本发明属于蜂产品制备方法领域，涉及一种水溶性蜂胶及其制备方法。
背景技术：
：蜂胶是蜜蜂采集植物树脂，并混入蜂蜡和其它分泌物加工而成的一种芳香物质。蜂胶具有广泛的药理活性，如抑菌、抗氧化、抗病毒、消炎、保肝和抗癌等。蜂胶作为功能性成分已广泛应用于食品、药品及保健品行业。目前，由于蜂胶是醇溶性的，限制了蜂胶在食品及医药领域的应用。蜂胶的水溶性很差，应用蜂胶时主要采用有机溶剂和乳化剂来制备蜂胶溶液，如乙醇、聚乙二醇等溶解或通过吐温、大豆磷脂、卵磷酯等乳化。以乙醇作为溶剂制备的蜂胶乙醇水溶液有很强的刺激味道，粘度大，从而限制其应用。采用乳化剂乳化后的蜂胶与水混合时形成乳浊液，难以在水为介质的产品中应用。而蜂胶水提取物大多提取蜂胶中水溶性物质，而主要活性成分黄酮类物质难以提取。因此，如果增加蜂胶的水溶性是当前迫切需要解决的问题。公开号cn200510049326.4的发明专利申请公开了蜂胶水溶液的制备工艺及应用，该专利是采用95％乙醇提取后加入50-100度热水中得到混合液，然后蒸发除去乙醇得到的，所提物质大多是蜂胶中的水溶性物质，黄酮含量低。公开号cn03150648.8的发明专利申请公开了一种水溶性蜂胶及提取方法，该专利是采用卵磷脂、大豆磷脂、聚乙二醇6000、吐温80、甘油酯等表面活性剂增加蜂胶水溶性。但在水比例加大时易沉淀。公开号cn1460512a的发明专利申请公开了一种水溶性蜂胶液及其制备方法，该专利是采用聚乙二醇增加蜂胶溶解性，但随水比例加大，蜂胶易析出。技术实现要素：本发明的目的是提供一种水溶性蜂胶的制备方法。本发明通过以下步骤实现：(1)在蜂胶原料中加入60％～95％的乙醇水溶液(g/ml)，超声波提取，过滤，除去不溶物，残渣反复提取三次，合并滤液得蜂胶提取液r1。蜂胶与乙醇比例限定在1：2～8(g：ml)。(2)在r1中按与蜂胶质量比1：0.5～3加入增溶剂聚氧乙烯醚氢化蓖麻油，搅拌使其完全溶解，然后旋转蒸发回收乙醇至液体无醇味得r2。(3)将r2置于热水中温浴，按与蜂胶质量比1：1～5加入助溶剂丙二醇，充分搅拌使蜂胶完全溶解。滤液冷却至室温、静置，过滤，即得蜂胶水溶液m。(4)将m干燥蒸出水份即得水溶性蜂胶流浸膏。其中：步骤(1)中超声波处理时间为15～45分钟。步骤(2)中的旋转蒸发浓缩是在温度45～70℃条件下进行。步骤(3)温浴温度为65～85℃。本发明的另一个目的是提供上述方法制备获得的水溶性蜂胶在化妆品、医药、保健食品领域中的应用。本发明制备的水溶性蜂胶的性能进行了如下项目测试：1、总黄酮含量(1)芦丁标准曲线的绘制精密吸取芦丁对照品使用溶液(0.2g/l)1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分别置于50ml容量瓶中。加无水乙醇至总体积为15ml，依次加人硝酸铝溶液(100g/l)1ml，醋酸钾溶液(9.8g/l)1ml，摇匀，加水至刻度，摇匀。静置1h。用1cm比色杯于415nm处，以30％乙醇溶液为空白，测定吸光度。以50ml中芦丁质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或按直线回归方程计算。线性工作范围0mg-1.2mg(50ml)。(2)空白试验精密称待测水溶性蜂胶样品1.0g，置于50ml容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15ml，加水稀释至刻度，摇匀。(3)测定总黄酮含量精密称待测水溶性蜂胶样品1.0g，置于50ml容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15ml，依次加人硝酸铝溶液(100g/l)1ml，醋酸钾溶液(9.8g/l)1ml，摇匀，加水至刻度，摇匀。静置1h。以空白试液(2.2.2.3.3.2)作参比，用1cm比色杯，在波长415nm处测定试料溶液的吸光度。查标准曲线或通过回归方程计算，求出水溶性蜂胶中的黄酮类化合物含量(mg)。2、抗氧化能力dpph自由基清除活性测定将本发明水溶性蜂胶样品用无水乙醇稀释一系列的浓度梯度，蜂胶样品：20～200μg/ml。取上述稀释液100μl加入100μl新配置的0.1mg/mldpph工作液，同时以不加dpph(以100μl无水乙醇代替dpph)的供试品溶液各浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设dpph阴性对照(以100μl无水乙醇代替供试品)，每组设2个平行复孔。室温避光反应30min后，在517nm处测定吸光度，使其读数在0.2～0.8之间。dpph清除率(％)＝(a0-as)/a0*100％as：加入样品提取液的dpph溶液的吸光度；a0：加入无水乙醇的dpph溶液的吸光度。3、抑菌能力配制牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖培养基，进行金黄色葡萄球菌、变形链球菌、白色念珠菌的活化及纯化，制备菌悬液和滤纸片。采用抑菌圈法测定本发明水溶性蜂胶对金黄色葡萄球菌、变形链球菌、白色念珠菌的抑菌圈大小，重复3次实验，进行显著性分析。本发明克服蜂胶水溶性难的缺点，提供一种水溶性蜂胶的制备方法。所获得的水溶性蜂胶提取物无醇味，无异味，蜂胶原有活性成分不会损失，与水以任意比例混溶。与现有的水溶性蜂胶相比，本发明的水溶性蜂胶具有下述特点：(1)制得的水溶性蜂胶加入任意量的水均可完全溶解。(2)总黄酮含量可高达18％，而现有水溶性蜂胶总黄酮含量低于5％。(3)不含乙醇，无刺激作用。(4)无刺激性气味，口感佳，受众广。具体实施方式本发明结合实施例作进一步的说明。通过下述实施例将能够更好地理解本发明。实施例1：本发明水溶性蜂胶的制备该实施例的实施步骤如下：(1)在蜂胶原料中按重量体积比1:3加入体积比95％的乙醇水溶液(g/ml)，超声波提取，过滤，除去不溶物，残渣反复提取三次，合并滤液得蜂胶提取液r1。(2)在r1中按与蜂胶质量比1：3加入聚氧乙烯醚氢化蓖麻油，搅拌使其完全溶解，然后旋转蒸发回收乙醇至液体无醇味得r2。(3)将r2置于热水中温浴，按与蜂胶质量比1：1加入丙二醇，充分搅拌使蜂胶完全溶解。滤液冷却至室温、静置，过滤，即得蜂胶水溶液m。(4)将m干燥蒸出水份即得水溶性蜂胶流浸膏。采用本申请说明书描述的方法对本实施例制备的水溶性蜂胶进行了下述性能测试：1、总黄酮含量(1)芦丁标准曲线的绘制精密吸取芦丁对照品使用溶液(0.2g/l)1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分别置于50ml容量瓶中。加无水乙醇至总体积为15ml，依次加人硝酸铝溶液(100g/l)1ml，醋酸钾溶液(9.8g/l)1ml，摇匀，加水至刻度，摇匀，静置1h。用1cm比色杯于415nm处，以30％乙醇溶液为空白，测定吸光度。以50ml中芦丁质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或按直线回归方程计算。线性工作范围0mg-1.2mg(50ml)。(2)空白试验精密称待测水溶性蜂胶样品1.0g，置于50ml容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15ml，加水稀释至刻度，摇匀。(3)测定总黄酮含量精密称待测水溶性蜂胶样品1.0g，置于50ml容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15ml，依次加人硝酸铝溶液(100g/l)1ml，醋酸钾溶液(9.8g/l)1ml，摇匀，加水至刻度，摇匀。静置1h。以空白试液(2.2.2.3.3.2)作参比，用1cm比色杯，在波长415nm处测定试料溶液的吸光度。查标准曲线或通过回归方程计算，求出水溶性蜂胶中的黄酮类化合物含量。2、抗氧化能力dpph自由基清除活性测定将本发明水溶性蜂胶样品用无水乙醇稀释一系列的浓度梯度，蜂胶样品：20～200μg/ml。取上述稀释液100μl加入100μl新配置的0.1mg/mldpph工作液，同时以不加dpph(以100μl无水乙醇代替dpph)的供试品溶液各浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设dpph阴性对照(以100μl无水乙醇代替供试品)，每组设2个平行复孔。室温避光反应30min后，在517nm处测定吸光度，使其读数在0.2～0.8之间。dpph清除率(％)＝(a0-as)/a0*100％as：加入样品提取液的dpph溶液的吸光度；a0：加入无水乙醇的dpph溶液的吸光度。表1总黄酮含量、抑菌能力及dpph自由基清除活性3、抑菌能力配制牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖培养基，进行金黄色葡萄球菌、变形链球菌、白色念珠菌的活化及纯化，制备菌悬液和滤纸片。采用抑菌圈法测定本发明水溶性蜂胶对金黄色葡萄球菌、变形链球菌、白色念珠菌的抑菌圈大小，重复3次实验，进行显著性分析。表2蜂胶乙醇提取物对不同供试菌的抑菌圈直径实施例2：本发明水溶性蜂胶的制备该实施例的实施步骤如下：(1)在蜂胶原料中按重量体积比1:8加入体积比60％的乙醇水溶液(g/ml)，超声波提取，过滤，除去不溶物，残渣反复提取三次，合并滤液得蜂胶提取液r1。(2)在r1中按与蜂胶质量比1：0.5加入聚氧乙烯醚氢化蓖麻油，搅拌使其完全溶解，然后旋转蒸发回收乙醇至液体无醇味得r2。(3)将r2置于热水中温浴，按与蜂胶质量比1：2加入丙二醇，充分搅拌使蜂胶完全溶解。滤液冷却至室温、静置，过滤，即得蜂胶水溶液m。(4)将m干燥蒸出水份即得水溶性蜂胶流浸膏。采用本申请说明书描述的方法对本实施例制备的水溶性蜂胶进行了下述性能测试：1、总黄酮含量(1)芦丁标准曲线的绘制精密吸取芦丁对照品使用溶液(0.2g/l)1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分别置于50ml容量瓶中。加无水乙醇至总体积为15ml，依次加人硝酸铝溶液(100g/l)1ml，醋酸钾溶液(9.8g/l)1ml，摇匀，加水至刻度，摇匀。静置1h。用1cm比色杯于415nm处，以30％乙醇溶液为空白，测定吸光度。以50ml中芦丁质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或按直线回归方程计算。线性工作范围0mg-1.2mg(50ml)。(2)空白试验精密称待测水溶性蜂胶样品1.0g，置于50ml容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15ml，加水稀释至刻度，摇匀。(3)测定总黄酮含量精密称待测水溶性蜂胶样品1.0g，置于50ml容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15ml，依次加人硝酸铝溶液(100g/l)1ml，醋酸钾溶液(9.8g/l)1ml，摇匀，加水至刻度，摇匀。静置1h。以空白试液(2.2.2.3.3.2)作参比，用1cm比色杯，在波长415nm处测定试料溶液的吸光度。查标准曲线或通过回归方程计算，求出水溶性蜂胶中的黄酮类化合物含量。表3总黄酮含量、抑菌能力及dpph自由基清除活性2、抗氧化能力dpph自由基清除活性测定将本发明水溶性蜂胶样品用无水乙醇稀释一系列的浓度梯度，蜂胶样品：20～200μg/ml。取上述稀释液100μl加入100μl新配置的0.1mg/mldpph工作液，同时以不加dpph(以100μl无水乙醇代替dpph)的供试品溶液各浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设dpph阴性对照(以100μl无水乙醇代替供试品)，每组设2个平行复孔。室温避光反应30min后，在517nm处测定吸光度，使其读数在0.2～0.8之间。dpph清除率(％)＝(a0-as)/a0*100％as：加入样品提取液的dpph溶液的吸光度；a0：加入无水乙醇的dpph溶液的吸光度。3、抑菌能力配制牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖培养基，进行金黄色葡萄球菌、变形链球菌、白色念珠菌的活化及纯化，制备菌悬液和滤纸片。采用抑菌圈法测定本发明水溶性蜂胶对金黄色葡萄球菌、变形链球菌、白色念珠菌的抑菌圈大小，重复3次实验，进行显著性分析。表4蜂胶乙醇提取物对不同供试菌的抑菌圈直径mm实施例3：本发明水溶性蜂胶的制备该实施例的实施步骤如下：(1)在蜂胶原料中按重量体积比1:5加入体积比75％的乙醇水溶液(g/ml)，超声波提取，过滤，除去不溶物，残渣反复提取三次，合并滤液得蜂胶提取液r1。(2)在r1中按与蜂胶质量比1：1.5加入聚氧乙烯醚氢化蓖麻油，搅拌使其完全溶解，然后旋转蒸发回收乙醇至液体无醇味得r2。(3)将r2置于热水中温浴，按与蜂胶质量比1：5加入丙二醇，充分搅拌使蜂胶完全溶解。滤液冷却至室温、静置，过滤，即得蜂胶水溶液m。(4)将m干燥蒸出水份即得水溶性蜂胶流浸膏。采用本申请说明书描述的方法对本实施例制备的水溶性蜂胶进行了下述性能测试：1、总黄酮含量(1)芦丁标准曲线的绘制精密吸取芦丁对照品使用溶液(0.2g/l)1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分别置于50ml容量瓶中。加无水乙醇至总体积为15ml，依次加人硝酸铝溶液(100g/l)1ml，醋酸钾溶液(9.8g/l)1ml，摇匀，加水至刻度，摇匀。静置1h。用1cm比色杯于415nm处，以30％乙醇溶液为空白，测定吸光度。以50ml中芦丁质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或按直线回归方程计算。线性工作范围0mg-1.2mg(50ml)。(2)空白试验精密称待测水溶性蜂胶样品1.0g，置于50ml容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15ml，加水稀释至刻度，摇匀。(3)测定总黄酮含量精密称待测水溶性蜂胶样品1.0g，置于50ml容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15ml，依次加人硝酸铝溶液(100g/l)1ml，醋酸钾溶液(9.8g/l)1ml，摇匀，加水至刻度，摇匀。静置1h。以空白试液(2.2.2.3.3.2)作参比，用1cm比色杯，在波长415nm处测定试料溶液的吸光度。查标准曲线或通过回归方程计算，求出水溶性蜂胶中的黄酮类化合物含量。2、抗氧化能力dpph自由基清除活性测定将本发明水溶性蜂胶样品用无水乙醇稀释一系列的浓度梯度，蜂胶样品：20～200μg/ml。取上述稀释液100μl加入100μl新配置的0.1mg/mldpph工作液，同时以不加dpph(以100μl无水乙醇代替dpph)的供试品溶液各浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设dpph阴性对照(以100μl无水乙醇代替供试品)，每组设2个平行复孔。室温避光反应30min后，在517nm处测定吸光度，使其读数在0.2～0.8之间。dpph清除率(％)＝(a0-as)/a0*100％as：加入样品提取液的dpph溶液的吸光度；a0：加入无水乙醇的dpph溶液的吸光度。表5总黄酮含量、抑菌能力及dpph自由基清除活性3、抑菌能力配制牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖培养基，进行金黄色葡萄球菌、变形链球菌、白色念珠菌的活化及纯化，制备菌悬液和滤纸片。采用抑菌圈法测定本发明水溶性蜂胶对金黄色葡萄球菌、变形链球菌、白色念珠菌的抑菌圈大小，重复3次实验，进行显著性分析。表6蜂胶乙醇提取物对不同供试菌的抑菌圈直径实施例4：本发明水溶性蜂胶在皮肤清洁剂中的应用所述的皮肤清洁剂含有1.0重量份蜂胶提取物、2.0重量份胶原蛋白、1.0重量份果胶、0.1重量份透明质酸、3重量份吡咯烷酮羧酸钠、0.3重量份月桂酰胺丙基甜菜碱与0.5重量份椰子油起泡剂以及补充至总量为100重量份的蒸馏水。采用本申请说明书描述的方法对本实施例制备的皮肤清洁剂进行了下述性能测试：a、贮存稳定性：采用如下方法进行高低温稳定性实验：(1)在温度40℃-50℃电热恒温培养箱中放置30-50天，恢复室温后观察；(2)24小时之内，在温度0℃-50℃之间反复频繁变化，如此反复处理15-30天，恢复室温后观察；(3)在温度-5℃及40℃下循环存放3次，分别每次存放24h，即在-5℃存放24h后，在室温下存放24h，再放入40℃恒温箱中存放24h，依次循环3次，观察其稳定性；(4)在-5℃下存放1周，观察其稳定性。这些实验结果表明，所得产品在各实验条件下均未出现沉淀、断层、析水、粗粒、褪色等现象，产品稳定性好。b、卫生性能：微生物学指标包括菌落总数、霉菌和酵母菌总数、粪大肠菌群、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，其测定结果列于表7中。表7微生物检测结果检验项目检验结果限值菌落总数(cfu/g)＜10≤500霉菌和酵母菌总数(cfu/g)＜10≤100粪大肠菌群/g未检出不得检出金黄色葡萄球菌/g未检出不得检出铜绿假单胞菌/g未检出不得检出c、卫生化学指标采用常规分析方法对所得产品的汞、砷、铅含量进行了测定，其测定结果列于表8中。表8卫生化学检验结果检验项目单位检验结果方法检出浓度限值汞mg/kg未检出0.3≤1砷mg/kg未检出1≤10铅mg/kg未检出2≤10d、毒理学试验根据《化妆品卫生规范》(2007年版)标准进行多次皮肤刺激性试验，其试验结果列于表9中。表9受试物对家兔多次皮肤刺激性试验结果检测结论：受试物对家兔多次皮肤刺激检验结果为无刺激性，未见其他毒性。实施例5：本发明水溶性蜂胶在创伤修复中的应用所述的创伤修复材料含有5.0重量份蜂胶提取物、4.0重量份明胶、6.0重量份壳聚糖、3.0重量份羧甲基纤维素钠与余量为至100重量份的蒸馏水。该实施例制备得到的创伤修复材料性能评价如下：a按照本说明书描述的方法测试了体外凝血指数，其结果列于表10中。表10凝血指数测试结果敷料种类bci纱布90.42明胶海绵50.62实验组41.30从表10可以看出，本发明蜂胶敷料的凝血效果明显优于明胶海绵组。b按照本说明书描述的方法测试了抑菌作用，其结果列于表11中。表11抑菌活性测试结果表11结果表明，本发明敷料对两种菌均有抑菌作用,且随着与细菌作用时间的延长，抑菌率呈增长趋势。处理20min时对金黄色葡萄球菌的抑菌率已达到52.4％,而对铜绿假单胞菌的抑菌率为37.3％，至80min时抑菌率分别达到89.3％和79.6％。当前第1页12