一种BMP‑2/PPLA微球及其制备方法与流程

本发明涉及骨修复材料的制备技术领域，具体涉及一种BMP-2/PPLA微球及其制备方法。

背景技术：

骨缺损指骨的结构完整性被破坏，是临床常见病。创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创、以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因。常规手术治疗往往给患者带来难忍的疼痛，治疗效果也难以预测，常导致骨不连的发生。临床上治疗骨缺损的主要手段是自体骨移植或异体骨移植，需要骨生长因子来促进骨缺损部位的愈合。

骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是研究较早的骨生长因子，具有很强的诱导成骨的作用，可以诱导间充质细胞向骨细胞分化，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨的生长发育及其重建过程，进而加速骨缺损的修复，是治疗难治性骨折及修复骨缺损的重要物质。但是，BMP-2作为一种蛋白质类药物，具有蛋白质类药物共有的缺点：生物稳定性差，半衰期短，进入人体后很快就随体液扩散或降解，不能在应用部位发挥长效作用，无法达到预期的治疗效果。因此，将BMP-2与合适的载体相结合以制备BMP-2缓释系统是研究的重要方向之一。

药物缓释系统是指将药物与高分子材料以物理或者化学方法结合，使药物能在体内通过渗透，扩散等方式以较低浓度持续释放出来，以达到充分发挥药物功效的目的。因此，近年来有研究者采用高分子材料作为缓释载体对BMP-2包埋，制备成高分子材料/BMP-2缓释系统来提高在临床上的应用。

微球是药物溶解或分散于高分子材料中形成的微小球状实体，一般制备成混悬剂供注射用。制备药物缓释微球的方法有乳化溶剂挥发法、相分离法、乳化溶剂萃取法、喷雾干燥法、熔融法等。其中，在溶剂挥发法中，超声制得的微球粒径分布经常比较宽，载药量也比较低。超声乳化产生局部过热，使蛋白变性。例如中国专利申请“一种PELA/BMP-2微球的制备方法”(CN104511019A)，制备出了光滑度好流动性好的微球，但缺点在于使用超声法会导致微球粒径大小不一，使得制备出的微球不稳定，并且超声乳化操作难以控制，容易导致微球破裂及蛋白质变性。

另外，临床上的非注射型的固体支架，即通过手术植入的支架，预先或使用前整合了生长因子或化学药物的多孔支架(或纳米纤维状支架)，其形状多为薄膜状、片状、块状等，由于体积较大且有一定刚性，必须通过手术才能植入，操作复杂。

因此，有必要提供一种新的BMP-2缓释载药系统，以实现给药途径的多样化。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种BMP-2/PPLA微球及其制备方法，以PPLA作为载体材料，采用复乳溶剂挥发法对BMP-2进行包载，制备得到微球；所得微球的表面光滑、大小均一、稳定性高，可局部注射给药，使BMP-2长效稳定的作用于应用部位，促进骨生长。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一种BMP-2/PPLA微球的制备方法。该方法包括：将BMP-2溶解或者分散在溶解有PPLA的乳相中，制备得到初乳的阶段；将初乳分散在PVA溶液中，制备得到复乳的阶段；以及将复乳中的有机溶剂除去，制备得到包封有BMP-2的微球的阶段。

上述方法中，所述溶解有PPLA的乳相中，PPLA的浓度为85-95mg/ml；优选为90mg/ml。

上述方法中，所述溶解有PPLA的乳相为二氯甲烷。

上述方法中，优选的，将BMP-2溶液分散在溶解有PPLA的乳相中；所述BMP-2溶液的浓度为0.5-0.6mg/ml，BMP-2溶液与溶解有PPLA的乳相加入的体积比为1：(4-6)。进一步优选的，所述BMP-2溶液的浓度为0.55mg/ml，BMP-2溶液与溶解有PPLA的乳相加入的体积比为1：5。

上述方法中，使用匀浆机在冰浴的环境下进行第一次乳化，剪切转速为14000-16000rmp，时间为15-25s，制备得到初乳；优选的，剪切转速为15000rmp，时间为20s。

上述方法中，所述PVA溶液的质量分数为3-5％；优选为4％。

上述PVA溶液的制备方法为：将PVA溶于蒸馏水中，过夜溶胀搅拌溶解或加热至80-90℃溶解，配制得到PVA溶液。

上述方法中，初乳与PVA溶液加入的体积比为1：(5-15)；优选为1：10。

上述方法中，使用匀浆机在冰浴的环境下进行第二次乳化，剪切转速为4500-5500rmp，时间为50-70s，制备得到复乳；优选的，剪切转速为5000rmp，时间为60s。

上述方法中，将复乳液置于磁力搅拌器上，300-500rmp搅拌3-5h，除去有机溶剂；优选的，400rmp搅拌4h，除去有机溶剂。

上述方法中，将复乳液中的有机溶剂除去后，再离心洗涤，进一步去除未挥发干净的有机溶剂，然后经冷冻干燥，制备得到包封有BMP-2的微球。

上述方法中，所述PPLA的分子量为50000Da。

本发明的第二方面，提供由上述方法制备得到的BMP-2/PPLA微球，所述BMP-2/PPLA微球的粒径为3.48±0.51μm。

术语说明：

PPLA：是聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物，PLA和PEG均具有良好的生物相容性，可生物降解性和无毒无免疫原性，已得到美国FDA批准应用于临床。

PVA：聚乙烯醇，由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合而成。系列产品无毒、无刺激性，具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性。

另外，为方便表述，本发明中将BMP-2/PPLA微球简写为BMP-2-PPLA-MS。

本发明的有益效果：

(1)缓释载体的材料是缓释系统的重要组成部分，理想的载体材料必须具备良好的生物相容性、生物可降解性、合理的缓释时间及降解速度，以及对人体无毒副作用等基本性能。本发明以PPLA作为缓释载体的材料，在体内无毒、稳定可降解；其是由PLA和PEG嵌段共聚而成，其中PEG可以提高PLA的亲水性，同时可以赋予PLA一些新的特性和功能，它能降低生物体内蛋白质在材料表面的吸附和细胞的黏附，从而避免在体内被免疫系统识别；它还能保护被改性的PLA不受免疫系统的破坏，且形成的两亲性共聚物具有可修饰性，可引入端基活性基团。

本发明还对PPLA的分子量进行了考察，PPLA的分子量会影响制备的BMP-2/PPLA微球的粒径、载药量和包封率。首先，不同分子量的PPLA在二氯甲烷中的溶解度不同，所以不同分子量的PPLA固化的速度不同，从而制备得到的微球的粒径不同；其次，本发明研究发现，由于BMP-2与不同分子量的PPLA的作用不同，因此随PPLA分子量的增加，载药量和药品包封率并不完全呈上升趋势，而是在PPLA的分子量为50000Da时获得最大值。

(2)为避免超声法导致的制备的微球粒径大小不一的问题，本发明采用复乳溶剂挥发法进行制备，将聚乳酸类聚合物溶于挥发性有机溶剂中作为油相，一定浓度的主药溶液作为内水相，油相与内水相经搅拌得到W/O型初乳，然后将初乳再次分散在含有乳化剂的外水相中，形成W/O/W型复乳后，在磁力搅拌器上不断搅拌，使有机溶剂挥发，进而制备得到微球。

剪切转速和时间会在很大程度上影响制备的微球的粒径；本发明在制备初乳和复乳时分别采用了不同的剪切转速和时间，其中，制备初乳时，采用较高的剪切转速和较短的剪切时间，可以防止初乳的稳定性受到破坏，而初乳的稳定性会直接影响载药量和药品的包封率；在制备复乳时，采用较低的剪切转速和较长的剪切时间，可以使初乳在PVA溶液中的分散更加均匀，乳滴聚集的现象减弱，制备的复乳更加稳定，进一步的，制备得到的微球的粒径更加均一。

(3)本发明制备的微球表面光滑，大小均一，稳定性高，且操作简便易控。微球的粒径为3.48±0.51μm，可局部注射，从而降低手术等复杂操作，并使蛋白长效稳定地作用于应用部位，促进骨生长，使得给药途径多样化。

附图说明

图1：本发明制备的BMP-2/PPLA微球的超景深显微镜图；

图2：用激光粒度分析仪测得的BMP-2/PPLA粒径分布图；

图3：BMP-2含量测定标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：BMP-2-PPLA-MS的制备

(1)称取一定质量的PPLA溶于二氯甲烷中，使用涡旋机振荡溶解，配制得到PPLA浓度为90mg/ml的溶液。取一定体积的PPLA(分子量为50000Da)溶液置于EP管中，加入BMP-2蛋白储备液(浓度为0.55mg/ml)，控制BMP-2蛋白储备液与PPLA溶液加入的体积比为1：5；使用匀浆机在冰浴的环境下进行第一次乳化，剪切转速为15000rpm，时间为20s，得到初乳。

(2)称取一定质量的PVA溶于一定体积的蒸馏水中，过夜溶胀搅拌溶解或加热至80至90℃溶解，配置为PVA质量分数为4％的溶液，溶解完全之后冷却至室温，在上一步得到的初乳中加入一定体积的PVA溶液，控制PPLA与PVA的体积比为1:10，同样使用匀浆机在冰浴的环境下进行第二次乳化，剪切转速为5000rpm，时间为60s，得到复乳。

(3)在EP管中放入一颗大小适中的搅拌子，将复乳放置于磁力搅拌器上搅拌4h，去除有机溶剂，转速为400rpm。

(4)最后将复乳离心水洗3次，去除未挥发干净的有机溶剂，离心转为5000rpm时间为6min。在-60℃，10Pa的条件下冷冻干燥得到由PPLA包载BMP-2蛋白的微球。

将本实施例制备的BMP-2/PPLA微球置于光学显微镜下观察，本实施例的微球呈球形，外观完整，流动性很好。本实施例制备的BMP-2/PPLA微球的超景深显微镜图如图1所示，用激光粒度分析仪测得的BMP-2/PPLA粒径分布图如图2所示。由图1和图2可以看出，本实施例制备的BMP-2/PPLA微球表面光滑，大小均一，稳定性高。

BMP-2的含量测定采用考马斯亮蓝法。精密吸取BMP-2蛋白储备液加水稀释，制备8～10个浓度平均分布在5.0～55μg/ml的系列标准溶液。以水为空白溶液，取每个标准浓度溶液1ml分别加入5ml考马斯亮蓝G250染液，于579nm波长处测定吸光度(A)，以吸光度A为纵坐标，BMP-2浓度c(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线。根据含量测定方法学的要求，配制5.5、27.5、49.5μg/ml3个浓度的BMP-2溶液进行回收率和精密度的测定。

如下配置系列标准溶液(5.5、11、16.5、22、27.5、33、38.5、44、49.5μg/ml)

绘制BMP-2含量测定标准曲线，结果如图3所示。

包封率EE(％)与载药量DL(％)的计算：

根据含量测定方法学的要求，配制5.5、27.5、49.5μg/ml3个浓度的BMP-2溶液进行回收率和精密度的测定。

取步骤(3)操作后经溶剂挥发后得到的乳液，在离心机上以5000rpm的速度离心6min，精密量取1ml上清液置于10ml具塞试管中，根据考马斯亮蓝法用TU-1810紫外可见分光光度计测定其吸光度，按图3的回归方程得出上清液中BMP-2含量。

BMP-2-PLGA-MS的包封率(％)＝[(投入的总药量-上清液中游离药量)/投入的总药量]×100％＝(79.80±0.06)％。

BMP-2-PLGA-MS的载药量(％)＝(微球中的药物量/微球总重量)×100％＝(0.18±0.03)％。

实施例2：BMP-2-PPLA-MS的制备

(1)称取一定质量的PPLA溶于二氯甲烷中，使用涡旋机振荡溶解，配制得到PPLA浓度为95mg/ml的溶液。取一定体积的PPLA(分子量为50000Da)溶液置于EP管中，加入BMP-2蛋白储备液(浓度为0.55mg/ml)，控制BMP-2蛋白储备液与PPLA溶液加入的体积比为1：5；使用匀浆机在冰浴的环境下进行第一次乳化，剪切转速为16000rpm，时间为15s，得到初乳。

(2)称取一定质量的PVA溶于一定体积的蒸馏水中，过夜溶胀搅拌溶解或加热至80至90℃溶解，配置为PVA质量分数为4％的溶液，溶解完全之后冷却至室温，在上一步得到的初乳中加入一定体积的PVA溶液，控制PPLA与PVA的体积比为1:10，同样使用匀浆机在冰浴的环境下进行第二次乳化，剪切转速为5500rpm，时间为50s，得到复乳。

(3)在EP管中放入一颗大小适中的搅拌子，将复乳放置于磁力搅拌器上搅拌4h，去除有机溶剂，转速为400rpm。

(4)最后将复乳离心水洗3次，去除未挥发干净的有机溶剂，离心转为5000rpm时间为6min。在-60℃，10Pa的条件下冷冻干燥得到由PPLA包载BMP-2蛋白的微球。

按实施例1的方法对包封率和载药量进行检测，结果为：本实施例的BMP-2-PPLA-MS的包封率为(77.42±0.14)％；载药量为0.16±0.02％。

实施例3：BMP-2-PPLA-MS的制备

(1)称取一定质量的PPLA溶于二氯甲烷中，使用涡旋机振荡溶解，配制得到PPLA浓度为85mg/ml的溶液。取一定体积的PPLA(分子量为50000Da)溶液置于EP管中，加入BMP-2蛋白储备液(浓度为0.55mg/ml)，控制BMP-2蛋白储备液与PPLA溶液加入的体积比为1：5；使用匀浆机在冰浴的环境下进行第一次乳化，剪切转速为14000rpm，时间为25s，得到初乳。

(2)称取一定质量的PVA溶于一定体积的蒸馏水中，过夜溶胀搅拌溶解或加热至80至90℃溶解，配置为PVA质量分数为4％的溶液，溶解完全之后冷却至室温，在上一步得到的初乳中加入一定体积的PVA溶液，控制PPLA与PVA的体积比为1:10，同样使用匀浆机在冰浴的环境下进行第二次乳化，剪切转速为4500rpm，时间为70s，得到复乳。

(3)在EP管中放入一颗大小适中的搅拌子，将复乳放置于磁力搅拌器上搅拌4h，去除有机溶剂，转速为400rpm。

(4)最后将复乳离心水洗3次，去除未挥发干净的有机溶剂，离心转为5000rpm时间为6min。在-60℃，10Pa的条件下冷冻干燥得到由PPLA包载BMP-2蛋白的微球。

按实施例1的方法对包封率和载药量进行检测，结果为：本实施例的BMP-2-PPLA-MS的包封率为(78.56±0.20)％；载药量为0.19±0.03％。

对比例1：

将实施例1中加入的PPLA的分子量调整为40000Da，其他同实施例1，制备得到BMP-2-PPLA-MS。

按实施例1的方法对包封率和载药量进行检测，结果为：本对比例的BMP-2-PPLA-MS的包封率为(64.72±0.24)％；载药量为0.12±0.04％。

对比例2：

将实施例1中加入的PPLA的分子量调整为60000Da，其他同实施例1，制备得到BMP-2-PPLA-MS。

按实施例1的方法对包封率和载药量进行检测，结果为：本对比例的BMP-2-PPLA-MS的包封率为(63.26±0.18)％；载药量为0.13±0.02％。

对比例3：

将实施例1的步骤(1)中，第一次乳化的剪切转速调整为14000rpm，时间为30s；步骤(2)中，第二次乳化的剪切转速调整为6000rpm，时间为50s。其他同实施例1，制备得到BMP-2-PPLA-MS。

结果发现，该对比例制备的BMP-2-PPLA-MS的粒径大小不一，彼此之间会有粘连。

按实施例1的方法对包封率和载药量进行检测，结果为：本对比例的BMP-2-PPLA-MS的包封率为(65.34±0.15)％；载药量为0.14±0.02％。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。