本发明属于总黄酮提取技术领域，尤其涉及一种岩生忍冬总黄酮提取方法。
背景技术：
岩生忍冬(Lonicera rupicola Hook.f.&Thomson)，又名西藏忍冬，为忍冬科忍冬属藤本药用植物，主要产于宁夏南部、甘肃(临潭)、青海东南部、四川西部、云南西北部及西藏东部至西南部，生于高山灌丛草甸、流石滩边缘、林缘河滩草地或山坡灌丛中。忍冬属植物俗称金银花，是具有悠久历史的常用中药，常作为金银花入药。其主要的提取活性成分是黄酮类化合物，黄酮类化合物是现代很多药用植物的主要成分，具有抗菌消炎、增加脑血流量及冠脉流量、降压、抗肿瘤和阵痛、抗癌和调节免疫等作用。有关岩生忍冬中的黄酮类化合物研究的报道较少，通过参考了相关文献后，发现国内外文献对岩生忍冬这一资源的乙醇回流提取总黄酮的工艺优化的报道较少，且根据已报道的文献中，同属的药用植物总黄酮的最优提取工艺是乙醇回流提取方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种岩生忍冬总黄酮提取方法，旨在解决国内外文献对岩生忍冬这一资源的乙醇回流提取总黄酮的工艺优化的报道较少的问题。
本发明是这样实现的，一种岩生忍冬总黄酮提取方法，所述岩生忍冬总黄酮提取方法采用乙醇回流提取法对岩生忍冬总浸膏的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度80％、浸提温度60℃、浸提次数3次、料液比1:20。
本发明的另一目的在于提供一种由所述岩生忍冬总黄酮提取方法提取的岩生忍冬总黄酮制备的抗菌消炎药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述岩生忍冬总黄酮提取方法提取的岩生忍冬总黄酮制备的增加脑血流量及冠脉流量药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述岩生忍冬总黄酮提取方法提取的岩生忍冬总黄酮制备的降压药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述岩生忍冬总黄酮提取方法提取的岩生忍冬总黄酮制备的抗肿瘤药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述岩生忍冬总黄酮提取方法提取的岩生忍冬总黄酮制备的抗癌药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述岩生忍冬总黄酮提取方法提取的岩生忍冬总黄酮制备的调节免疫药物。
本发明提供的岩生忍冬总黄酮提取方法，采用正交设计试验的方法探索岩生忍冬总黄酮乙醇回流提取工艺的最优条件，确定岩生忍冬中黄酮类化合物的乙醇提取法的最优工艺条件和测定其总黄酮的抗菌活性，为合理利用岩生忍冬这一宝贵资源提供理论依据和数据参考。优选岩生忍冬总黄酮乙醇提取工艺的最佳条件及检测其的抗菌活性。以总黄酮的浸膏率为指标，采用正交试验设计L9(34)考察乙醇浓度、温度、浸提次数和料液比对岩生忍冬总黄酮乙醇提取工艺的影响；测定岩生忍冬总黄酮对14种标准菌的最小抑菌浓度(MIC)。岩生忍冬总黄酮乙醇提取法最佳提取工艺条件为：乙醇浓度80％、提取温度60℃、浸提次数3次、料液比1：20，提取的黄酮类化合物为岩生忍冬干重的2.76％；岩生忍冬总黄酮对14种标准菌有一定的抑制作用。该工艺的重现性较好，对岩生忍冬总黄酮的进一步开发利用有参考价值。
根据正交试验结果分析表明，采用乙醇回流提取法对岩生忍冬总浸膏的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度80％、浸提温度60℃、浸提次数3次、料液比1:20。在此条件下，3次平行试验平均的总浸膏提取率为24.92％。均值都高于正交试验的浸膏率，总黄酮浸膏率为2.76％。且提取物总黄酮对14种标准菌都有一定的抑制作用，最小抑菌浓度在2.588～10.35mg/mL之间。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1药材
岩生忍冬采自红原，由西南民族大学药理研究室陈朝喜副教授鉴定为忍冬科忍冬属植物，茎叶晒干后置于恒温干燥箱内备用。
1.1.2供试菌株
维氏气单胞菌CGMCC3700、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞杆菌CGMCCPa3、普通变形杆菌CGMCC1.491、肺炎克雷伯氏菌CGMCC1.1062、痢疾志贺氏菌CGMCC1.1869、中间耶尔森氏菌CGMCC1.6197、肠沙门氏菌肠亚种CGMCC1.10754、粘质沙雷氏菌CGMCC1.4256、金黄色葡萄球菌ATCC25913、F菌(粪肠球菌ATCC25912)、S菌(屎肠球菌ATCC35667)、阪崎肠杆菌CGMCC1.6765、阴沟肠杆菌阴沟亚种CGMCC 1.2022，由西南民族大学药理实验室保存提供。
1.1.3试剂
无水乙醇、80％乙醇、70％乙醇、60％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、去离子水、二甲基亚砜、氢氧化钠溶液等。
1.1.4主要设备及耗材
电子天平、索氏提取器、超纯水仪、RE-3000旋转蒸发仪、循环水真空泵、低温冷却液循环泵、电热鼓风烘干箱、恒温干燥箱、无菌操作台、立式压力蒸汽灭菌器、试管、量筒、烧杯、茄形瓶、玻璃棒、试管架、注射器、记号笔、称量纸、移液枪、枪头、接种环、接种针、圆底锥形瓶、平底锥形瓶、一次性手套、口罩等。
1.1.5培养基
MH肉汤：按MH肉汤粉、蒸馏水比例为21g/1000mL配制。在电子天平上称取一定量的MH肉粉剂于锥形瓶中，并加入相应比例的蒸馏水，溶解后将一部分分装至试管(每管3mL)，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压蒸汽灭菌20min后取出，放置于37℃培养箱，24h后做无菌检查，合格者放入4℃冰箱保存备用。
1.2方法
1.2.1乙醇提取法工艺流程
称取5g岩生忍冬茎叶→乙醇回流→趁热过滤→合并滤液→减压、浓缩→鼓风干燥箱烘干10min→计算总净膏率→选取最优工艺条件进行3次平行试验→分别计算其的总净膏率→分别用去离子水溶解→合并溶液→取一定量的溶液NaOH溶液进行碱性显色反应→2BV石油醚脱色→2BV乙酸乙酯萃取→减压、浓缩→鼓风干燥箱烘干10min→计算3次平行试验所得总黄酮的浸膏率。
1.2.2正交设计试验
称取9份5g岩生忍冬茎叶备用，按照乙醇回流提取因素水平表1和L9(34)正交试验设计表2对岩生忍冬进行乙醇回流提取1h，趁热过滤，合并滤液，用同等浓度的乙醇洗涤药渣2-3次，一并纳入滤液，冷却后定容，摇匀，待用。然后将滤液置于60℃、90r/min的条件下在旋转蒸发仪器上进行减压、浓缩。浓缩成浸膏后置于电热恒温鼓风干燥10min，取出称重，求总浸膏率。总浸膏率计算公式为：
总浸膏率(％)＝总浸膏质量/岩生忍冬干重×100％
表1：L9(34)正交试验因素水平表
1.2.3平行试验
为了进一步考察上述提取工艺的最优条件的稳定性和合理性，按照该提取流程的最优工艺条件下进行3次重复性实验，分别称取3份5g的岩生忍冬茎叶进行乙醇回流提取，且分别将滤液置于60℃、90r/min条件下，在旋转蒸发仪器上进行减压、浓缩。浓缩后置于电热恒温鼓风干燥箱烘干10min，取出称重，分别求其总浸膏率。验证该条件是否为最优的提取条件。
1.2.4总黄酮的提取和分离
将3次平行试验的总浸膏加入适量的去离子水溶解后，定容。用2BV的石油醚脱色，取下层液体，再用2BV的乙酸乙酯萃取，取上层液体，将溶液置于60℃、90r/min条件下，在旋转蒸发仪器上进行减压、浓缩。浓缩后置于电热恒温鼓风干燥箱烘10min，取出称重，计算总黄酮的浸膏率。
总黄酮浸膏率(％)＝萃取后的浸膏质量/岩生忍冬干重×100％
1.2.5总黄酮的碱性反应
加入适量的去离子水将萃取后的浸膏溶解。用NaOH溶液检测浸膏溶液是否含有黄酮类化合物。(碱性显色反应：二氢黄酮类与查耳酮类化合物易在碱性条水平条件下呈橙色→黄颜色；黄酮类化合物在碱性条件下不稳定易氧化，产生黄色→深红色→绿棕色沉淀；黄酮醇类在碱液中先呈黄色，通入空气后变为棕色)确定该溶液含有黄酮类化合物后，将该溶液置于60℃、90r/min条件下，在旋转蒸发仪器上进行减压、浓缩。浓缩后置于电热恒温鼓风干燥箱烘干10min，取出称重，求黄酮类化合物的浸膏得率。然后加10毫升的二甲基亚风溶液将浸膏溶解备用。
1.2.6体外抗菌试验
1.2.6.1提取物药液浓度的设置取用10mL二甲基亚基砜溶解后的总黄酮提取物通过孔径0.22μm(尼龙66)的过滤筛在无菌工作台中过滤。
1.2.6.2菌悬液的制备
在无菌操作台中，在标准菌株培养基中挑取单个菌落接种于3mLMH肉汤试管中，放置于37℃350rpm的摇床中震荡培养4h，制得供试菌液，再用MH肉汤把菌液稀释1000倍后备用。
1.2.6.3最小抑菌浓度(MIC)的测定
参照CLSI(2013版)指导原则和执行标准，采取微量肉汤稀释法测定岩生忍冬总黄酮对14种标准菌株的体外抑制的敏感度，用滤头将总黄酮浸膏溶液过滤待用。取14个96孔板，按照倍比稀释法，将MH肉汤按照每孔100加入96孔板。提取物均加100μL，以不加菌悬液的总黄酮药液为阴性对照，37℃培养24h后观察MIC结果。所有阴性对照孔培养基澄清，说明本实验方法可行。孔底部清晰不出现菌体沉淀的最低抗菌药物浓度，即为该菌的最小抑菌浓度。
2.结果与分析
2.1正交设计试验结果与分析
乙醇回流法提取岩生忍冬的总浸膏量的正交实验结果及直观分析表2和方差分析表3，如下所示：
表2：L9(34)正交试验结果
正交设计实验结果及直观分析表2和9次水平试验结果表明：参考R值可以直接得出考察因素对岩生忍冬总浸膏提取影响的大小顺序为：提取温度>乙醇浓度>料液比>浸提次数；A3B1C3D2即乙醇浓度80％、提取温度60℃、浸提次数3次、料液比1：30，是岩生忍冬总浸膏乙醇回流提取法提取率最高的一组试验。
表3：L9(34)正交试验方差分析表
正交设计试验方差分析表3结果表明：选定的四个因素乙醇浓度、提取温度、料液比、浸提次数在设定的水平内对岩生忍冬总浸膏的提取率影响无显著性差异，因此只能根据直观分析表3结果以及各考察因素的效应曲线图进行选择最优的提取工艺条件，最优工艺条件为：A3B1C3D1即乙醇浓度80％、提取温度60℃、浸提次数3次、料液比1：20。
2.2平行试验结果与分析
3次平行试验总浸膏率分别为23.9％、25.92％、24.94％，结果均高于L9(34)正交设计试验的结果(表2)，3组平行试验总浸膏的提取量为3.738g，结果表明该方法重现性良好，A3B1C3D1即乙醇浓度80％、提取温度60℃、浸提次数3次、料液比1：20是乙醇回流法提取岩生忍冬的最优工艺条件。
2.3总黄酮的提取和分离结果与分析
根据相关文献报道，平行实验所得到的忍冬总浸膏混悬于适量的水，可以用石油醚萃取得到石油醚萃取物后再用同等体积的乙酸乙酯除去其他杂质，取乙酸乙酯层旋转蒸发成浸膏后即得到总黄酮的粗提物。总黄酮的浸膏质量为0.414g，按照上述公式计算，岩生忍冬总黄酮的提取率为2.76％。
2.4总黄酮的碱性反应结果与分析
经过石油醚和乙酸乙酯萃取后得到的提取液进行的碱性显色反应的颜色变化为由黄色→棕色，与上述的黄酮类化合物的碱性显色反应产生的颜色变化即黄色→棕色基本一致，因此可以判断萃取后的岩生忍冬总浸膏中含有黄酮醇类等物质。
2.5最小抑菌浓度的测定结果与分析
表4：总黄酮对14种病原菌的MIC试验结果
由表4中的数据得出，岩生忍冬中提取的总黄酮对上述14种标准菌均有一定的抑制作用。具体情况如下：
总黄酮提取物对铜绿假单胞杆菌、普通变形杆菌、肠沙门氏菌肠亚种、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、痢疾志贺氏菌等7种菌株的抑制作用最强，最小抑菌浓度为2.588mg/mL；对维氏气单胞菌、粘质沙雷氏菌、F菌(粪肠球菌)、S菌(屎肠球菌)、阴沟肠杆菌阴沟亚种、中间耶尔森氏菌等6种菌株有较强的抑菌作用，最小抑菌浓度为6.9mg/mL；对大肠杆菌有一定的抑菌作用，最小抑菌浓度为10.35mg/mL。
黄酮类化合物是岩生忍冬中的主要活性成分之一，具有广泛的药用前景和商用价值。其在植物体内以苷或苷元的形式存在，根据有关文献报道，在大多数的情况下，用有机溶剂可将苷或苷元全部提出，甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂常用来提取黄酮类化合物，但由于甲醇、丙酮等毒性较大，黄酮化合物在乙醇中易溶解且提取率也相对较高，因此一般采用乙醇为提取溶剂。正交试验设计的分析方法是目前最常用的工艺优化实验设计和分析方法。用正交表安排实验方案，并利用计算机软件即正交设计助手进行计算分析，最终迅速找到优化方案，是一种高效处理多因素优化问题的科学计算方法。本实验以岩生忍冬茎叶的总浸膏率为指标，通过乙醇回流法的正交实验设计优化其总黄酮提取工艺条件。最终得到的最优方案A3B1C3D1的总浸膏率的均值为24.92％，该结果比正交表中的任一方案的结果都高。正交设计试验节能省时，流程简单、易操作，弥补了单一因素对提取工艺操作达不到优化的结果，从而使结果更加可靠。为优化岩生忍冬总浸膏率的提取工艺提供了理论方法依据。
本实验的正交设计试验的方差分析结果显示，该正交设计实验在设定的水平内。平行试验所得的总浸膏经石油醚、乙酸乙酯处理后，所得的总黄酮浸膏率为2.76％。根据最小抑菌浓度结果表明，岩生忍冬总黄酮提取物对14种标准菌株都有一定的抑制作用，但是对大肠杆菌的敏感度较低，其最小的抑菌浓度为10.35mg/mL。但是对其他的革兰氏阴性菌(铜绿假单胞杆菌、普通变形杆菌、肠沙门氏菌肠亚种、痢疾志贺氏菌等)有较强的敏感性，其的最小抑菌浓度均为2.588mg/mL。革兰氏阳性菌(金黄色球菌)的最小抑菌浓度为2.588mg/mL，与本次实验中的革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度相比较表明：岩生忍冬总黄酮提取物对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌都有一定的抑菌作用。为合理开发岩生忍冬这一药用资源提供参考数据。
根据正交试验结果分析表明，采用乙醇回流提取法对岩生忍冬总浸膏的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度80％、浸提温度60℃、浸提次数3次、料液比1:20。在此条件下，3次平行试验平均的总浸膏提取率为24.92％。均值都高于正交试验的浸膏率，总黄酮浸膏率为2.76％。且提取物总黄酮对14种标准菌都有一定的抑制作用，最小抑菌浓度在2.588～10.35mg/mL之间。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。