一种微囊藻乙醇提取物及其制备方法与应用与流程

本发明属于海洋生物技术领域，尤其涉及一种微囊藻乙醇提取物及其制备方法与应用。

背景技术：

人类的有机体是由诸多元素所组成，人体抗氧化能力水平的髙低取决于这些构成元素及其组成。例如硒是生物机体必不可少的微量元素，同时也是体内重要的抗氧化剂，对维持人体健康、延缓衰老具有重要的作用。自由基是人体正常的代谢产物，生物体内的自由基主要为氧自由基。氧自由基是氧在还原时接受电子不足所产生的一类具有高度化学反应活性的含氧基团，主要有超氧自由基、羟基自由基、单线态氧、过氧自由基和过氧化氮自由基等。在生理条件下中，机体可通过有效的酶和非酶体系来清除体内氧自由基，从而使其处于生理动态平衡中。当有某种因素使氧自由基生成过多超出机体清除能力或机体清除能力减弱，使体内氧自由基水平高于平衡点，氧自由基可通过与dna、蛋白质和不饱和脂肪酸作用，造成dna氧化损伤、蛋白质交联以及脂质的过氧化，从而引发炎症、造成分子降解，机体衰老或是患上衰老相关的疾病。因此，通过筛选具有抗氧化特性的物质来辅助提高机体的抗氧化能力是提高机体的抗氧化能力、延缓衰老的直接、有效、方便的重要方法之一。

微藻是一类于海洋、湖泊、河流等水体环境中独立存在或成链状、团状存在的单细胞微观藻类。微藻具有极大的生物多样性，约有200000～800000种微藻，其中约35000种已有描述，超过15000种从藻类生物物质中产生的新型化合物已进行化学鉴定。微藻所生产及含有的活性成分具有重要经济价值和社会价值，在医药、保健食品、饲料、化工和环保等方面有广泛的应用。但目前研究的微藻种类范围较窄，且大部分微藻的应用研究主要集中在高效产油方面，在医药、保健食品方面的应用研究，目前主要集中在螺旋藻、小球藻和紫球藻等几种常见的微藻，对于其他微藻则相对报道较少。

微囊藻属蓝藻门蓝藻纲色球藻目色球藻科，细胞呈球形，由多数细胞包在胶质物中形成不规则群体。群体具无色、柔软而有溶解性的胶被，呈球形、长圆形，形状不规则网状或窗格状，微观或肉眼可见。微囊藻毒素((microcystin，mc)是微囊藻暴发所产生的一种肝毒素，是一类具有生物活性的环状七肽化合物，能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，同时也是强烈的肝脏肿瘤促进剂。目前对微囊藻的研究主要集中在微囊藻毒素方面，对其抗氧化方面的生物活性研究则鲜有报道。因此积极开发具有抗氧化作用的微囊藻提取物将对衰老相关疾病的预防和治疗有重大意义。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种微囊藻乙醇提取物。本发明提供的微囊藻乙醇提取物具有显著的抗氧化作用，可应用于制备具有抗氧化功能的保健食品和药品。

本发明的技术方案将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

一种微囊藻乙醇提取物，其制备方法包括如下步骤：

s1、取新鲜的微囊藻湿藻，在温度为-20℃～-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融3～5次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心5～15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；上清液即为微囊藻胞内液；

s2、向步骤s1所述的沉淀中加入体积分数为70％～99％的乙醇超声提取2～4次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心5～15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，即得微囊藻乙醇提取物。

优选地，步骤s2中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入乙醇进行超声提取。

优选地，步骤s2中超声提取的频率为35～40khz，温度为4℃。

优选地，步骤s2中每次超声提取的时间为10～30min。

本发明所述微囊藻(microcystissp.)由中国科学院水生生物研究所提供，其在中国科学院淡水藻种库中的编号为fachb-1349。

本发明人在对微藻进行研究的过程中，进行了大量的试验，意外发现微囊藻胞内液和对提取微囊藻胞内液后剩余的残渣进行乙醇超声提取制得到的微囊藻乙醇提取物均具有显著的抗氧化作用。

在整体动物水平上以氧化应激模型及衰老相关模型进行试验，试验结果表明本发明提供的微囊藻乙醇提取物能够显著延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率；同时，其能促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)的水平。本发明提供的微囊藻乙醇提取物具有显著的抗氧化作用，试验过程未发现微囊藻乙醇提取物对秀丽隐杆线虫具有毒性作用，说明本发明提供的微囊藻乙醇提取物安全无毒，可应用于制备具有抗氧化功能的保健食品和药品。

本发明微囊藻乙醇提取物可单独或与其他活性成分合用，作为唯一或主要活性成分应用于制备具有抗氧化功能的保健食品和药品，所述保健食品和药品的剂型优选为片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。

本发明所述的抗氧化作用是指对以病理或生理条件下因发生氧化应激反应所产生的变化为主要特征的衰老及衰老相关疾病的防治作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的微囊藻乙醇提取物可以促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)水平，具有显著的抗氧化作用。

(2)本发明提供的微囊藻乙醇提取物可以延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率，具有显著的抗衰老和抗氧化作用。

(3)本发明提供的微囊藻乙醇提取物的制备方法具有周期短，有机溶剂消耗少，工艺简单，安全无毒，稳定高效等特点，适合工业化生产。

附图说明

图1微囊藻乙醇提取物对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响。

图2微囊藻乙醇提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响。

图3微囊藻胞内液对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响。

图4微囊藻胞内液对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响。

图5微囊藻胞内液对秀丽隐杆线虫体内sod活力的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例中，微囊藻由中国科学院水生生物研究所提供，其在中国科学院淡水藻种库中的编号为fachb-1349。

sbasal溶液：称取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于试剂瓶中，加入750ml去离子水，完全溶解后定容至1l，灭菌30min，冷却至40-50℃备用。

smedium溶液：取1l灭菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml胆固醇乙醇溶液，边加变振摇，使其充分溶解(溶液由无色透明转为微乳白透明，无明显沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m柠檬酸钾溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常温放置备用。

实施例1微囊藻乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的微囊藻湿藻，在温度为-30℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融4次，在转速为8000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为85％的乙醇超声提取3次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为20min，在转速为8000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于微囊藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示微囊藻湿藻)，即得微囊藻乙醇提取物。

此外，取步骤s1离心后分离得到的上清液，加一级水调节其相对于微囊藻(湿藻)重量的浓度为2ga/ml(a表示微囊藻湿藻)，即得微囊藻胞内液。

实施例2微囊藻乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的微囊藻湿藻，在温度为-20℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融5次，在转速为10000r/min的条件下离心8min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为70％的乙醇超声提取3次，超声提取的频率为35khz，温度为4℃，每次超声的时间为30min，在转速为8000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于微囊藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示微囊藻湿藻)，即得微囊藻乙醇提取物。

实施例3微囊藻乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的微囊藻湿藻，在温度为-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融3次，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为90％的乙醇超声提取4次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为15min，在转速为5000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于微囊藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示微囊藻湿藻)，即得微囊藻乙醇提取物。

实施例4微囊藻乙醇提取物对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响

百草枯，学名甲基紫精，是一种强氧化剂，可诱导体内大量产生活性氧自由基(ros)，使机体处于氧化胁迫环境，进而出现早衰现象。

取实施例1制得的微囊藻乙醇提取物，按终浓度100mga/ml加入到成虫初期的野生型秀丽隐杆线虫(n2)(由美国明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传信息保藏中心提供)中，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，加入终浓度为50mm的百草枯进行氧化胁迫造模，然后每隔12h统计秀丽隐杆线虫存活的比例，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的存活率以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图1所示。

图1结果显示，微囊藻乙醇提取物能够延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率。试验结果表明本发明提供的微囊藻乙醇提取物能够缓解由氧化胁迫引起的早衰现象，具有显著的抗氧化和抗衰老作用。

实施例5微囊藻乙醇提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响

取24孔培养板，设试验组和对照组，每组设两个孔，每孔终体积为1ml，试验组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和实施例1制得的微囊藻乙醇提取物，微囊藻乙醇提取物的终浓度100mga/ml，对照组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和与试验组微囊藻乙醇提取物等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，每孔加入百草枯至终浓度为2mm，继续培养48h后，收集各组秀丽隐杆线虫，将其分别在冰浴条件下匀浆，将匀浆液在4℃、10000g条件下离心5min，收集上清液，向上清液中加入终浓度为50μm的dcfh-da探针(购于sigma公司，cas号：2044-85-1)溶液，利用荧光酶标仪在485nm激发波长和538nm发射波长下检测荧光强度，室温检测2h，每10min测一次。结果用f检验分析，结果如图2所示。

图2结果显示，与对照组相比，经微囊藻乙醇提取物饲喂后，秀丽隐杆线虫体内ros水平显著下降。试验结果表明本发明提供的微囊藻乙醇提取物能够促进体内ros的清除，降低体内ros水平，具有显著的抗氧化能力。

实施例6微囊藻胞内液对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响

取实施例1制得的微囊藻胞内液，按终浓度300mga/ml加入到成虫初期的野生型秀丽隐杆线虫(n2)中，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，加入终浓度为50mm的百草枯进行氧化胁迫造模，然后每隔12h统计秀丽隐杆线虫存活的比例，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的存活率以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图3所示。

图3结果显示，微囊藻胞内液能够延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率。试验结果表明本发明提供的微囊藻胞内液能够缓解由氧化胁迫引起的早衰现象，具有显著的抗氧化和抗衰老作用。

实施例7微囊藻胞内液对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响

取24孔培养板，设试验组和对照组，每组设两个孔，每孔终体积为1ml，试验组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和实施例1制得的微囊藻胞内液，微囊藻胞内液的终浓度100mga/ml，对照组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和与试验组微囊藻胞内液等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，每孔加入百草枯至终浓度为2mm，继续培养48h后，收集各组秀丽隐杆线虫，将其分别在冰浴条件下匀浆，将匀浆液在4℃、10000g条件下离心5min，收集上清液，向上清液中加入终浓度为50μm的dcfh-da探针溶液，利用荧光酶标仪在485nm激发波长和538nm发射波长下检测荧光强度，室温检测2h，每10min测一次。结果用f检验分析，结果如图4所示。

图4结果显示，与对照组相比，经微囊藻胞内液饲喂后，秀丽隐杆线虫体内ros水平显著下降。试验结果表明本发明提供的微囊藻胞内液能够促进体内ros的清除，降低体内ros水平，具有显著的抗氧化能力。

实施例8微囊藻胞内液对秀丽隐杆线虫体内sod活力的影响

取24孔培养板，设试验组和对照组，每组设两个孔，每孔终体积为1ml，试验组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和实施例1制得的微囊藻胞内液，微囊藻胞内液的终浓度100mga/ml，对照组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和与试验组微囊藻胞内液等体积的smedium溶液，置于20℃培养72h后，收集各组秀丽隐杆线虫，将其分别在冰浴条件下匀浆，将匀浆液在4℃、10000g条件下离心5min，收集上清液，利用总sod活性检测试剂盒(购于碧云天生物技术研宄所，产品编号：s0101)测定秀丽隐杆线虫匀浆上清液中sod活力。结果如图5所示。

图5结果显示，与对照组相比，微囊藻胞内液能显著提高秀丽隐杆线虫体内sod的活力。试验结果表明本发明提供的微囊藻胞内液能够显著提高体内sod的活力，具有显著的抗氧化能力。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。