竹节参总皂苷在制备治疗肿瘤恶病质的药物上的应用的制作方法

本发明提供一种竹节参总皂苷在制备治疗肿瘤恶病质的药物上的应用。属于生物医药领域。

背景技术：

恶病质是一种复杂的代谢综合征，涉及到全身多个脏器和系统，常继发于肿瘤、心力衰竭、急性肾衰竭、慢性阻塞性肺病等疾病。恶病质的主要临床表征为短期内体重急剧下降、骨骼肌和脂肪的流失，同时伴有厌食、乏力、贫血、衰竭等症状。统计显示，高达一半的癌症患者死亡时伴有恶病质发生，且20%的患者直接死于恶病质。恶病质不仅会影响手术、化疗和放疗的实施，同时会造成患者严重的营养不良，降低患者的生活质量。研究表明，恶病质的发生机制与代谢异常、促炎细胞因子、全身慢性炎症反应、氧化应激和神经肽等诸多因素有关。其中，肿瘤发生发展过程中，免疫细胞和肿瘤细胞分泌的促炎细胞因子增多，机体慢性炎症反应，在肿瘤恶病质的发生机制中起着十分重要的作用。

竹节参（panacisjaponicirhizoma）系五加科人参属植物竹节参（panaxjaponicusc.a.mey.）的干燥呈竹鞭状根茎，是我国西南地区土家族、苗族民间常用中草药。研究表明，竹节参具有抗衰老、镇痛与免疫调节等药理活性，其主要活性组分为竹节参总皂苷。近期研究发现，竹节参总皂苷具有良好的抗炎活性，有效改善弗氏完全佐剂诱导的佐剂大鼠关节炎，显著抑制lps诱导的raw264.7细胞上清液中tnf-α和il-1β的含量升高，下调nf-κb蛋白的表达。

技术实现要素：

针对上述背景技术，本发明提供一种竹节参在肿瘤恶病质的治疗上的药物，发现竹节参总皂苷通过抑制nf-κb介导的炎性反应在制备治疗肿瘤恶病质的药物上的应用。为进一步开发肿瘤恶病质的治疗药物提供实验基础。

材料与方法

实验材料

spf级balb/c小鼠40只，雄性，6-8周龄，体重20-22g，购自湖北省实验动物研究中心（动物质量合格证许可证号：scxk（鄂）2008-0005）；竹节参购于湖北恩施州竹节参种植基地，经三峡大学药学系曾建红教授鉴定确认；小鼠结肠癌细胞株ct26来自上海交通大学附属第六人民医院郭澄教授馈赠；蛋白预染marker、ripa裂解液、bca蛋白定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；流式微球试剂盒、tnf-α，il-1β抗体购自bd公司，nf-κbp65抗体购自cst；β-actin、murf1、pax7抗体购自abcam。

实验方法

小鼠结肠癌肿瘤恶病质模型的建立

按照文献报道成熟方法建立小鼠肿瘤恶病质模型，具体方法如下：balb/c小鼠32只，适应性喂养1周后，随机取24只小鼠前肢侧翼背部皮下注射0.2ml（约1×10⁶个）ct26细胞悬液，剩余的8只小鼠作为正常对照，接种4天后，扪及小结节。每天定时监测各组小鼠的摄食量、精神状态、毛发及体重。若荷瘤小鼠较对照小鼠出现活动减少、进食量下降，虚弱、精神不振等表现，即进入恶病质期。

药物干预与标本采集

接种4天后，将接种小鼠随机分为模型组、竹节参总皂苷低剂量组和高剂量组，每组8只。各组给药方式为：正常组：生理盐水，（0.1ml/10g，p.o.，q3d×9）；模型组：生理盐水，（0.1ml/10g，p.o.，q3d×9）；低剂量组：竹节参总皂苷，（20mg/kg，p.o.，q3d×9）；高剂量组：竹节参总皂苷，（60mg/kg，p.o.，q3d×9）。末次给药24h后，小鼠眼球采血，分离血清，于-80℃冻存，用于检测炎性因子。采血后颈椎脱臼处死小鼠，剥离皮下肿瘤称重，取脾脏、胫骨前肌、腓肠肌和附睾脂肪组织并称重，部分腓肠肌组织置于10%福尔马林溶液中固定，其余组织于-80℃冻存。

观察指标

（1）小鼠一般状态观察

每日定时观察小鼠毛发、精神状况以及体质量情况。

（2）腓肠肌纤维横切面积的检测

将经福尔马林溶液固定的腓肠肌组织采用常规方法包埋成石蜡块，以4μm厚度连续横切片，常规苏木素-伊红（he）染色后，光镜观察，采集图片。

（3）流式微球检测血清中tnf-ɑ与il-1β水平

微球法检测血清中炎性因子tnf-ɑ和il-1β的水平，按试剂盒说明书操作：cba分析试剂盒里的每一种捕获微球表面包被一种特异性抗体，检测试剂是pe标记的抗体混合物，其荧光强度与微球上捕获的细胞因子的量成正比。当捕获微球、检测抗体和待测样本共同孵育后，三者即形成双抗夹心复合物（捕获微球+分析物+检测抗体）。通过流式细胞仪分析捕获微球和微球上结合抗体的荧光强度，从而得到待测样本的数据。

（4）westernblot检测腓肠肌与胫骨前肌中nf-κbp65、pax7与murf1蛋白表达水平

提取各组小鼠腓肠肌总蛋白和核蛋白，bca法测定蛋白浓度。蛋白样品经10%sds-page分离后，电转移至pvdf膜上，加入5％脱脂牛奶，于37℃封闭1.5h，分别加入β-actin、nf-κbp65抗体、murf1抗体、pax7抗体，4℃孵育过夜。次日以tbst洗膜3次，再加入hrp标记的二抗，37℃避光孵育1h，tbst洗膜3次，ecl化学发光法显影。

统计学分析

应用spss17.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，以p<0.05认为差异有统计学意义。

附图说明

图1为各组小鼠去除肿瘤后体重（x±s，n=8），**，与正常组相比p＜0.01；#，与模型组相比p＜0.05。

图2为各组小鼠腓肠肌、胫骨前肌、附睾脂肪与脾脏质量图（x±s，n=8）；*，与正常组相比p＜0.05；***，与正常组相比p＜0.001；#，与模型组相比p＜0.05

图3为竹节参总皂苷对恶病质小鼠腓肠肌纤维横切面积的影响，其中，a为正常组；b为模型组；c为竹节参总皂苷组（20mg/kg）；d为竹节参总皂苷组（60mg/kg）

图4为竹节参总皂苷对恶病质小鼠血清中il-1β与tnf-α含量的影响；*，与正常组相比p＜0.05；#，与模型组相比p＜0.05。

图5为竹节参总皂苷对腓肠肌中nf-κb、pax7与murf1的蛋白表达的影响。

图6为竹节参总皂苷对胫骨前肌中nf-κb、pax7与murf1的蛋白表达的影响。

具体实施方式

小鼠一般情况及体重变化

荷瘤小鼠较正常组小鼠，食欲明显下降，活动减少，皮毛颜色暗淡，精神萎靡。竹节参总皂苷干预后，低剂量组与高剂量组小鼠体质量与自发性活动均增加，且高剂量组变化更为明显。去瘤后荷瘤小鼠体重较正常组明显下降，且模型组下降最为明显（p<0.01），低剂量组与高剂量组小鼠体重较模型组升高（p<0.05），见图1。

腓肠肌、胫骨前肌、附睾脂肪与脾脏质量

与正常组相比，恶病质模型组小鼠腓肠肌和胫骨前肌重量显著降低（p<0.05）。竹节参总皂苷干预后，与模型组相比，高剂量组肌肉重量明显增加（p<0.05）。模型组小鼠附睾脂肪重量与正常组相比明显减少（p<0.05），不同剂量竹节参总皂苷干预后附睾脂肪重量无明显变化。恶病质小鼠脾脏重量均显著增大（p<0.001），竹节参干预后，脾脏的肿大情况无显著改善，见图2。

腓肠肌纤维横切面积

与正常组相比，恶病质小鼠腓肠肌纤维变细，肌肉束横切面积显著减小。竹节参总皂苷干预后，显著改善恶病质导致的肌肉降解，且呈剂量依赖性，见图3。

血清中il-1β与tnf-α含量

与正常组相比，肿瘤恶病质小鼠血清中il-1β与tnf-α的含量均显著上升（p<0.05），竹节参总皂苷干预可显著改善恶病质导致的机体炎性反应，见图4。

腓肠肌与胫骨前肌中nf-κb、pax7与murf1的蛋白表达

与正常组相比，模型组nf-κb与murf1的表达水平显著上升，而pax7在腓肠肌中有所下降。竹节参总皂苷干预后，nf-κb与murf1的含量下降明显，但pax7表达变化不明显，见图5、图6。