本发明涉及药学技术领域，尤其是大通塔提取物在制备治疗羊体内蠕虫病药物中的应用及制备方法。
背景技术：
长期以来，我国在中兽医培养人才上重视不够，中兽医发展滞后，掌握中草药防治畜禽疾病的兽医人员很少。加上，使用时大多以传统的使用方法，用量大，使用麻烦等原因，还有就是中兽药的疗程相对要长。而西药具有疗效快、用量少、使用方便等特点更受兽医人员青睐。因此，近些年来，西药防治畜禽疾病已成了主流，用于防治畜禽疾病的西药药物的数量和种类不断增加，从目前来看，畜牧业寄生虫病的防治主要用阿(伊)维菌素、左旋咪唑、阿苯达唑和吡酮喹等西药为主。使用这些药物往往残留在畜禽体内，直接或间接地威胁着人们的健康。随着科技的不断进步，人们对一些药物有了新的认识，国家适时出台相关文件禁止生产和使用一些危害人类身体健康的药物，今后畜禽疾病的防治趋势主要提倡非抗生化、非激素化。由于大多数中草药无毒无害，无副作用或副作用较小，无残留或残留量很少，无碍畜禽和人体健康，甚至对畜体和人体健康有促进作用。因此，随着人们对肉食品的原生态化的消费需求，开展中草药代替西药防治畜禽疾病，以填补这些被限量使用或禁用的药物而带来的问题，将是我国乃至世界今后一段时期内畜牧业发展过程中的重大转变，是生产绿色肉食品、原生态肉食品的最佳用药选择。因此，中兽医将是今后兽医的必然走向，研究中兽医的发展空间很大。
大通塔又名通草、方草，适应性广，易于繁殖，其药用价值目前人们所掌握的主要清热利尿，通气下乳和抗炎作用。
技术实现要素：
本发明的目的是：提供大通塔提取物在制备治疗羊体内蠕虫病药物中的应用。
本发明的另一个目的是：提供大通塔提取物的制备方法。
本发明是这样实现的：大通塔提取物在制备治疗羊体内蠕虫病药物中的应用。
大通塔提取物的制备方法，将大通塔的根皮加水，料液比为1：2-3，单位为g/ml，将加水药物在大火中煮沸，然后文火保持最低沸腾状态熬煮1-2h，滤掉药渣后，获得的药汤即为大通塔提取物。
为了进一步验证本发明的技术效果，申请人进行了如下实验：
实验方法
根据经验初步判断，雷山县五七干校养羊场的羊群可能患绦虫病，雷山县合喜养羊场的羊群可能同时患肺丝虫病和肝片吸虫病。因此，本实验分别在两个养羊场进行实验。五七干校养羊场进行绦虫病的疗效实验，合喜养羊场养羊场进行肺丝虫和肝片吸虫的疗效实验。
(一)实验羊的选择
1、初选实验羊。
(1)患绦虫病实验羊选择。一般地，羊患绦虫病后，表现为被毛粗乱、卷曲、无光泽，消瘦，患病严重的病羊，排出的粪便颗粒往往成团状，甚至拉稀。有的羊排出粪便时，有呈乳白色胶样的肉眼可见的幼虫随粪便一起排出体外，粘在粪便的表面或夹于羊粪之间，有一定的粘性，可将几粒甚至10多粒的粪球粘成团。一般地说，在一个经常放牧的养羊场中，只要观察到有羊排出的粪便带有绦虫幼虫时，那么这个场的大部分羊都已经患了绦虫病。将这些疑似病羊按顺序编号，并依次取这些疑似病羊排出的新鲜粪便直接肉眼观察或经浮聚法处理后镜检，确定粪样中含有绦虫卵、幼虫或成虫的相对应的羊就可作为本实验用羊。
(2)患肺丝虫病实验羊选择。患了肺丝虫病的羊一般都是被毛粗乱、卷曲、无光泽，消瘦，经常咳嗽，喷鼻，甩头，往往采用腹式呼吸，有时抽搐，空口磨牙，口流白沫，头后仰。对疑似病羊分别用无抗凝剂真空采血管进行颈静脉采血后，对分离的血清用山羊肺丝虫试剂盒进行ELISA检测，对呈阳性的血样所对应的羊即可选为本实验用羊。
(3)患肝片吸虫病实验羊选择。羊体被毛粗乱、卷曲、无光泽，易脱落，消瘦，精神不振，粘膜苍白，放牧时行走缓慢，采食逐渐减少，拉稀，患病严重的羊，其眼皮、下颚、胸部、腹部呈水肿现象。对疑似病羊分别用无抗凝剂真空采血管进行颈静脉采血后，对分离的血清用山羊肝片吸虫试剂盒进行ELISA检测，对呈阳性的血样所对应的羊即可选为本实验用羊。
对经过测定为同时交叉患有肝片吸虫病和肺丝虫病的羊，可以同时进行实验。
2、寄生虫的检测方法
(1)粪便直接观察法
此法主要对肉眼可以直接看见的较大的成虫和幼虫。一般是先对新鲜羊粪的表面进行观察，有些较大蠕虫的成虫和幼虫直接附于羊粪球表现，可以肉眼观察到。但有一些是在羊粪球内，不能直接看到，需要将羊粪盛于装有30—37℃温水的容器中，静置5—20分钟，这样藏于粪球中的一些幼虫或成虫就钻出粪球，粘在粪球表面上，或游在温水中，也可以直接观察到。或采用沉聚法收集寄生虫病的成虫、幼虫，即将粪球捣碎，搅拌均匀，静置沉淀10—20分钟，弃去上清液，再于沉淀物中重新加入清水，重复3—5次，最后取沉淀物于黑色背景上，用肉眼可观察虫体，也可借用放大镜进行查找。
(2)粪便镜检法
镜检法主要是检测用肉眼不能直接看到的较小的幼虫和虫卵。先将每只羊的羊粪进行一定过程的处理后，对余下的粪渣或粪液在显微镜内镜检，镜检时，先用低倍镜检查，发现虫卵、卵囊后换取高倍镜检查，检查时应有顺序地查遍盖玻片下的所有部分。依此判断该羊是否患寄生虫病及患病类型的方法。镜检前先对羊粪用浮聚法和沉聚法进行处理。
①浮聚法：取新鲜羊粪5—10g，放入盛有50—100ml的饱和食盐水(将食盐加入沸水中，直至不再溶解生成沉淀为止，用折叠成四层的细口纱布过滤后，冷却所得的食盐水，1000mL水中约加食盐400g)的杯内，搅拌均匀，然后用单层纱布过滤到另一个杯内，静置30分钟，这样比饱和食盐水比重轻的那些虫卵就浮到液面上来，再用细铁丝圈水平着接触液体表面，蘸取表面液膜，抖落于载玻片上，盖好盖玻片，显微镜下检查。
②沉聚法：取粪便5—10g置于烧杯中，加10～20倍量的清洁水，捣碎粪团，充分搅合，再用单层纱布滤过于另一杯中，滤液静置10分钟后，这样比水比重大的那些虫卵就沉于杯底，倾去上层液，再加水与沉淀物重新搅和、静置，如此反复水洗沉淀物多次(最少5次以上)，直至上层液透明为止，最后倾去上清液，用吸管吸取沉淀物滴于载玻片上，加盖玻片镜检。
(3)血液ELISA检测法
主要检测疑似病羊中是否患肺丝虫病和肝片吸虫病，采用ELISA检测法，步骤如下：
用无抗凝剂真空采血管对疑似病羊进行颈静脉采血，每只羊采血样3—5ml，在80—2电动离心机下以3000转/秒的速度进行离心5分钟后，收集试管内的上层血清。在预先洗涤好的微孔酶标板上设置2个阴性对照组和2个阳性对照组，每个孔分别加入阴性对照和阳性对照各50μl，用10ml的移液枪将吸取每只羊的血清10μl滴入微孔酶标板的相应孔内10μl，用40μl移液枪吸取样本稀释液分别加入各孔内。然后在阴阳对照孔和样本孔中每孔各加入检测抗体-HRP标记的检测抗原100μl，用封板膜封住反应孔，于37℃恒温箱温育60min，取出弃去液体，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15min。最后在各孔中加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的吸光度(OD值)。依此决断样品是否含有山羊肝片吸(FH)和山羊肺丝虫(Metastrongylidae)。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的山羊肝片吸(FH)和山羊肺丝虫(Metastrongylidae)都呈正相关。
3、判断依据
本实验采集的粪样是活羊新排出的新鲜粪便，由于寄生虫的年龄，宿主的免疫状态，雌虫的数量，粪便的浓稠度，寄生虫卵在羊体内的分布不均匀等，影响着排出虫卵的数量的不均匀，就无法代表体内虫体数量的比例关系。所以，所采集的粪便，很难以具体的虫卵数据来体现羊体内的寄生虫数量。因此只能作为定性判断，也即是说，对经处理后粪样进行多次镜检，只要粪样中检测到有一例虫卵，就确诊为相对应的羊患有绦虫病，但在实际镜检中，由于采集的粪样中的虫卵太小，或杂有其它与之形状极为相似的虫卵或杂物而无法准确判断，则另采集该羊的粪样放于一垫有单层滤纸的培养皿中，加水调成硬糊状。将此皿置30—35℃的恒温箱中培养，期间保持皿内湿度(垫纸保持潮湿状态)，14d左右，有些虫卵发育足够大，有的虫卵甚至发育成幼虫，此时取其中的粪样镜检，容易鉴别，易于判断。另外，在肝片吸虫和肺丝虫的ELISA检测中，呈阳性的，也能定性地判断为相对应的羊患有肝片吸虫病和肺丝虫病，但不能判断其中的含有量。因此，总的来说，本实验只是定性实验。
(1)绦虫病的判断依据：
成虫或幼虫的判断：呈背腹扁平的带状，白色或浅黄色，一般随粪便排出羊体外的成虫或幼虫的长度在1cm—10cm左右，较大的可看到比较一致的结节，有些虫静置3—10min后可观察到其表现轻微蠕动。在放大镜下可清楚地看到球状的头部。
虫卵的判断：在高倍镜下，绦虫卵一般呈无色或灰色的近圆形或三角形卵。其虫卵中央有一椭圆形具有三对胚钩的六钩蚴，内外胚膜分开，中间含有或多或少的液体，并有颗粒状内含物[2]。
(2)肝片吸虫病和肺丝虫病的判断：
试验有效性：阳性对照孔OD值平均值≥1.00；
阴性对照孔OD值平均值≤0.15
临界值(Cut off)的计算：临界值＝阴性对照孔平均值+0.15；
阴性判断：样品OD值＜临界值(Cut off)，样品为阴性；
阳性判断：样品OD值＞临界值(Cut off)，样品为阳性。
准确性：阳性对照孔OD值平均值≥1.00；阴性对照孔OD值平均值≤0.15，说明试验结果有效。
样品OD值大于临界值(Cut off)时，即为该羊患有相应的寄生虫病。
(二)实验羊分组及饲养管理
1、实验分组
(1)绦虫病羊实验分组
从确诊患绦虫病的50只羊中选30羊，分成3个组——空白对照组、西药治疗组和中草药治疗组，每组10只。
(2)肝片吸虫病羊和肺丝虫病羊实验分组
选60份进行ELISA检测同时患肝片吸虫病和肺丝虫病的血样相对应的21只羊，分成3个组——空白对照组、西药治疗组和中草药治疗组，每组7只。
2、实验羊饲养管理
实验羊选定后，按实验要求分组，每个组关于一个预先清扫干净的设有可临时拆装的漏缝木式床板的圈舍内进行舍饲，每个羊舍内有草架、料槽和饮水器。每天早晚各供一次草料，先喂精料(包谷面：麦麸：米糠：啤酒糟：豆粕＝58：13：14：8：7)，后喂青草料，以羊刚好吃饱即完，不剩余料为宜。青草料为人工栽培草皇竹草、燕麦和以芭茅为主的野生杂草，重量对半混合。供足清洁水，自由饮用。
(三)治疗方法
实验期为20天，在实验期内空白对照组不喂任何驱虫药物；西药治疗组用吡喹酮+阿苯哒唑混合剂(1：1)估计实验羊的活重每天按说明用量的1倍即150克，于实验第一天开始，将药物用水溶解，拌入精料饲喂，于早上喂一次，连喂3天后停药；中草药治疗组以大通塔根皮1kg加水2.5kg，先在大火中煮沸，然后微火保持最低沸腾状态熬1h，将弃药渣后药汤拌入精料投喂，每天早上喂一次，连喂3天后停药。
(四)治效结果
1、绦虫病治疗效果实验
(1)10—15d后，空白对照组的羊的膘情总体上没有变化，仍然表现为被毛粗乱、卷曲、无光泽，消瘦，有的羊排出粪便还带有肉眼可见的幼虫；西药治疗组和中药治疗组的羊的膘情逐渐好转，被毛开始发亮，实验前排粪成团或拉稀的羊，排粪成分散的颗粒状，羊只之间爱打斗。
(2)对镜检结果采用质量性状计数法进行统计结果如下：
表1：大通塔治疗羊绦虫病效果统计表
注：打“√”的检测到成虫、幼虫或虫卵；打“×”的没有检测到成虫、幼虫或虫卵。
表1中，经过治疗后，空白对照组中9只羊还查到虫卵，仅有1只羊未查到虫卵；西药治疗组有8只羊未查到虫卵，中药治疗组有9只羊未查到虫卵。经显著性检验表明：西药治疗组在治疗前后结果差异显著；中药治疗组在治疗前后结果差异显著；西药治疗组和中药治疗组差异不显著。
2、肝片吸虫病和肺丝虫病治疗效果实验
(1)10-15d后，空白对照组的羊的膘情总体上没有变化，仍然表现为被毛粗乱、卷曲、无光泽，消瘦，经常咳嗽，喷鼻，甩头，有时抽搐，空口磨牙，口流白沫，头后仰，粘膜苍白，放牧时行走缓慢，采食逐渐减少，拉稀，患病严重的羊，其眼皮、下颚、胸部、腹部呈水肿现象；西药治疗组和中药治疗组的羊，有部分羊的膘情逐渐好转，被毛开始发亮，羊只之间爱打斗。
(2)对ELISA检测结果采用质量性状计数法进行统计结果如下：
表2：大通塔治疗羊肝片吸虫病和肺丝病结果统计表
注：“+”表示ELISA检测结果呈阳性；“—”表示ELISA检测结果呈阴性
表2中，经过治疗后，空白对照组中肝片吸虫和肺丝虫的检测全部呈阳性，说明空白组中所有羊都还有肝片吸虫和肺丝虫。西药治疗组中，肝片吸虫病经治疗后，有6只羊呈阴性，说明已经治愈，仅有一只呈阳性，未治愈；肺丝虫病经治疗后，有6只羊呈阴性，说明已经治愈，仅有一只呈阳性，未治愈；中药治疗组中，肝片吸虫病经治疗后，7只羊均呈阴性，说明全部治愈；肺丝虫病经治疗后，有3只羊呈阴性，说明已经治愈，有4只呈阳性，未治愈。
经显著性检验表明：
①肝片吸虫病治疗效果实验中，西药治疗组在治疗前后结果差异显著；中药治疗组在治疗前后结果差异显著；西药治疗组和中药治疗组差异不显著。
②肺丝虫病治疗效果实验中，西药治疗组在治疗前后结果差异显著；中药治疗组在治疗前后结果差异不显著；西药治疗组和中药治疗组差异显著。
结论
大通塔提取物在治疗绦虫病和肝片吸虫病效果理想，治疗肺丝虫病时，有些羊治疗有效好，有些羊治疗无效。
发明人发现了大通塔提取物具有治疗羊体内蠕虫病的效用，特别是针对治疗绦虫病和肝片吸虫病效果理想，而对于肺丝虫病也具有一定疗效，本发明的成本低廉，来源广泛，毒副作用小。
具体实施方式
本发明的实施例：大通塔提取物在制备治疗羊体内蠕虫病药物中的应用，将大通塔的根皮1kg加水2.5kg，将加水药物在大火中煮沸，然后文火保持最低沸腾状态熬煮1h，滤掉药渣后，获得的药汤即为大通塔提取物。药汤拌入精料投喂，每天早上喂一次，连喂3天后停药。