一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法与流程

本发明属于生物学和组织工程学技术领域，具体涉及一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法。

背景技术：

皮肤是覆盖于人体全身表面具有重要生理功能的器官，由表皮层和真皮层组成。一旦皮肤发生大面积创伤或缺失时，便会对人体造成致命的伤害。理想的修复、代替缺损的皮肤组织应当具备以下几个特点：能够有效覆盖皮肤缺损创面；具备一定的机械强度；逐渐促进皮下细胞及血管生长，形成自体表皮层和真皮层结构且最大程度的生长至正常皮肤的愈合质量；经济易得、使用简便。

随着组织工程技术的快速发展，组织工程皮肤已成为皮肤缺损治疗的热点，早期的人造皮肤或皮肤替代产品也有很多，其技术中涉及的人造皮肤制备成本较为高昂，同时也增加了保证材料紧密结合的难度。因此，皮肤组织工程领域迫切需要开发一种新的促进皮肤修复的海绵材料的方法，在能够有效达到促进皮肤修复目的同时还能有效缓解制备成本高及耗时长的缺陷。

胶原是脊椎动物体内含量最丰富、分布最广泛的一组硬蛋白，大量存在于骨、软骨、肌腱及皮肤中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25%-33%。其中I型胶原占生物体总胶原量的90%，因此I型胶原在生物材料中的使用也最为广泛。猪皮来源的胶原海绵来源丰富经济易得，提取率高，它与人体胶原蛋白结构相似，很适合人体器官的修复和再生。

将这种生物3D打印的皮肤组织修复材料贴合至创伤处后纤维细胞和血管逐渐长入海绵层，2-3周后形成类似于皮肤的基质成分。因此可以有效诱导缺损组织处细胞的迁移、增殖和分化。利用胶原海绵结构的人造皮肤原位诱导缺损皮肤再生，可以大大的缩短伤口愈合周期。此外，还可以增强创面愈合后的皮肤弹性、柔韧性以及减少疤痕增生。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种能够极大促进皮肤修复的基于生物3D打印构建皮肤组织的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法，其创新点在于：包括以下步骤：

（1）除脂，分离鱼皮、软骨、肌腱、牛蹄筋、猪蹄或皮肤组织；

（2）采用酸酶结合法处理，加入胃蛋白酶消化抽提3天，取上清液；

（3）向粗提液中加入碳酸钾、碳酸钠、氯化钠、氯化钾、硫酸钾或硫酸钠盐析；

（4）将得到的胶原作为打印皮肤的墨水原料灌注于生物打印机的打印室中，打印室温度控制在4 ^oC；

（5）通过层叠打印技术在温度为37 ^oC的热台上打印任意形状和大小的皮肤；

（6）将所打印的皮肤置于容器中冷冻干燥；

（7）将冻干的皮肤组织置于甲醛或戊二醛中交联6小时，并用磷酸盐缓冲液或纯水洗净；

（8）最后浸没于乙醇水溶液中冻干保存。

进一步的，所述步骤（1）中小心去除皮下脂肪，将组织剪成小块，温度控制于22-30^oC，用纯水洗涤，放于常温下晒干后放置于4 ^oC冷柜中备用。

进一步的，所述步骤（2）中将组织浸泡于醋酸溶液中，抽提过程于4 ^oC环境下进行，所述胃蛋白酶加入比例为10:1。

进一步的，所述步骤（3）中将滤液充分搅拌至胶原完全沉淀析出，10000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。

进一步的，所述步骤（4）中将胶原移至4 ^oC打印室并混匀，消除气泡。

进一步的，所述步骤（5）中每层打印厚度为500微米，总共打印十层，总厚度5毫米，所述打印平台的湿度为95%。

进一步的，所述步骤（6）中将所打印皮肤组织迅速放置于-80 ^oC下冷冻，然后将其转入冷冻干燥机内冻干。

进一步的，所述步骤（7）中将冻干的皮肤组织完全浸泡于交联剂内，交联后除去交联剂，用磷酸盐缓冲液或纯水洗净。

进一步的，所述步骤（8）中小心将皮肤组织取出并浸泡于乙醇水溶液中，置于合适容器中继续冷冻干燥。

本发明的有益效果如下：本发明方法可靠、操作简便、能够有效促进皮肤修复，能够为人造皮肤工程的科学研究以及皮肤损伤的临床治疗提供有益的参考，为治疗皮肤创伤及烧伤等疾病提供临床化的有效方法及技术支撑。

附图说明

图1为本发明一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法中所打印皮肤组织冷冻干燥后的形态；

图2为本发明一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法中由cck-8方法检测胶原海绵生物相容性分析；

图3为本发明一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法中由cck-8方法检测皮肤组织生物相容性分析；

图4为本发明一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法中由cck-8方法检测打印皮肤对细胞生长的影响。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法，包括以下步骤：

（1）除脂，分离鱼皮、软骨、肌腱、牛蹄筋、猪蹄或皮肤组织；小心去除皮下脂肪，将组织剪成小块，温度控制于22-30^oC，用纯水洗涤，放于常温下晒干后放置于4 ^oC冷柜中备用。

（2）采用酸酶结合法处理，加入胃蛋白酶消化抽提3天，取上清液；将组织浸泡于醋酸溶液中，抽提过程于4 ^oC环境下进行，胃蛋白酶加入比例为10:1。

（3）向粗提液中加入碳酸钾、碳酸钠、氯化钠、氯化钾、硫酸钾或硫酸钠盐析；将滤液充分搅拌至胶原完全沉淀析出，10000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。

（4）将得到的胶原作为打印皮肤的墨水原料灌注于生物打印机的打印室中，打印室温度控制在4 ^oC；将胶原移至4 ^oC打印室并混匀，消除气泡。

（5）通过层叠打印技术在温度为37 ^oC的热台上打印任意形状和大小的皮肤；每层打印厚度为500微米，总共打印十层，总厚度5毫米，打印平台的湿度为95%。

（6）将所打印的皮肤置于容器中冷冻干燥；将所打印皮肤组织迅速放置于-80 ^oC下冷冻，然后将其转入冷冻干燥机内冻干。

（7）将冻干的皮肤组织置于甲醛或戊二醛中交联6小时，并用磷酸盐缓冲液或纯水洗净；将冻干的皮肤组织完全浸泡于交联剂内，交联后除去交联剂，用磷酸盐缓冲液或纯水洗净。

（8）最后浸没于乙醇水溶液中冻干保存；小心将皮肤组织取出并浸泡于乙醇水溶液中，置于合适容器中继续冷冻干燥。

为了进一步了解本发明方法的效果，对所打印的皮肤组织进行了相应的鉴定。

（1）cck-8细胞生物相容性检测

将皮肤组织充分溶解于pH=3的稀盐酸中，按照比例分别配置1体积皮肤溶液与9体积的培养液以及2体积皮肤溶液与8体积的培养液，对照组同理采用上述体积比的稀盐酸与培养液代替。将HUVEC细胞接种于96孔板内，细胞密度为8x10⁴/mL，每孔加入100μL，待细胞生长至80%后换液，加入配好的皮肤溶液继续培养24小时、48小时、72小时。吸去旧培养液加入配好的cck-8溶液100μL孵育2-3小时，将液体转移至新96孔板中450nm波长下检测吸光度值。

（2）细胞在打印的皮肤组织上的3D培养

将打印的皮肤组织剪成48孔大小并置于孔板底部，将300μL BMSCs细胞混悬液均匀加于海绵上，其中细胞密度为1x10⁵/mL，每隔3天换液。置于培养箱内培养3天、14天后，分别吸去旧培养液并加入配好的cck-8溶液100μL孵育2-3小时，将液体转移至新96孔板中450nm波长下检测吸光度值。

如图1为本发明一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法中所打印皮肤组织冷冻干燥后的形态。

如图2为本发明一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法中由cck-8方法检测胶原海绵生物相容性分析。1份皮肤组织与9份培养液混合均匀，分别检测24小时、48小时、72小时后细胞的吸光度值，结果发现交联程度不同的胶原海绵均具有较好的生物相容性。control单独细胞培养组，non:不交联皮肤组，heat crosslinking:热交联海绵组，glutaraldehyde crosslinking:化学交联组

如图3为本发明一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法中由cck-8方法检测皮肤组织生物相容性分析。2份皮肤组织与8份培养液混合均匀，分别检测24小时、48小时、72小时后细胞的吸光度值，结果发现交联程度不同的胶原海绵均具有较好的生物相容性，而且交联后在培养24小时能明显促进细胞的增殖（p < 0.01），其中化学交联在培养48小时比较明显（p < 0.001）。

图4为本发明一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法中由cck-8方法检测打印皮肤对细胞生长的影响。将修剪好的皮肤组织放入48孔板内，分别检测第3天、第14天后细胞的吸光度值。结果发现热交联、化学交联海绵与不交联海绵相比OD值明显增加（p < 0.05）。表明14天时热交联或化学交联海绵能明显促进细胞长入海绵，对细胞生长具有明显促进作用。

本发明方法可靠、操作简便、能够有效促进皮肤修复，能够为人造皮肤工程的科学研究以及皮肤损伤的临床治疗提供有益的参考，为治疗皮肤创伤及烧伤等疾病提供临床化的有效方法及技术支撑。

上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。