本发明涉及微生物技术领域，进一步涉及阴道微生物与精细胞间生理作用的研究，具体涉及一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法。
背景技术：
阴道微生态失衡造成的女性生殖道感染是妇科常见病。据统计因感染性疾病就诊占门诊患者一半以上，排在前3位的是阴道炎、宫颈炎和盆腔炎，仅细菌性阴道病每年的发病人数就数百万，重者可引起慢性宫颈炎、宫颈癌及卵巢、输卵管肿瘤等疾病，同时也是造成不孕、早产、胎膜早破、低体重儿早产、复发性流产、绒毛膜羊膜炎等的主要原因，严重影响患者的身体健康与生活质量，并且临床数据显示患有阴道炎症时不孕率会上升，而研究证明适量补充阴道益生菌对炎症有缓解作用，同时也有希望在不孕症中得到应用
正常状态下，女性阴道内可分离出几十种微生物，包括:乳杆菌、棒状杆菌、双歧杆菌、类杆菌、梭形杆菌、非溶血性链球菌、肠球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、加德纳菌、消化链球菌，以及原虫、病毒、支原体和白假丝酵母菌等，其中乳杆菌是阴道正常菌群中的优势菌，其分离率达50％～80％。这些菌群与宿主、环境之间构成了相互制约、相互协调、动态平衡的阴道微生态系统
阴道微生态系统是人体四大生态系统中较为复杂的系统，它在人类的繁衍和疾病防御机制方面起着重要作用。有研究表明，由于部分阴道微生物对精细胞具有直接的生理影响，因此阴道菌群的失衡可能影响精子与卵细胞结合，从而直接导致不孕的发生。在这种情况下，有必要明确不同阴道微生物与精细胞间的生理作用，在此基础上通过阴道微生物的调节来促进精细胞在阴道内的活力。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，以解决精细胞在常规阴道环境中运动能力受影响的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是常规的阴道环境易产生菌群紊乱现象，从而导致妇科疾病的发生。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，包括以下步骤：
1)从阴道分泌物中分离微生物，培养得到若干单菌落；
2)对所述若干单菌落中的微生物进行菌种鉴定，得到若干菌株；
3)取所述若干菌株，分别与精细胞在液体环境中共孵育，在显微镜观察下以各菌株与精细胞的粘附能力为依据筛选出目标菌株；
4)培养所述目标菌株，制备冻干粉菌剂。
作为优选，步骤1)中用于分离微生物的培养基包括lb基础培养基，mrs固体培养基，bhi固体培养基，含有5％(g/g)脱脂乳的bhi培养基，bsm固体培养基。
作为优选，步骤1)中所述从阴道分泌物中分离微生物，具体包括以下操作：取阴道分泌物加入至1.5ml无菌的ep管中，用无菌pbs缓冲液按照101～106进行倍比稀释，分别以50μl的量涂布于固体培养基中，培养48h。
作为优选，所述阴道分泌物是保存于-80℃环境下且处于甘油环境中的。
作为优选，所述固体培养基包括lb基础培养基，mrs固体培养基，bhi固体培养基，含有5％(g/g)脱脂乳的bhi培养基，bsm固体培养基；其中涂布于mrs固体培养基、lb基础培养基、bsm固体培养基中的样品经过102～104倍稀释；涂布于bhi固体培养基和含有5％(g/g)脱脂乳的bhi培养基中的样品经过103～105倍稀释。
作为优选，所述菌种鉴定包括：分别提取若干单菌落中微生物的dna，经pcr扩增后测序，确定菌种类别。
作为优选，步骤3)具体包括以下操作：
a)取所述若干菌株，分别接种于其所对应的液体培养基中，在co2培养箱中于37℃条件下培养至od值为0.6；
b)将步骤a)所得的若干培养液每种取200μl，各与2ml精液、2ml含有hela细胞的细胞培养液在15ml离心管中混合，在co2培养箱中于37℃条件下培养1～1.5h；
c)固液分离取沉淀，用pbs缓冲液清洗后加入甲醇固定，革兰氏染色，油镜观察各实验组微生物对精细胞的粘附能力，据此筛选出目标菌株。
作为优选，步骤c)中所述的固液分离是以1000rpm的转速离心；用pbs缓冲液清洗的次数为5次。
作为优选，所述目标菌株包括卷曲乳杆菌，詹氏乳杆菌，格氏乳杆菌，阴道乳杆菌，约氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌或发酵乳杆菌。
作为优选，所述冻干粉菌剂中含有细菌分泌产物或者细菌破碎后的碎片。
在以上技术方案中，所述其所对应的液体培养基，是指分离得到该菌株的单菌落所处的固体培养基的液体形式；所述液体形式通常是该固体培养基不添加琼脂或明胶等物质时的状态。也就是说，该菌株是自哪一单菌落分离得到的，就将那一单菌落所处的固体培养基的液体形式作为该菌株的接种场所。
本发明通过实验手段研究了阴道微生物与精细胞间的生理作用，发现某些阴道微生物可特异性与精子结合，进而导致精子泳动速度下降甚至不动，还可刺激精子产生蛋白水平的变化进而影响其与卵子的结合能力。基于以上有益的发现，本发明确定了通过干预阴道菌群来增进精子活力的技术路线，将与精子结合能力强且不影响精子基本生理性状的微生物挑选出来，利用其占位作用隔绝对精子有害微生物的粘附，从而提升精子活力，进而对不孕症起到缓解或治疗作用。
本发明所提供的微生物菌剂可原位与精子结合，在保证精子运动能力的基础上抵抗外源微生物干扰，有助于增加受孕几率。此外，其中的益生微生物有助于治疗各种由阴道菌群紊乱造成的疾病，治疗效果显著，复发几率低，具有良好的推广前景。
附图说明
图1是本发明实施例1中阴道微生物与精细胞的粘附状态镜检图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，包括以下步骤：
a、菌群的培养分离
(1)培养基的配制：lb基础培养基、mrs固体培养基、bhi固体培养基、bhi+5％脱脂乳培养基、bsm固体培养基；
(2)从-80度冰箱中取出用甘油保存的阴道分泌物样品，待其融化后，取适量于无菌1.5ml的ep管中，用无菌pbs按照101—106进行倍比稀释，mrs、lb、bsm按102、104稀释bhi、bhi+5％脱脂乳按103、105的稀释液50μl涂布于固体培养基中，厌氧和需氧条件下培养48h。
b、菌株的鉴定：
(1)于无菌超净工作台中根据平板中菌落的形态、大小、颜色、边缘整齐与否、隆起与否，挑出单菌落接种于相应的液体培养基中；
(2)革兰染色观察菌体形态，初步判断革兰阳性菌与格兰阴性菌；
(3)基因组dna的提取，pcr扩增纯化后送样测序，确定菌种。
c、菌株的筛选：
(1)将上述确定了菌种的株菌株接种于相应的液体培养基中，37℃下在co2培养箱中(厌氧菌装满并封口)培养，使其od值等于0.6后终止培养；
(2)取200μl上述细菌培养液，分别加入有2ml含有少量hela的细胞培养液和2ml精子细胞的15ml离心管中，37℃细胞培养箱培养；
(3)经过l～1.5小时培养，1000转/min，用pbs缓冲液反复清洗5次，甲醇固定，革兰氏染色，油镜观察；
(4)筛选出，精子具有良好粘附能力的菌株。
d、微生态制剂的复配：
(1)将从阴道中筛选出的益生菌进行复配，做成冻干粉制剂；
(2)与精细胞共孵育后，进行基因组dna的提取，后送样测序，确定哪些菌株与精细胞有良好的粘附能力。
e、动物实验的进一步验证：
(1)大鼠促进排卵模型的建立，将动情周期正常的雌性大鼠12只随机分为正常组和补肾超促排卵组，每日上午9:00取阴道分泌物做图片行细胞脱落学检查，确定大鼠的动情周期；
(2)正常组和补肾超促排卵组动情后期，每天腹腔注射gnrha1.8μg/200g，连续9天，第九天同时注射hmg70iu/200g，48小时后注射hcg180iu/200g，正常组给予等体积0.9％生理盐水腹腔注射，注射hcg组晚十点以雌雄鼠2:1合笼，补肾超促排组自注射gnrha后用补肾调经方1ml(200g·d)正常组给予同等剂量生理盐水连续灌胃11天
(3)体外精子弱化的方法，用不同ph值(ph6～ph8)培养液培养大鼠精液2小时，利用计算机辅助精子活力分析仪(casa)测定大鼠精子活力参数(精子能动性、平均路径速度、平均直线运动速度、平均曲线运动速度)，确定使精子弱化的ph值；
(4)实验分组观察，用不同阴道微生物菌株共孵育弱化了的精细胞1小时，与正常组和补肾超促排卵组人工受精，孕后受孕10天后处死，观察胚胎着床情况，计录各组着床胚胎数。
实施例2
一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，包括以下步骤：
1)从阴道分泌物中分离微生物，培养得到若干单菌落；
2)对所述若干单菌落中的微生物进行菌种鉴定，得到若干菌株；
3)取所述若干菌株，分别与精细胞在液体环境中共孵育，在显微镜观察下以各菌株与精细胞的粘附能力为依据筛选出目标菌株；
4)培养所述目标菌株，制备冻干粉菌剂。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中用于分离微生物的培养基包括lb基础培养基，mrs固体培养基，bhi固体培养基，含有5％(g/g)脱脂乳的bhi培养基，bsm固体培养基。
步骤1)中所述从阴道分泌物中分离微生物，具体包括以下操作：取阴道分泌物加入至1.5ml无菌的ep管中，用无菌pbs缓冲液按照101～106进行倍比稀释，分别以50μl的量涂布于固体培养基中，培养48h。
所述阴道分泌物是保存于-80℃环境下且处于甘油环境中的。
所述固体培养基包括lb基础培养基，mrs固体培养基，bhi固体培养基，含有5％(g/g)脱脂乳的bhi培养基，bsm固体培养基；其中涂布于mrs固体培养基、lb基础培养基、bsm固体培养基中的样品经过102～104倍稀释；涂布于bhi固体培养基和含有5％(g/g)脱脂乳的bhi培养基中的样品经过103～105倍稀释。
所述菌种鉴定包括：分别提取若干单菌落中微生物的dna，经pcr扩增后测序，确定菌种类别。
步骤3)具体包括以下操作：
a)取所述若干菌株，分别接种于其所对应的液体培养基中，在co2培养箱中于37℃条件下培养至od值为0.6；
b)将步骤a)所得的若干培养液每种取200μl，各与2ml精液、2ml含有hela细胞的细胞培养液在15ml离心管中混合，在co2培养箱中于37℃条件下培养1h；
c)固液分离取沉淀，用pbs缓冲液清洗后加入甲醇固定，革兰氏染色，油镜观察各实验组微生物对精细胞的粘附能力，据此筛选出目标菌株。
步骤c)中所述的固液分离是以1000rpm的转速离心；用pbs缓冲液清洗的次数为5次。
所述目标菌株包括卷曲乳杆菌，詹氏乳杆菌，格氏乳杆菌，阴道乳杆菌，约氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌或发酵乳杆菌。
所述冻干粉菌剂中含有细菌分泌产物或者细菌破碎后的碎片。
实施例3
一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，包括以下步骤：
1)从阴道分泌物中分离微生物，培养得到若干单菌落；
2)对所述若干单菌落中的微生物进行菌种鉴定，得到若干菌株；
3)取所述若干菌株，分别与精细胞在液体环境中共孵育，在显微镜观察下以各菌株与精细胞的粘附能力为依据筛选出目标菌株；
4)培养所述目标菌株，制备冻干粉菌剂。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中用于分离微生物的培养基包括lb基础培养基，mrs固体培养基，bhi固体培养基，含有5％(g/g)脱脂乳的bhi培养基，bsm固体培养基。
步骤1)中所述从阴道分泌物中分离微生物，具体包括以下操作：取阴道分泌物加入至1.5ml无菌的ep管中，用无菌pbs缓冲液按照101～106进行倍比稀释，分别以50μl的量涂布于固体培养基中，培养48h。
所述菌种鉴定包括：分别提取若干单菌落中微生物的dna，经pcr扩增后测序，确定菌种类别。
步骤3)具体包括以下操作：
a)取所述若干菌株，分别接种于其所对应的液体培养基中，在co2培养箱中于37℃条件下培养至od值为0.6；
b)将步骤a)所得的若干培养液每种取200μl，各与2ml精液、2ml含有hela细胞的细胞培养液在15ml离心管中混合，在co2培养箱中于37℃条件下培养1.5h；
c)固液分离取沉淀，用pbs缓冲液清洗后加入甲醇固定，革兰氏染色，油镜观察各实验组微生物对精细胞的粘附能力，据此筛选出目标菌株。
所述目标菌株包括卷曲乳杆菌，詹氏乳杆菌，格氏乳杆菌，阴道乳杆菌，约氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌或发酵乳杆菌。
实施例4
一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，包括以下步骤：
1)从阴道分泌物中分离微生物，培养得到若干单菌落；
2)对所述若干单菌落中的微生物进行菌种鉴定，得到若干菌株；
3)取所述若干菌株，分别与精细胞在液体环境中共孵育，在显微镜观察下以各菌株与精细胞的粘附能力为依据筛选出目标菌株；
4)培养所述目标菌株，制备冻干粉菌剂。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。