一种复合骨水泥及其制备方法与流程

本发明涉及生物医学工程中骨损伤修复和组织工程技术领域，具体是一种复合骨水泥及其制备方法。

背景技术：

聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,pmma)骨水泥是目前临床手术中普遍使用的一种骨粘合剂填充材料，在临床经皮椎体成形术(percutaneousvertebroplasty,pvp)中已有几十年的使用历史。虽然其安全性和有效性在临床上已被广泛认可，但是它存在的两个关键问题已经引起了临床医生和科研人员的关注：

1、过高的弹性模量。人体的正常椎体松质骨的压缩模量为50～800mpa，而目前临床上广泛使用的pmma骨水泥的压缩模量为1000～4000mpa，远高于人体椎体松质骨，pmma骨水泥与人体原生骨界面显著的力学性能差异易导致相邻椎体节段再骨折。

2、生物学活性不足。pmma是一种生物惰性材料，在体内几乎不能被降解吸收，其占据的空间不仅阻碍了新骨的形成和长入，同时它与原生骨界面也无法形成更好的组织融合，骨水泥与骨组织之间极易发生微动，微动产生的细屑会刺激机体产生免疫反应，导致植入部位局部发生骨溶解，进而造成植入物的松动、甚至脱落。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种复合骨水泥及其制备方法，该复合骨水泥在保持骨水泥强度的同时具有适宜的压缩模量，并且该复合骨水泥具有较大的孔隙尺寸，可调节的机械性能，应用于骨损伤修复后，有利于细胞和组织长入，同时sis具有的成骨传导性和成骨诱导性能够加速骨损伤处的修复。本发明复合骨水泥是传统pmma骨水泥的理想替代材料。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种复合骨水泥，该复合骨水泥由固相和液相组成，其中，所述的固相包括sis颗粒和pmma骨水泥粉；所述的液相的质量百分比组成为：甲基丙烯酸甲酯单体96.0～99.8％，n,n-二甲基对甲苯胺0.6～1.5％，对苯二酚0.035～0.01％，以上组分的质量百分比总和为100％；该复合骨水泥的组成中，将所述的sis颗粒的质量记为a克，将所述的pmma骨水泥粉的质量记为b克，将所述的液相的体积记为v微升，a、b、v满足：

0.05≤a/b≤0.4

小肠黏膜下层(smallintestinalsubmucosa,sis)是目前研究最多的天然细胞外基质材料，已经通过美国fda批准，被广泛用来构建人造膀胱、人造尿道、人造食道、人造血管和人造皮肤等软组织。目前使用的sis多为完全脱细胞化的猪小肠黏膜下层，植入人体的sis几乎没有免疫排斥性。sis90％的成分为胶原，与人体骨的有机成分非常类似。sis具有一个三维的多孔结构，以胶原为骨架的三维结构可以提供细胞生长、增殖和迁移的支撑环境，它同时还含有fgf-2和vegf等可以促进血管生成的生长因子。sis稳定易于保存，单层厚度在0.1mm左右，在培养基上充分浸泡后厚度在0.155mm左右，养分可以充分进入适合细胞培养。可见，sis是潜在的非常优异的骨组织工程支架材料。

本发明创造性地将sis颗粒和pmma骨水泥粉作为固相与液相组合，构建得到复合骨水泥，在保持骨水泥强度的同时具有适宜的压缩模量，并且该复合骨水泥具有较大的孔隙尺寸，可调节的机械性能，应用于骨损伤修复后，有利于细胞和组织长入，同时sis具有的成骨传导性和成骨诱导性能够加速骨损伤处的修复。本发明复合骨水泥是传统pmma骨水泥的理想替代材料。

作为优选，所述的pmma骨水泥粉的质量百分比组成为：聚甲基丙烯酸甲酯60～85％，硫酸钡25～35％，过氧化苯甲酰2～3.5％，以上组分的质量百分比总和为100％。

作为优选，所述的sis颗粒的粒径小于100μm。

上述复合骨水泥的制备方法，包括以下步骤：

(1)sis片的提取：

从5～7月龄、体重90～120kg的猪身上获取新鲜猪小肠，将猪小肠置于清水中反复清洗5～10次，洗净后，将猪小肠纵向切开，再切成多段长度为8～12cm的小段，撕去浆膜和肌膜，然后将粘膜部分翻转过来，刮去粘膜层和粘膜肌层；

先用pbs溶液清洗sis5～10次，再用70％的酒精快速冲洗sis两次，然后将sis浸泡在pbs溶液中，在摇床上震荡两天，震荡期间每隔12h更换pbs溶液一次；震荡结束后，将sis浸泡在甲醇和氯仿以1:1的体积比混合而成的混合液中10～15h，然后，从混合液中取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除甲醇和氯仿；

在37℃下，将sis置于含0.05％胰蛋白酶的0.05％的edta溶液中，10～15h后取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除胰蛋白酶；之后将sis置于除垢剂中，该除垢剂为含0.5％的sds的0.9％的氯化钠溶液，在摇床上震荡3～6h，对sis进行深度除垢处理；再用pbs溶液反复清洗sis5～10次，去除除垢剂；将处理后的sis浸泡在pbs溶液中，再次置于摇床上震荡3～6h，进行深度清洗；

将sis浸泡在70％的酒精中20～50min，进行消毒灭菌，最后用pbs溶液清洗，再用冷冻干燥机干燥sis，得到干的sis片；

(2)sis颗粒的制备：将sis片剪碎，并用药物粉碎机粉碎，得到sis颗粒；

(3)固相的制备：将sis颗粒和pmma骨水泥粉混合得到固相，该固相中，将sis颗粒的质量记为a克，将pmma骨水泥粉的质量记为b克，a和b满足：

0.05≤a/b≤0.4

(4)液相的制备：将甲基丙烯酸甲酯单体、n,n-二甲基对甲苯胺和对苯二酚混合均匀，得到液相，该液相的质量百分比组成为：甲基丙烯酸甲酯单体96.0～99.8％，n,n-二甲基对甲苯胺0.6～1.5％，对苯二酚0.035～0.01％，以上组分的质量百分比总和为100％；

(5)复合骨水泥的成型：将制备得到的液相加至制备得到的固相中，将液相的体积记为v微升，v满足：

液相和固相混合后，搅拌3～5分钟，得到面团状骨水泥，其固化时间为10～20min。

作为优选，所述的pbs溶液的ph值为7～7.4，所述的摇床的转速为25～35rpm。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开的复合骨水泥，创造性地将sis颗粒和pmma骨水泥粉作为固相与液相组合，构建得到复合骨水泥，在保持骨水泥强度的同时具有适宜的压缩模量，并且该复合骨水泥具有较大的孔隙尺寸，可调节的机械性能，应用于骨损伤修复后，有利于细胞和组织长入，同时sis具有的成骨传导性和成骨诱导性能够加速骨损伤处的修复。本发明复合骨水泥是传统pmma骨水泥的理想替代材料。

附图说明

图1为不同放大倍数下的实施例一、实施例三、实施例五的复合骨水泥与传统pmma骨水泥的固化样品的表面扫描电镜图片对比；

图2为实施例一、实施例三、实施例五的复合骨水泥的固化样品的孔径尺寸分布图；

图3为传统pmma骨水泥以及实施例一～实施例五的复合骨水泥圆柱体样品的压缩模量测定结果；

图4为传统pmma骨水泥以及实施例一、实施例五的复合骨水泥促进alp表达效果对比；

图5为传统pmma骨水泥以及实施例一、实施例五的复合骨水泥促进矿物化沉积效果对比；

图6为传统pmma骨水泥和实施例一、实施例五的复合骨水泥修复脊柱缺损的x片；

图7为传统pmma骨水泥和实施例一、实施例五的复合骨水泥修复脊柱缺损后，骨-修复材料界面的he染色图；

图8为传统pmma骨水泥和实施例一、实施例五的复合骨水泥修复脊柱缺损后，缺损内部的he染色图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例一的复合骨水泥的制备方法，包括以下步骤：

(1)sis片的提取：

从6月龄、体重100kg的猪身上获取新鲜猪小肠，将猪小肠置于清水中反复清洗5～10次，洗净后，将猪小肠纵向切开，再切成多段长度为10cm的小段，撕去浆膜和肌膜，然后将粘膜部分翻转过来，刮去粘膜层和粘膜肌层；

先用pbs溶液清洗sis5～10次，再用70％的酒精快速冲洗sis两次，然后将sis浸泡在pbs溶液中，在摇床上以30rpm的转速震荡两天，震荡期间每隔12h更换pbs溶液一次；震荡结束后，将sis浸泡在甲醇和氯仿以1:1的体积比混合而成的混合液中12h，然后，从混合液中取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除甲醇和氯仿；

在37℃下，将sis置于含0.05％胰蛋白酶的0.05％的edta溶液中，12h后取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除胰蛋白酶；之后将sis置于除垢剂中，该除垢剂为含0.5％的sds的0.9％的氯化钠溶液，在摇床上以30rpm的转速震荡4h，对sis进行深度除垢处理；再用pbs溶液反复清洗sis5～10次，去除除垢剂；将处理后的sis浸泡在pbs溶液中，再次置于摇床上以30rpm的转速震荡4h，进行深度清洗；

将sis浸泡在70％的酒精中30min，进行消毒灭菌，最后用pbs溶液清洗，再用冷冻干燥机干燥sis，得到干的sis片；

(2)sis颗粒的制备：将sis片剪碎，并用药物粉碎机粉碎，得到粒径小于100μm的sis颗粒；

(3)固相的制备：将0.167克sis颗粒和0.833克pmma骨水泥粉混合得到固相；

(4)液相的制备：将甲基丙烯酸甲酯单体、n,n-二甲基对甲苯胺和对苯二酚混合均匀，得到液相，该液相的质量百分比组成为：甲基丙烯酸甲酯单体99.0925％，n,n-二甲基对甲苯胺0.9％，对苯二酚0.0075％，以上组分的质量百分比总和为100％；

(5)复合骨水泥的成型：将1000微升制备得到的液相加至制备得到的固相中，液相和固相混合后，搅拌3～5分钟，得到面团状骨水泥，其固化时间为10～20min。

实施例二的复合骨水泥的制备方法，包括以下步骤：

(1)sis片的提取：

从5月龄、体重90kg的猪身上获取新鲜猪小肠，将猪小肠置于清水中反复清洗5～10次，洗净后，将猪小肠纵向切开，再切成多段长度为8cm的小段，撕去浆膜和肌膜，然后将粘膜部分翻转过来，刮去粘膜层和粘膜肌层；

先用pbs溶液清洗sis5～10次，再用70％的酒精快速冲洗sis两次，然后将sis浸泡在pbs溶液中，在摇床上以30rpm的转速震荡两天，震荡期间每隔12h更换pbs溶液一次；震荡结束后，将sis浸泡在甲醇和氯仿以1:1的体积比混合而成的混合液中12h，然后，从混合液中取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除甲醇和氯仿；

在37℃下，将sis置于含0.05％胰蛋白酶的0.05％的edta溶液中，12h后取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除胰蛋白酶；之后将sis置于除垢剂中，该除垢剂为含0.5％的sds的0.9％的氯化钠溶液，在摇床上以30rpm的转速震荡3h，对sis进行深度除垢处理；再用pbs溶液反复清洗sis5～10次，去除除垢剂；将处理后的sis浸泡在pbs溶液中，再次置于摇床上以30rpm的转速震荡5h，进行深度清洗；

将sis浸泡在70％的酒精中25min，进行消毒灭菌，最后用pbs溶液清洗，再用冷冻干燥机干燥sis，得到干的sis片；

(2)sis颗粒的制备：将sis片剪碎，并用药物粉碎机粉碎，得到粒径小于100μm的sis颗粒；

(3)固相的制备：将0.048克sis颗粒和0.952克pmma骨水泥粉混合得到固相；

(4)液相的制备：将甲基丙烯酸甲酯单体、n,n-二甲基对甲苯胺和对苯二酚混合均匀，得到液相，该液相的质量百分比组成为：甲基丙烯酸甲酯单体98.79％，n,n-二甲基对甲苯胺1.2％，对苯二酚0.01％，以上组分的质量百分比总和为100％；

(5)复合骨水泥的成型：将632微升制备得到的液相加至制备得到的固相中，液相和固相混合后，搅拌3～5分钟，得到面团状骨水泥，其固化时间为10～20min。

实施例三的复合骨水泥的制备方法，包括以下步骤：

(1)sis片的提取：

从6月龄、体重105kg的猪身上获取新鲜猪小肠，将猪小肠置于清水中反复清洗5～10次，洗净后，将猪小肠纵向切开，再切成多段长度为12cm的小段，撕去浆膜和肌膜，然后将粘膜部分翻转过来，刮去粘膜层和粘膜肌层；

先用pbs溶液清洗sis5～10次，再用70％的酒精快速冲洗sis两次，然后将sis浸泡在pbs溶液中，在摇床上以30rpm的转速震荡两天，震荡期间每隔12h更换pbs溶液一次；震荡结束后，将sis浸泡在甲醇和氯仿以1:1的体积比混合而成的混合液中12h，然后，从混合液中取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除甲醇和氯仿；

在37℃下，将sis置于含0.05％胰蛋白酶的0.05％的edta溶液中，12h后取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除胰蛋白酶；之后将sis置于除垢剂中，该除垢剂为含0.5％的sds的0.9％的氯化钠溶液，在摇床上以30rpm的转速震荡5h，对sis进行深度除垢处理；再用pbs溶液反复清洗sis5～10次，去除除垢剂；将处理后的sis浸泡在pbs溶液中，再次置于摇床上以30rpm的转速震荡5h，进行深度清洗；

将sis浸泡在70％的酒精中40min，进行消毒灭菌，最后用pbs溶液清洗，再用冷冻干燥机干燥sis，得到干的sis片；

(2)sis颗粒的制备：将sis片剪碎，并用药物粉碎机粉碎，得到粒径小于100μm的sis颗粒；

(3)固相的制备：将0.091克sis颗粒和0.909克pmma骨水泥粉混合得到固相；

(4)液相的制备：将甲基丙烯酸甲酯单体、n,n-二甲基对甲苯胺和对苯二酚混合均匀，得到液相，该液相的质量百分比组成为：甲基丙烯酸甲酯单体99.1925％，n,n-二甲基对甲苯胺0.8％，对苯二酚0.0075％，以上组分的质量百分比总和为100％；

(5)复合骨水泥的成型：将778微升制备得到的液相加至制备得到的固相中，液相和固相混合后，搅拌3～5分钟，得到面团状骨水泥，其固化时间为10～20min。

实施例四的复合骨水泥的制备方法，包括以下步骤：

(1)sis片的提取：

从7月龄、体重120kg的猪身上获取新鲜猪小肠，将猪小肠置于清水中反复清洗5～10次，洗净后，将猪小肠纵向切开，再切成多段长度为10cm的小段，撕去浆膜和肌膜，然后将粘膜部分翻转过来，刮去粘膜层和粘膜肌层；

先用pbs溶液清洗sis5～10次，再用70％的酒精快速冲洗sis两次，然后将sis浸泡在pbs溶液中，在摇床上以30rpm的转速震荡两天，震荡期间每隔12h更换pbs溶液一次；震荡结束后，将sis浸泡在甲醇和氯仿以1:1的体积比混合而成的混合液中12h，然后，从混合液中取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除甲醇和氯仿；

在37℃下，将sis置于含0.05％胰蛋白酶的0.05％的edta溶液中，12h后取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除胰蛋白酶；之后将sis置于除垢剂中，该除垢剂为含0.5％的sds的0.9％的氯化钠溶液，在摇床上以30rpm的转速震荡6h，对sis进行深度除垢处理；再用pbs溶液反复清洗sis5～10次，去除除垢剂；将处理后的sis浸泡在pbs溶液中，再次置于摇床上以30rpm的转速震荡3h，进行深度清洗；

将sis浸泡在70％的酒精中30min，进行消毒灭菌，最后用pbs溶液清洗，再用冷冻干燥机干燥sis，得到干的sis片；

(2)sis颗粒的制备：将sis片剪碎，并用药物粉碎机粉碎，得到粒径小于100μm的sis颗粒；

(3)固相的制备：将0.13克sis颗粒和0.87克pmma骨水泥粉混合得到固相；

(4)液相的制备：将甲基丙烯酸甲酯单体、n,n-二甲基对甲苯胺和对苯二酚混合均匀，得到液相，该液相的质量百分比组成为：甲基丙烯酸甲酯单体98.545％，n,n-二甲基对甲苯胺1.45％，对苯二酚0.005％，以上组分的质量百分比总和为100％；

(5)复合骨水泥的成型：将941微升制备得到的液相加至制备得到的固相中，液相和固相混合后，搅拌3～5分钟，得到面团状骨水泥，其固化时间为10～20min。

实施例五的复合骨水泥的制备方法，包括以下步骤：

(1)sis片的提取：

从6月龄、体重100kg的猪身上获取新鲜猪小肠，将猪小肠置于清水中反复清洗5～10次，洗净后，将猪小肠纵向切开，再切成多段长度为10cm的小段，撕去浆膜和肌膜，然后将粘膜部分翻转过来，刮去粘膜层和粘膜肌层；

先用pbs溶液清洗sis5～10次，再用70％的酒精快速冲洗sis两次，然后将sis浸泡在pbs溶液中，在摇床上以30rpm的转速震荡两天，震荡期间每隔12h更换pbs溶液一次；震荡结束后，将sis浸泡在甲醇和氯仿以1:1的体积比混合而成的混合液中12h，然后，从混合液中取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除甲醇和氯仿；

在37℃下，将sis置于含0.05％胰蛋白酶的0.05％的edta溶液中，12h后取出sis，用pbs溶液清洗sis3～5次，去除胰蛋白酶；之后将sis置于除垢剂中，该除垢剂为含0.5％的sds的0.9％的氯化钠溶液，在摇床上以30rpm的转速震荡3.5h，对sis进行深度除垢处理；再用pbs溶液反复清洗sis5～10次，去除除垢剂；将处理后的sis浸泡在pbs溶液中，再次置于摇床上以30rpm的转速震荡3.5h，进行深度清洗；

将sis浸泡在70％的酒精中30min，进行消毒灭菌，最后用pbs溶液清洗，再用冷冻干燥机干燥sis，得到干的sis片；

(2)sis颗粒的制备：将sis片剪碎，并用药物粉碎机粉碎，得到粒径小于100μm的sis颗粒；

(3)固相的制备：将0.286克sis颗粒和0.714克pmma骨水泥粉混合得到固相；

(4)液相的制备：将甲基丙烯酸甲酯单体、n,n-二甲基对甲苯胺和对苯二酚混合均匀，得到液相，该液相的质量百分比组成为：甲基丙烯酸甲酯单体99.294％，n,n-二甲基对甲苯胺0.7％，对苯二酚0.006％，以上组分的质量百分比总和为100％；

(5)复合骨水泥的成型：将2167微升制备得到的液相加至制备得到的固相中，液相和固相混合后，搅拌3～5分钟，得到面团状骨水泥，其固化时间为10～20min。

上述实施例中所用pbs溶液的ph值均为7.4。

一、本发明复合骨水泥的体外评估：

1、复合骨水泥的表面形态及孔径分布

以传统pmma骨水泥(市售mendecspine骨水泥)作为对比，观察pmma骨水泥固化样品和实施例一～实施例五的复合骨水泥固化样品的表面形态。观察发现，复合骨水泥样品相较于传统pmma骨水泥样品的表面粗糙程度明显增加，孔径明显增多，同时孔径的尺寸也随着复合骨水泥固相中sis占比的增加而增大，而复合骨水泥的这种结构更有利于细胞的黏附和迁移。不同放大倍数下的实施例一、实施例三、实施例五的复合骨水泥与传统pmma骨水泥的固化样品的表面扫描电镜图片见图1。图2为实施例一、实施例三、实施例五的复合骨水泥的固化样品的孔径尺寸分布图。

2、复合骨水泥的机械性能

将传统pmma骨水泥以及实施例一～实施例五的复合骨水泥分别制成直径为5mm、高为7.5mm的圆柱体样品，测定压缩模量，结果见图3。从图3可见，随着sis颗粒与pmma骨水泥粉的质量比的增加，压缩模量不断降低，并且覆盖了人脊柱骨整体50～800mpa的压缩模量范围，因此，实际操作中，可根据所需替代修复骨的强度，选择合适sis占比的复合骨水泥，实现对机械性能的调节。

3、复合骨水泥的生物学活性

将传统pmma骨水泥以及实施例一、实施例五的复合骨水泥分别制成直径为5mm、高为1mm的圆柱体样品并固化，将各种固化后的骨水泥分别置于96孔板，收集汇合度为70～80％的小鼠骨髓间充质干细胞(bmscs)，调整细胞悬液浓度，取等量细胞悬液加至各种骨水泥上，每孔加入100μl细胞悬液，细胞密度为1×10⁵个细胞/孔，置入37℃的细胞培养箱培养。培养14天后，对各种骨水泥进行alp和alizarinreds染色，考察成骨分化过程中标志alp的表达水平和矿物化沉积水平，其促进alp表达效果对比如图4所示，促进矿物化沉积效果对比如图5所示。从图4和图5可见，与传统pmma骨水泥相比，复合骨水泥能显著促进alp表达和矿物化结节形成，有效促进干细胞的成骨分化。

二、本发明复合骨水泥的体内评估：

取12周龄sd雄性大鼠(体重350g左右)，构建脊柱损伤模型，具体为：首先，在l2脊柱处用慢钻形成2×2×5mm的缺损，并填入面团状的传统pmma骨水泥和实施例一、实施例五的复合骨水泥；然后，用医用碘伏对大鼠内部消毒，用美容线进行外科间断性缝合(肌肉，外皮分别缝合)，术后一周内对大鼠肌肉注射青霉素，四周后处死大鼠，对缺损处组织进行影像学和组织学研究。

传统pmma骨水泥和实施例一、实施例五的复合骨水泥修复脊柱缺损的x片如图6所示，x片结果显示传统pmma骨水泥组缺损处信号强度远大于正常骨组织，pmma材料占位不降解。而复合骨水泥组缺损处信号强度与周围骨组织非常接近，可见复合后修复材料密度显著降低，同时提示新生骨长入。

传统pmma骨水泥和实施例一、实施例五的复合骨水泥修复脊柱缺损后，骨-修复材料界面的he染色图如图7所示。图7的组织学he切片显示复合骨水泥组中，材料与骨的界面发生融合，缺损内部大量小块新生骨形成；而传统pmma骨水泥组界面分界清晰，缺损无骨组织生长情况。

传统pmma骨水泥和实施例一、实施例五的复合骨水泥修复脊柱缺损后，缺损内部的he染色图如图8所示。从图8可见，复合骨水泥组中有大量新生骨组织出现(图中星号代表出现的新生骨组织)；而传统pmma骨水泥组基本无组织长入。