一种特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面构建方法与流程

本发明属于生物材料表面改性技术领域，具体涉及一种特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面构建方法。

背景技术：

血管内植入材料或器械在心血管疾病的治疗方面具有十分重要的关键作用，然而，材料或器械植入后，由于血液成分及内皮细胞功能改变导致的表面血栓形成及内皮功能紊乱常常导致植入失败。

基于材料与人体血液及内皮细胞之间界面生物反应的认识，在材料表面沉积无机涂层、制备高分子层或固定生物活性分子可以在一定程度上提高材料的血液相容性和赋予材料一定的内皮形成能力，但这些表面改性方法不能完全抑制血栓形成或促进内皮完全愈合。

研究表明，完整的天然的内皮细胞层，是调节凝血-抗凝平衡、内膜修复-增生平衡的关键。因而材料或植入器械表面快速覆盖内皮细胞层将显著降低血栓发生和平滑肌过度增殖的程度，进而显著提高材料或器械的植入成功率。

为了在材料表面形成天然的内皮细胞层，目前主要的方法有：在材料表面种植内皮细胞、材料表面接枝细胞外基质蛋白或内皮细胞生长因子促进细胞粘附和生长、表面固定能够促进内皮祖细胞的诱导分化的生物活性分子、表面固定特异性促内皮细胞生长分化的抗体等方法。这些方法虽然都可以显著促进内皮细胞的粘附和生长，但其抗凝血性能有限，并且细胞在材料表面无序生长，因此获得的内皮细胞层还不能完全实现正常内皮组织的功能。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的在于提供一种特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面构建方法，能显著提升材料的抗凝血性能，并能特异性地促进内皮细胞有序生长，从而构建特异性的促内皮细胞生长表面，在心血管内植入材料或器械方面获得应用。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面构建方法，包括如下步骤：

1)生物材料表面制备聚多巴胺层

将生物材料浸没到多巴胺溶液中，充分自聚合，清洗后干燥，重复三次，得到有聚多巴胺层的生物材料表面；

2)生物材料表面微接触印刷固定双氨基聚乙二醇

将双氨基聚乙二醇溶液滴加在条带状pdms印章表面，条带状pdms印章表面充分吸附双氨基聚乙二醇后，n2干燥，然后将pdms印章与步骤1)有聚多巴胺层的生物材料表面充分接触，清洗后干燥，得到氨基聚乙二醇改性的生物材料表面；

3)生物材料表面固定壳聚糖和肝素

将步骤2)得到的生物材料依次浸没到壳聚糖和肝素溶液中充分反应后，清洗干燥，得到表面固定了壳聚糖和肝素的生物材料表面；

4)生物材料表面固定redv

将步骤3)中的生物材料浸没到端基为n-琥珀酰亚胺的redv溶液中充分反应，清洗后干燥，得到表面含有redv的生物材料表面。

步骤1)中，多巴胺溶液的浓度为0.1～1mg/ml。

步骤1)中，多巴胺溶液ph为8.0-8.5。

步骤1)中，充分自聚合时间为12-24小时。

步骤2)中，条带的宽度及间隔为5～50μm，聚乙二醇溶液的浓度为0.1～1mg/ml。

步骤3)中，将步骤2)得到的生物材料首先浸没到壳聚糖溶液中充分反应4～12小时，清洗干燥后，再浸没到肝素溶液中充分吸附4～8小时。

步骤3)中，所述的壳聚糖和肝素溶液的浓度为1～10mg/ml。

步骤4)中，充分反应的时间为4～8小时，redv的浓度为0.1～1mg/ml。

有益效果：与现有技术相比，本发明的一种特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面构建方法，通过该方法对心血管植入材料进行表面改性，具备以下优势：

1)微接触印刷术可以将肝素及redv固定在材料表面特定区域，从而在材料表面形成特定图案的生物活性拓扑结构，有利于控制内皮细胞的粘附生长行为，实现内皮组织的完全愈合；

2)redv多肽分子可以特异性促进内皮细胞的粘附与生长，同时还可以抑制平滑肌细胞的生长；肝素分子具有优异的抗凝血性能，因此，用于血管内植入材料或器械表面改性时，可以同时赋予材料优异的促内皮细胞生长性能和抗凝血性能；

3)由于多巴胺聚合可以在所有固体材料表面进行自聚合形成牢固结合的涂层，并且形成的涂层具有较强的与含氨基物质反应的能力，因此，本发明所采用的方法几乎可以用于所有生物材料的表面改性，用于构建特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面。

附图说明

图1为在生物材料表面构建特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面的示意图；

图2为生物材料表面典型的内皮细胞粘附生长图；

图3为生物材料表面改性后典型的血小板粘附图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面构建方法。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

此外，应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

如图1所示，一种特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面构建方法，首先采用多巴胺自聚的方法在材料表面形成聚多巴胺层，然后采用微接触印刷术固定氨基聚乙二醇，进一步在材料表面固定壳聚糖和肝素，最后将具有特异性促内皮细胞生长的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(redv)多肽接枝在peg区域，获得特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面；具体包括如下步骤：

1)生物材料表面制备聚多巴胺层

将生物材料浸没到ph为8.0-8.5的多巴胺溶液中，充分自聚合12-24小时，清洗后干燥，重复三次，得到有聚多巴胺层的生物材料表面；

2)生物材料表面微接触印刷固定双氨基聚乙二醇

将双(3-氨基丙基)封端的聚乙二醇溶液滴加在条带状的微图形聚二甲基硅氧烷(pdms)印章表面，条带状的微图形聚二甲基硅氧烷印章表面充分吸附双氨基聚乙二醇后，n2干燥，然后将pdms印章与步骤1)有聚多巴胺层的生物材料表面充分接触2分钟，清洗后干燥，得到氨基聚乙二醇改性的生物材料表面；

3)生物材料表面固定壳聚糖和肝素

将步骤2)得到的生物材料依次浸没到壳聚糖和肝素溶液中充分反应后，清洗干燥，得到表面固定了壳聚糖和肝素的生物材料表面；

4)生物材料表面固定redv

将步骤3)中的生物材料浸没到端基为n-琥珀酰亚胺的redv溶液中充分反应，清洗后干燥，得到表面含有redv的生物材料表面。

步骤1)中，多巴胺溶液的浓度为0.1～1mg/ml。

步骤2)中，条带的宽度及间隔为5～50μm，聚乙二醇溶液的浓度为0.1～1mg/ml。

步骤3)中，将步骤2)得到的生物材料首先浸没到壳聚糖溶液中充分反应4～12小时，清洗干燥后，再浸没到肝素溶液中充分吸附4～8小时，清洗后干燥，其中，壳聚糖及肝素溶液的浓度为1～10mg/ml。

步骤4)中，充分反应的时间为4～8小时，redv的浓度为0.1～1mg/ml。

本发明设计的生物材料包括各种固体类的生物材料，只要能让多巴胺粘附即可，例如，钛合金材料、聚氨酯材料、二氧化钛薄膜。

实施例1-3中采用的生物材料为钛合金材料。

实施例1制备条带的宽度及间隔为5μm的生物材料

一种特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面构建方法，具体包括如下步骤：

1)生物材料表面制备聚多巴胺层

将生物材料浸没到ph为8.0的多巴胺溶液中，充分自聚合12小时，清洗后干燥，重复三次，多巴胺溶液的浓度为0.1mg/ml，得到有聚多巴胺层的生物材料表面；

2)生物材料表面微接触印刷固定双氨基聚乙二醇

将双(3-氨基丙基)封端的聚乙二醇溶液滴加在条带状的微图形聚二甲基硅氧烷(pdms)印章表面，条带状的微图形聚二甲基硅氧烷印章表面充分吸附双氨基聚乙二醇后，n2干燥，然后将pdms印章与步骤1)有聚多巴胺层的生物材料表面充分接触2分钟，清洗后干燥，得到氨基聚乙二醇改性的生物材料表面，其中，条带的宽度及间隔为5μm，聚乙二醇溶液的浓度为0.1mg/ml；

3)生物材料表面固定壳聚糖和肝素

将步骤2)得到的生物材料首先浸没到壳聚糖溶液中充分反应4小时，清洗干燥后，再浸没到肝素溶液中充分吸附4小时，得到表面固定了壳聚糖和肝素的生物材料表面，壳聚糖及肝素溶液的浓度为1mg/ml；

4)生物材料表面固定redv

将步骤3)中的生物材料浸没到端基为n-琥珀酰亚胺的redv溶液中充分反应4小时，清洗后干燥，得到表面含有redv的生物材料表面，其中，redv的浓度为0.1mg/ml。

实施例2制备条带的宽度及间隔为25μm的生物材料

一种特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面构建方法，具体包括如下步骤：

1)生物材料表面制备聚多巴胺层

将生物材料浸没到ph为8.5的多巴胺溶液中，充分自聚合24小时，清洗后干燥，重复三次，多巴胺溶液的浓度为1mg/ml，得到有聚多巴胺层的生物材料表面；

2)生物材料表面微接触印刷固定双氨基聚乙二醇

将双(3-氨基丙基)封端的聚乙二醇溶液滴加在条带状的微图形聚二甲基硅氧烷(pdms)印章表面，条带状的微图形聚二甲基硅氧烷印章表面充分吸附双氨基聚乙二醇后，n2干燥，然后将pdms印章与步骤1)有聚多巴胺层的生物材料表面充分接触2分钟，清洗后干燥，得到氨基聚乙二醇改性的生物材料表面，其中，条带的宽度及间隔为25μm，聚乙二醇溶液的浓度为1mg/ml；

3)生物材料表面固定壳聚糖和肝素

将步骤2)得到的生物材料首先浸没到壳聚糖溶液中充分反应12小时，清洗干燥后，再浸没到肝素溶液中充分吸附8小时，得到表面固定了壳聚糖和肝素的生物材料表面，壳聚糖及肝素溶液的浓度为10mg/ml；

4)生物材料表面固定redv

将步骤3)中的生物材料浸没到端基为n-琥珀酰亚胺的redv溶液中充分反应8小时，清洗后干燥，得到表面含有redv的生物材料表面，其中，redv的浓度为1mg/ml。

实施例3制备条带的宽度及间隔为50μm的生物材料

一种特异性促内皮细胞生长的抗凝血表面构建方法，具体包括如下步骤：

1)生物材料表面制备聚多巴胺层

将生物材料浸没到ph为8.5的多巴胺溶液中，充分自聚合20小时，清洗后干燥，重复三次，多巴胺溶液的浓度为0.5mg/ml，得到有聚多巴胺层的生物材料表面；

2)生物材料表面微接触印刷固定双氨基聚乙二醇

将双(3-氨基丙基)封端的聚乙二醇溶液滴加在条带状的微图形聚二甲基硅氧烷(pdms)印章表面，条带状的微图形聚二甲基硅氧烷印章表面充分吸附双氨基聚乙二醇后，n2干燥，然后将pdms印章与步骤1)有聚多巴胺层的生物材料表面充分接触2分钟，清洗后干燥，得到氨基聚乙二醇改性的生物材料表面，其中，条带的宽度及间隔为50μm，聚乙二醇溶液的浓度为0.5mg/ml；

3)生物材料表面固定壳聚糖和肝素

将步骤2)得到的生物材料首先浸没到壳聚糖溶液中充分反应8小时，清洗干燥后，再浸没到肝素溶液中充分吸附6小时，得到表面固定了壳聚糖和肝素的生物材料表面，壳聚糖及肝素溶液的浓度为5mg/ml；

4)生物材料表面固定redv

将步骤3)中的生物材料浸没到端基为n-琥珀酰亚胺的redv溶液中充分反应6小时，清洗后干燥，得到表面含有redv的生物材料表面，其中，redv的浓度为0.5mg/ml。

将实施例1-3得到的生物材料，在同等试验条件下，得到如图2所示的生物材料表面典型的内皮细胞粘附生长图，图2(a)中条带的宽度及间隔为5μm，图2(b)中条带的宽度及间隔为25μm，图2(c)中条带的宽度及间隔为50μm。细胞在5μm的图形上随机无规生长，当条带的宽度及间隔增加，细胞呈现出规整排列，表现出定向生长行为。

将实施例2-3得到的生物材料，在同等试验条件下，得到如图3所示的生物材料表面改性后典型的血小板粘附图，图3(a)为对照样品，图3(b)与图3(c)分别为条带的宽度及间隔为25μm及50μm的样品，可以看出，对照样品表面有大量的血小板粘附，而经过表面改性后，血小板粘附数量大大减少，表明血液相容性得到显著提高。