，相比正常存在中度变化；以及3，相比正常存在明显变化。通过取所述三个肺叶的得分的平均值来确定每只猪的最终肺病理学得分，并且比较组平均值。

通过如先前所述的ihc方法(但作出了一些修改)检测肺中的swiv特异性抗原(dwivediv等人，2012.plosone7:e51794；richtja等人，2006.jvirol80:11009-11018)。简言之，将5μm组织切片脱蜡并置于杜氏pbs(d-pbs)中水化，然后在0.05％硼氢化钠溶液中温育10分钟以破坏醛键，洗涤两次，置于蛋白酶vii(用d-pbs以1:6.5稀释)中在室温下温育30分钟以进行抗原修复。洗涤载玻片三次并于3％h2o2溶液中猝灭5分钟，随后洗涤三次，通过在室温下用4％正常马血清温育20分钟来封闭载玻片。另外，在室温下将载玻片与swiv核蛋白特异性抗体(#mo58，calbioreagents,ca)一起温育60分钟，洗涤三次，然后在室温下与生物素化的二级抗体一起温育60分钟。为了检测阳性信号，将载玻片于vectastain精英abc试剂(#pk-7100，vectorlab.,ca)中温育，然后根据制造商的说明用immpact^tmdab底物(#sk-4105，vectorlab.,ca)处理。用自来水冲洗载玻片，用苏木精复染，再用自来水充分冲洗，之后脱水并安装好载玻片。根据以下标准对肺尖肺叶、心脏肺叶和膈肺叶的支气管上皮上的阳性ihc信号评分：0，相比空白对照(正常)无变化；0.5，提示存在变化，但不确定；1，相比正常存在微小变化；2，相比正常存在中度变化；3，相比正常存在明显变化。通过取全部三个肺叶的得分的平均值来确定每只猪的ihc得分，并且比较治疗猪组的平均值。显微镜载玻片和ihc载玻片由经过委员会认证的兽医病理学家检视，这位兽医病理学家对实验设计和swiv感染状态毫不知情。

伦理道德声明：本研究严格按照公共卫生服务政策、美国农业部法规、美国国家研究委员会的《实验动物护理和使用指南》以及动物科学社团联合会的《农用动物在农业研究、教学中的护理和使用指南》的建议进行。对所有的猪进行饲养，收集样本并安乐死，根据俄亥俄州立大学动物实验道德准则(协议号：2014a00000099)，根据机构、州和联邦所批准的有关动物护理和使用的法规政策，尽一切努力最大程度减轻实验中给猪带来的痛苦。

统计分析：数据被表示为7至9只猪的平均值±平均值的标准偏差(sem)。就病毒滴度而言，对于小于10¹值的滴度使用10⁰的滴度；转化为log10尺度并分析(dwivediv等人，2013.vetmicrobiol166:47-58)。在每个测定中，通过单因素方差分析(anova)，然后在graphpadprism5(graphpadsoftware,inc.,ca)中进行tukey事后比较检验，来确定各组之间平均值的差异。小于0.05的p值被视为在统计上有显著意义。

结果

plga-kagnp的体外表征。kag在plga-np中的包封率为57％。该结果与plga包封肽以及灭活prrsv的先前的结果(包封率为50％至60％)相当(hiremathj，等人，2016.plosone11:e0151922；dwivediv等人，2013.vetmicrobiol166:47-58)。通过散射电子显微镜测定plga-kag的形态，并且通过使用imagej软件分析200个np来计算尺寸分布。plga-kag为球形形状(图1a)，其中平均直径为313nm，标准偏差为105nm。大多数np的直径尺寸在200至300nm的范围内。为了使np在粘膜表面处被apc和m细胞有效摄取，理想的粒度<500nm(fogedc等人，2005.intjpharm298:315-322；gregoryae等人，2013.frontcellinfectmicrobiol3:13)，并且大约95％的plga-kag粒子<500nm(图1b)。由准弹性光散射实验确定np的电荷，发现其为-18±0.56mv。粒度和电荷与先前的plganp相当(binjawadagib等人，2014.intjnanomedicine9:679-694；hiremathj等人，2016.plosone11:e0151922；dwivediv等人，2013.vetmicrobiol166:47-58)。在np中包封病毒抗原期间，抗原的一小部分总是缔合在粒子的表面上，在复溶于生理缓冲液如pbs中之后这部分抗原立即释放(≤30分钟)，称之为突释(rawata等人，2008.jcontrolrelease128:224-232)。突释量为22％，并且在24小时之后，kag包封累积量的27％得以释放。另外，在4周的时期内观察到抗原的缓慢且持续的释放，并且在一个月之后kag的总累积释放为大约50％(图1c)。该结果与用肽和灭活的prrsv包封的较早的plga-np制剂相当(binjawadagib等人，2014.intjnanomedicine9:679-694；hiremathj等人，2016.plosone11:e0151922)。

plga-kagnp在体外诱导抗原呈递细胞成熟。mφ和dc是主要的apc。像其他物种中一样，猪bal细胞含有>90％的mφ(ganterm、hensela.，1997.resvetsci63:215-217)，因此将bal细胞连同modc一起用作mφ的来源，以研究plga-kag在体外的佐剂性质。仅用培养基kag(2μg/ml)或plga-kag(含2μg/mlkag)处理bal细胞和modc，并且分析apc成熟标记共刺激分子cd80/86的表达。还用以相同的w/v浓度存在于plga-kag中的空plga-np处理modc，以确定单独的plga-np的佐剂作用。结果显示，与对照培养基即单独的kag和空plga-np处理(<25％)相比，在用plga-kag处理过的modc中，cd80/86的表达显著更高(40％)(图1d)。类似地，与对照培养基相比，在用plga-kag处理过的mφ中，cd80/86的表达也显著更高。用plga-kag处理过的mφ中的cd80/86⁺表达百分比(14％)高于仅用kag处理时的百分比(8.5％)(图1e)。当用更高浓度的kag(20μg/ml)处理bal细胞和modc时，这种趋势是相似的。另外，与对照培养基(21％)相比，空plga-np和仅使用kag也诱导modc中的cd80/86表达轻微增加(26％)(图1d)。与plga-kag粒子相比，plga-np对经处理的modc具有显著更高的佐剂效应，从而表明kag在被包封于np中时具有附加的佐剂性。

plga-kagnp疫苗在攻击前诱导猪中的抗原特异性细胞应答。在用swivh1n2(图2a)或h1n1(图2b)刺激的情况下，与用空白对照和kag进行过疫苗接种动物相比，用plga-kag进行过疫苗接种的猪的刺激指数(si)显著更高，这表明接受plga-kag疫苗的猪的免疫细胞甚至针对异源swiv也发生敏化。在dpv35(未进行任何swiv刺激)对pbmc的流式细胞术分析证明，与接受kag的猪组相比，plga-kag疫苗接种诱导生成频率显著更高的cd3⁺cd4⁺cd8α⁺t细胞(图2c)，这种细胞被称为猪中的活化/记忆t辅助细胞(zuckermannfa.1999.vetimmunolimmunopathol72:55-66)，以及细胞毒性t细胞(cd3⁺cd4⁺cd8αβ⁺)(图2d)。与kag组相比，用plga-kag进行过疫苗接种的猪中的γδt细胞的频率也显著增加(图2e)。

与空白对照组相比，在用kag和plga-kag进行过疫苗接种的猪组中，都观察到显著更高的hi滴度。然而，在接受kag和plga-kag的组之间未观察到hi滴度存在统计学差异(图2f)。有趣的是，与接受plga-kag的猪相比，用kag进行过疫苗接种的猪的血浆igg抗体应答显著更高(图2g)。在不同的疫苗组之间，在dpv35/dpc0收集的鼻拭子样本中iga抗体滴度没有可观察到的差异。攻击前的数据表明，在猪中经鼻内递送用plga包封的灭活swiv诱导了失衡细胞介导的中等至弱强度的体液免疫应答。

plga-kagnp疫苗大大改善了猪在受攻击后的临床流感症状、肺病理学和肺中病毒载量。

使用提供细雾粒子的多剂量气溶胶装置经鼻内对猪进行疫苗接种(图3a)。在用swivh1n1攻击的情况下，用空白对照和kag进行过疫苗接种的猪均有发热，直到dpc4平均直肠温度保持>104℉，并且这些猪中的大部分在攻击后的四天内都厌食且嗜睡(图3b)。尽管用plga-kag进行过疫苗接种的猪直到dpc1为止仅有发烧的表现(图3b)并伴随轻度流感症状，但是从dpc2起，这些猪显然是正常的并且与接受空白对照的猪相当。

在尸检当天(dpc6)检查肺部，并对由于流感感染所致的肺实质化百分比评分。用plga-kag进行过疫苗接种的猪的肉眼可见的肺病变得分(平均值＝12.1)低于kag组(平均值＝20.8)，并且显著低于用空白对照感染过的动物(平均值＝23.9)(表2)。示出了显示肉眼可见的肺病变的代表性肺部照片(图4a)。显微镜下的肺病变显示，用plga-kag进行过疫苗接种的猪的细支气管和支气管上皮周围的炎性细胞浸润百分比较低，这表明疫苗在受异源swiv攻击的猪的肺中诱导了保护(图4b；表2)。

用plga-kag进行过疫苗接种并且用病毒攻击过的猪中的抗原性质量显著低于用空白对照和kag进行过疫苗接种并且用病毒攻击过的动物(表2)。ihc得分和h&e结果揭示，用plga-kag进行过疫苗接种的猪的肺受到强毒性异源攻击病毒的影响最小，并且在dpc6在流感抗原性质量方面，它们与未感染的空白对照猪相似。示出了来自相应猪组中的每个组的代表性ihc照片(图4c)。

在dpc6测定了bal液中的感染性swivh1n1病毒滴度，并发现所有的用空白对照进行过疫苗接种并且用病毒攻击过的猪都为病毒阳性(8/8)，而8只用kag进行过疫苗接种的猪中的5只以及9只用plga-kag进行过疫苗接种的猪中的仅2只为swivh1n1阳性。尽管与用空白对照感染过的猪相比，kag和plga-kag都显著降低了bal液中的病毒滴度，但与用kag进行疫苗接种的猪相比，用plga包封kag导致感染性肺病毒滴度降低了2个对数级以上。总而言之，与用空白对照感染过的动物相比，在用plga-kag进行过疫苗接种的猪中，观察到病毒滴度总共降低了5个对数级(表2)。另外，还在dpc4和6测试了鼻拭子中的病毒脱落，但令人惊讶的是，与bal液中不同，dpc4的鼻病毒脱落在进行过疫苗接种的猪组和用空白对照感染过的猪组中都是相当的；并且到dpc6为止，该病毒脱落在所有的组中同样地减少。总而言之，在接受kag的猪和接受plga-kag疫苗的猪之间没有鼻病毒脱落上的差异(表2)。数据表明，鼻内递送plga包封的swivkag提供了针对异源病毒攻击的临床保护，并且减轻了肺病理学和肺中的复制感染性病毒载量。

用plga-kag进行疫苗接种在用病毒攻击的猪中诱导ifnγ分泌和活化的回忆t细胞应答增强。在攻击前即dpc0，检测到用plga-kag进行过疫苗接种的猪的pbmc中的细胞免疫应答增强(图2)，因此在攻击后dpc6在猪组中进行了类似的分析。为了揭示回忆细胞应答，用疫苗(h1n2)或攻击病毒(h1n1)swiv对pbmc进行了离体刺激，并且分析了pbmc中的活化(ifnγ⁺)t淋巴细胞亚群。示出了代表性图，该图显示了随后的用于通过流式细胞术分析猪中的不同t细胞亚群的设门模式(图5)。

在用疫苗病毒和攻击病毒这两者刺激的情况下，t细胞(cd3⁺)产生的总ifnγ在接受plga-kag的猪组中相比接受kag的动物显著更高(图6a)。不管病毒重新刺激的条件是怎样的，在用kag进行过疫苗接种的猪组中的cd3^-ifnγ⁺细胞都显著高于用plga-kag进行过疫苗接种的猪组(图6b)。在接受空白对照-攻击病毒的猪组中，响应于用攻击病毒(但不用疫苗病毒)进行的离体刺激，cd3⁺cd4⁺cd8α⁺ifnγ⁺(活化的t辅助/记忆)细胞显著更高，这表明猪中的记忆细胞被活化(图6c)。在用攻击病毒刺激细胞的情况下，与接受空白对照-攻击病毒和接受kag的这两个组相比，用plga-kag进行过疫苗接种的猪组中的cd3⁺cd4⁺cd8α^-ifnγ⁺(活化的t辅助)细胞显著更高，但在用疫苗病毒刺激的情况下，与接受空白对照-攻击病毒的组相比显著增强(图6d)。在用疫苗病毒和攻击病毒这两者刺激的情况下，产生ifnγ的cd3⁺cd4^-cd8αβ⁺ifnγ⁺(活化的细胞毒性t)细胞在用plga-kag进行过疫苗接种的猪组中相比用空白对照-攻击病毒和kag这两者进行过疫苗接种的动物显著增强(图6e)。与在用kag进行过疫苗接种的猪组中观察到的cd3^-ifnγ⁺细胞亚群应答增加相符，产生ifnγ的nk细胞亚群(cd3^-cd4^-cd8a⁺ifnγ⁺)也明显高于用空白对照攻击过的动物(图6f)。

与流式细胞术的数据相符，相比于用空白对照-攻击病毒和kag这两者进行过疫苗接种的动物，在用plga-kag进行过疫苗接种并且用病毒攻击过的猪中，受到重新刺激的pbmc的ifnγ分泌也显著更高(图7a)。由于plga-kag已经诱导了非常强的t细胞应答，所以通过比较未受刺激的pbmc(细胞对照，cc)或者用swivh1n1或h1n2刺激过的pbmc中的ifnγ⁺细胞频率，进一步专门确定了在用plga-kag进行过疫苗接种的猪中的抗原特异性回忆应答。结果指示，在用两种swiv刺激时，cd3⁺ifnγ⁺和cd3⁺cd4^-cd8αβ⁺ifnγ⁺这两种细胞的频率都增加(但不明显)(图7b和图7c)。另外，与未受刺激的细胞相比，在用plga-kag进行过疫苗接种的猪组的受h1n2刺激的pbmc中，分泌到细胞培养物上清液中的ifnγ显著更多(图7d)，这表明存在抗原特异性回忆th1应答。我们注意到，由于在攻击后的6天之后就分析了用plga-kag进行过疫苗接种的猪中的回忆t细胞应答，所以检测到了高百分比的效应t细胞(cc刺激)(图7b和图7c)。因此，为了排他地理解在用plga-kag进行过疫苗接种的猪中的swiv特异性记忆t细胞应答，需要在接种后至少3至6个月进行类似的分析。总而言之，用plga-kag进行过疫苗接种的猪在攻击前和攻击后的淋巴细胞应答分析数据都表明诱导了强烈的细胞免疫应答。

相比用plga-kag进行疫苗接种，kag诱导更高的iga应答和igg应答，但hi滴度和病毒中和滴度相当。鼻内递送疫苗被认为诱导强烈的局部粘膜免疫力。因此，测定了鼻拭子、bal液和肺溶胞产物这些样本中的iga应答，从而证实与用plga-kag进行过疫苗接种并且用病毒攻击过的猪相比，针对kag中的swivh1n1有显著更高的应答(图8a至图8c)。还检查了针对swivh1n1的特异性igg抗体水平。并未在所有的实验猪组之间都检测到血浆中的差异(图8d)，但在用kag进行过疫苗接种的猪的bal液中，所述抗体水平显著更高(图8d至图8e)。针对疫苗病毒(swivh1n2)的iga和igg抗体应答在用kag而非plga-kag进行过疫苗接种的猪中具有类似的较高趋势。在用kag进行过疫苗接种的猪组和用plga-kag进行过疫苗接种的猪组之间，bal液和血浆中针对swivh1n1的hi滴度不存在统计学差异(图8f至图8g)。类似地，相比用kag进行过疫苗接种的猪组，用plga-kag进行过疫苗接种的猪组的血浆中针对swivh1n2的hi滴度也无差异，但bal液中针对swivh1n2的hi滴度显著更高。令人惊讶的是，不管在用kag进行过疫苗接种的猪中检测到显著高多少的igg和iga抗体应答，病毒中和滴度都与用plga-kag进行过疫苗接种的动物的相当(图8h)。总而言之，细胞和体液免疫应答的数据表明，用kag和plga-kag这两者进行的鼻内疫苗接种都未能在猪的肺部局部地、也未能在血液中全身地诱导强烈的hi抗体应答与病毒中和抗体应答。然而，用plga包封swivkag诱发了细胞介导的强烈的交叉保护性免疫力。

讨论

plga聚合物由于具有无毒、可生物降解和生物相容性这些性质，所以在药物和疫苗递送研究中被广泛使用(danhierf等人，2012.jcontrolrelease161:505-522)。在啮齿动物模型中在没有任何佐剂存在下经鼻内递送的基于plga的候选病毒疫苗由于诱导强烈的细胞免疫应答和体液免疫应答，已经显示出针对乙型肝炎、马脑炎、流感和副流感的巨大潜力(thomasc等人，2011.molpharm8:405-415；greenwayte等人，1998.vaccine16:1314-1323；shephardmj等人，2003.resvetsci74:187-190；yassinehm等人，2015.natmed21:1065-1070；liuq等人，jmedvirol87:1807-1815；singhm等人，2001.jcontrolrelease70:267-276)。在用plga包封的牛副流感病毒进行过鼻内免疫的奶犊牛中，观察到了增强的病毒特异性抗体应答(mansoorf等人，2015.bmcveterinaryresearch11:1-11)。对猪的研究表明，鼻内递送基于plga-np的灭活prrsv只有在与强效的佐剂共同施用时，才诱导由强烈的细胞免疫应答和体液免疫应答支持的增强的交叉保护性应答(binjawadagib，等人，2014.intjnanomedicine9:679-694；dwivediv等人，2012.plosone7:e51794；binjawadagib等人，2014.intjnanomedicine9:1519-1535)。在用plga-np包封的保守的iavt和b细胞肽混合物进行过鼻内疫苗接种的猪中，肽特异性细胞免疫应答被上调，但体液免疫应答很弱；这些猪仍然未患上临床流感，并且肺中的复制攻击病毒在dpc7得以清除(hiremathj等人，2016.plosone11:e0151922)。在该研究中，目标是提高病毒特异性的粘膜应答和全身体液应答，并且证明含有失活swiv的plga-np的交叉保护功效，该功效有可能向猪的免疫系统提供与选定的几种肽相比数量更多的潜在b细胞表位。

为了预防感染呼吸道上皮细胞的流感病毒传播并且有效地防范这种病毒，诱导充分的粘膜抗体应答至关重要，并且通过鼻孔递送疫苗具有这种潜力(zamanm等人，2013.methods60:226-231；almeidaaj等人，1996.jdrugtarget3:455-467)。在所公开的研究中，用plga-kag进行过疫苗接种的猪中针对疫苗病毒而不是针对异源攻击病毒的特异性hi滴度增加。有趣的是，在攻击前和攻击后，在用kag进行过疫苗接种的猪中的血浆igg应答和bal液中的iga和igg应答都显著高于用plga-kag进行过疫苗接种的猪，但是bal液中针对攻击病毒的病毒中和滴度在用kag和plga-kag进行过疫苗接种的猪中是相当的。与用空白对照感染的猪相比，在用kag进行过疫苗接种的猪中，清除40％猪肺中的复制病毒似乎是抗体和增加的先天性nk细胞所促成的，但是临床疾病和肺病理学并未减轻。因此，在用灭活swiv进行过疫苗接种的猪中诱导强烈的细胞介导的免疫应答，是限制猪的流感严重程度的本质所在。所以，新颖的疫苗接种策略应当探索t细胞免疫力，以提供广泛保护性应答(mossp.2003.developmentsinbiologicals115:31-37；lagrutanl等人，2014.trendsinimmunology35:396-402)。活化的淋巴细胞产生ifn-γ，后者在流感病毒清除中发挥重要作用(hiremathj等人，2016.plosone11:e0151922；bota等人，1998.journalofvirology72:6637-6645)。相比用kag进行疫苗接种，plga-kag在粘膜部位和全身部位诱导较少的iga和igg抗体应答，但是hi滴度和vn滴度仍然相当。

总的来说，鼻内递送基于plga的灭活swiv疫苗诱导了强烈的细胞免疫应答、大大缓解了猪的临床疾病，并且减轻了肺病理学和肺中的异源攻击病毒载量。另外，由plga-kag诱发的抗体应答水平远高于用np包埋的h1n1肽进行疫苗接种的猪(hiremathj，等人，2016.plosone11:e0151922)。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与所公开的发明所属领域技术人员通常理解的含义相同。本文中引述的出版物及其中引述的材料明确地以引用方式并入。

本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来探知本文所述发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求书涵盖。