利用石墨烯量子点进行肿瘤检测的方法与流程

本发明涉及一种利用石墨烯量子点进行肿瘤检测的方法，特别是一种基于基于肿瘤内间质流体压力响应的利用石墨烯量子点进行肿瘤检查的方法。

背景技术：

近年来，在生物学及医学领域，许多研究者致力于研究高性能、具有生物响应特性的材料来响应并放大肿瘤区域病变信号，从而区分肿瘤组织和正常组织。这在肿瘤诊断和治疗方面正引起科学界广泛关注，但仍存在极大的挑战。

相异于正常组织，肿瘤内微环境存在着特异性信号：肿瘤组织血管生长异常，结构错杂、肿瘤组织内间质流体压力(ifp)较高、缺氧环境、酸性ph环境、存在癌细胞特异性生物标记物等。利用这一系列特性，可区分正常组织及肿瘤组织。目前，文献曾报道，利用癌细胞特异性标记物如egfr，her2/neu等，设计荧光染料抗体进行标记检测，但这类标记物及其表达水平与具体肿瘤种类有密切关系，无法广泛应用于大范围普遍的肿瘤检测。也有研究利用肿瘤微环境中血管形成异常及酸性环境，设计具有ph响应的材料进行肿瘤检测，但材料制备非常复杂。利用肿瘤组织特异性信号检测肿瘤灵敏度高、实用性强，但目前肿瘤类型的局限性、缺少新型材料的制备、背景干扰等方面还存在许多问题需要解决。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有流体压力响应以及肿瘤细胞核靶向的石墨烯量子点生物荧光探针进行肿瘤检测的新方法｡

为达到上述目的,克服这些问题，我们利用肿瘤内ifp效应来检测区分肿瘤及正常组织，因肿瘤内ifp较高，是实体瘤内普遍存在的性质，适用性广泛，可用于普遍的肿瘤检测。根据这一特性，我们设计合成了一种具有ifp响应的石墨烯量子点(gqds)，制备方法详见专利：(磺酸基石墨烯量子点生物荧光探针及其应用)（201510394852.8）。在正常组织，正常压力下无法穿透细胞；而在肿瘤组织内，ifp较高时，具有ifp响应的gqds容易透过细胞膜，靶向标记肿瘤细胞核。经我们验证，在多种肿瘤组织内皆有此现象，并且这种材料具有低毒、量子产率高、高荧光强度的优点，并且可高效快速靶向肿瘤细胞核(0.5h)，非常适用于对肿瘤细胞的检测。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种利用石墨烯量子点进行肿瘤检测的方法，其特征在于具有以下的过程和步骤：建立动物肿瘤模型，每隔一天将石墨烯量子点gqds按(30～200mg/kg静脉注射入动物模型，0.5h后，检测肿瘤内压力，并切片观察gqds在肿瘤组织内分布，在2-7mmhg肿瘤内压条件下，gqds无法靶向肿瘤组织，无法标记细胞核；>11mmhg，gqds可以特异靶向肿瘤组织，并高效标记肿瘤组织细胞核。

肿瘤压力响应，药物降压后，无法标记肿瘤细胞核

当用药物降低肿瘤组织内ifp后，gqds在肿瘤组织内分布无肿瘤靶向，并且不能标记细胞核，说明此量子点靶向肿瘤组织细胞核的性能与ifp有密切联系，具有良好的肿瘤ifp响应性能，可以应用于肿瘤组织细胞核标记诊断检测。降低内压的具体方法如下：烟酰酸和伊马替尼溶于生理盐水中，烟酰酸通过腹腔注射(500mg/kg,0.01ml/g，注射后1h检测)；伊马替尼通过灌胃注射(50mg/kg,每日给药，四天后检测)。利用“针芯”技术来检测肿瘤内ifp值。将标准23号注射针填充尼龙线和生理盐水(其中添加50ie/ml肝素)，将其插入肿瘤组织中心，注射器连接至压力传感器。此装置可以连续而稳定地检测流体压力。检测过程中，通过压缩和解压缩方式确定针头与传感器之间流体的连通性。肿瘤ifp值取两次读数平均值，肌肉或皮下组织内ifp值作为空白，此方法处理后，肿瘤ifp值下降40%以上。

利用压力响应的gqds(30-200mg/kg)静脉注射进入动物模型，0.5h后，gqds特异靶向肿瘤组织，并高效标记肿瘤组织细胞核，我们利用两种可降低肿瘤组织内ifp的药物烟酰酸以及伊马替尼，使肿瘤组织内ifp分别降低了60%以及40%后(相比于空白)，也发现gqds无法靶向小鼠肿瘤组织，无法标记细胞核。gqds在小鼠肿瘤组织内分布比较分散，在组织间质内分散。印证了此量子点靶向肿瘤组织细胞核的性能与肿瘤ifp敏感性。

体内，体外均无毒，并且可以快速，完全代谢

gqds体内体外毒性均很低，静脉注射0.5h后，立即特异靶向肿瘤组织，并高效标记肿瘤组织细胞核，24h后大部分从体内代谢出来，在体内低毒。gqds大量聚集在肿瘤组织细胞内，只有少量存在于正常组织间质内，并不进入正常组织细胞核。

本发明方法的优点和特点如下所述:

(1)石墨烯量子点对肿瘤细胞核特异性靶向。进行标记识别的方法简单，低毒，高荧光强度，不需要对材料进行二次修饰｡

(2)石墨烯量子点对肿瘤细胞核靶向特性具有良好的肿瘤ifp响应效应｡

(3)在体内可以直接标记肿瘤细胞的细胞核，靶向效率高，应用范围广。

附图说明

图1石墨烯量子点(gqds)体内高效靶向肿瘤组织细胞核的压力敏感响应。其中a:ifp随皮下肿瘤体积增长的变化趋势。b:不同ifp条件下，gqds在肿瘤组织内分布变化。绿色：gqds；红色：syto-17红色细胞核染料。标尺：10µm。

图2经过烟酰酸改变肿瘤ifp后，gqds在小鼠乳腺癌组织内分布情况变化。a：经过烟酰酸降压药物处理后，小鼠乳腺癌组织内间质流体压力(ifp)变化情况。b,c：ifp改变后，60mg/kggqds在体内肿瘤组织内分布情况变化。b：空白，c：烟酰酸药物处理。绿色：gqds；红色：syto-17红色细胞核染料。标尺：10µm。

图3经过伊马替尼改变肿瘤ifp后，gqds在小鼠乳腺癌组织内分布情况变化。a：经过伊马替尼降压药物处理后，小鼠乳腺癌组织内ifp变化情况。b,c：ifp改变后，60mg/kggqds在体内肿瘤组织内分布情况变化。b：空白，c：伊马替尼药物处理。绿色：gqds；红色：syto-17红色细胞核染料。标尺：10µm。

图4gqds在体内体外毒性情况。a：小鼠乳腺癌细胞与不同浓度gqds共孵育12和24h后细胞活力检测。b：gqds体内分布情况。60mg/kggqds静脉注射入动物模型，0.5-24h后，在脏器内分布情况。c：gqds体内血生化毒性检测。60mg/kggqds静脉注射进入动物模型，0.5，24和96小时，检测血生化指标。肾功能指标：血尿素氮(bun)和肌酐(crea)；肝指标：丙氨酸氨基转移酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、碱性磷酸酶(alp)、总胆红素(tbil)。

具体实施方式

现将本发明的具体实施例叙述于后｡

实施例1:

gqds对肿瘤内压力响应能力：

压力响应gqds对肿瘤特异性靶向能力的实验，通过皮下移植法，在小鼠右后肢接种乳腺癌肿瘤，建立动物肿瘤模型。每隔一天将gqds(30-200mg/kg)静脉注射入动物模型，0.5h后，检测肿瘤内压力，并切片观察gqds在肿瘤组织内分布。利用“针芯”技术来检测肿瘤内ifp值。将标准23号注射针填充尼龙线和生理盐水(其中添加50ie/ml肝素)，将其插入肿瘤组织中心，注射器连接至压力传感器。此装置可以连续而稳定地检测流体压力。检测过程中，通过压缩和解压缩方式确定针头与传感器之间流体的连通性。肿瘤ifp值取两次读数平均值，肌肉或皮下组织内ifp值作为空白。为研究低ifp是否会阻碍gqds对肿瘤细胞核靶向性，60mg/kggqds注射入动物模型0.5h后，将肿瘤组织取出后，组织样品制成20µm厚的冷冻切片样品，用于进行激光共聚焦显微镜观察gqds在肿瘤组织内分布情况。发现ifp小于等于7mmhg肿瘤内压条件下，gqds在肿瘤组织内分布比较分散，在组织间质内分散，无法靶向肿瘤组织，无法标记细胞核。当ifp大于等于11mmhg时，gqds可以特异靶向肿瘤组织，并高效标记肿瘤组织细胞核。说明此量子点靶向肿瘤组织细胞核的性能与肿瘤ifp有密切联系，具有良好的肿瘤ifp响应性能，可以应用于肿瘤组织诊断检测。具体结果参见图1。

实施例2:

gqds肿瘤压力响应敏感，药物降压后，无法标记肿瘤细胞核：

烟酰酸溶于生理盐水中，烟酰酸通过腹腔注射(500mg/kg,0.01ml/g，注射后1h检测)；此方法处理后，ifp下降了60%。伊马替尼溶于生理盐水中，伊马替尼通过灌胃注射(50mg/kg,每日给药，四天后检测)。利用上述“针芯”技术来检测肿瘤内ifp值。肿瘤ifp值取两次读数平均值，肌肉或皮下组织内ifp值作为空白，此方法处理中肿瘤ifp值下降了40%。随后60mg/kggqds注射入动物模型0.5h后，将肿瘤组织取出，制成20µm厚的冷冻切片样品，用于进行激光共聚焦显微镜观察gqds在肿瘤组织内分布情况，发现gqds在未处理的肿瘤组织内，ifp大于11mmhg,gqds可以特异性靶向肿瘤细胞核｡而通过烟酰酸和伊马替尼处理后的小鼠肿瘤组织内，ifp小于7mmhg，无细胞核靶向性能。说明此量子点靶向肿瘤组织细胞核的性能与肿瘤ifp有密切联系。具体结果参见图2，3。

实施例3:

gqds体内，体外均无毒，并且可以快速，完全代谢：

在压力敏感响应肿瘤细胞核体内靶向标记的过程中，gqds均不产生毒性，能够快速代谢出细胞和组织。尾静脉注射0.5h后，体内立即特异靶向肿瘤组织，并高效标记肿瘤组织细胞核，24h后大部分从体内代谢出来，在体内低毒。gqds大量聚集在肿瘤组织细胞内，只有少量存在于正常组织间质内，并不进入正常组织细胞核。此方法无肿瘤特异性，具有普适性和应用性。