用于促进损伤的身体组织再生的包含活性物质的组合物的制作方法

本申请是申请日为2013年6月19日、申请人为比托普股份公司、发明名称为“用于促进损伤的身体组织再生的包含作为活性物质的四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶的组合物”的中国专利申请201380041224.0的分案申请。本发明涉及一种组合物，借助于所述组合物可促进损伤的身体组织的再生。
背景技术：
：身体组织可以不同方式受损。具体地讲，组织损伤可通过外部影响发生，由创伤性事件引起。这种性质的组织损伤一般来讲也被称为伤口，尤其涉及皮肤或粘膜时。除了外部影响引起的组织损伤外，也知道不可归因于创伤性事件的以溃疡形式的其它损伤。一般来说，受损的身体组织以自然方式的再生在损伤发生后就已马上开始了。在伤口已造成的情况下，血液凝固非常快地开始，使损伤的血管被血凝块闭合。在随后的渗出阶段，脓水流出，导致外物及细菌从伤口中排出。然后免疫系统攻击并杀死细菌。新结缔组织在随后的增生阶段期间生成以使伤口引起的缺损被填平。伤口最终在再生阶段因由创缘区域内存在的完整的上皮组织进展的上皮细胞的过度生长而闭合。而伤口尺寸不太大时，自然伤口愈合一般来说相对没有问题，并发症可在严重伤口的情况下发生，尤其是因分泌物的过量形成引起。同样适用于多种类型的溃疡。而且，慢性伤口如果是因永久压力(褥疮)引起的，或因糖尿病导致的迟缓伤口愈合，则被视为特别具有问题。罹患后者的患者甚至可能发展成所谓的糖尿病足综合症，其在德国导致全部截肢术中的三分之二。技术实现要素：因此，本发明的目的是提供一种能够辅助并促进损伤的身体组织的再生的药剂。如本发明所提出，此目的是通过用于促进损伤的身体组织的再生的包含作为活性剂的四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、甘油葡萄糖苷和/或这些化合物的盐、酯或酰胺的组合物实现。四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶是四氢嘧啶衍生物，其在应力条件下，在极端，尤其嗜盐微生物中合成。迄今，四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶的多种应用或用途记载有，例如作为保湿剂，用于治疗血管渗漏综合症(vls)(de102006056766a1)或用于治疗神经性皮炎(de10330243a1)。从公开号de10006578a1中，已知四氢嘧啶及其衍生物用于防止生物聚合物被降解酶(例如蛋白酶、核酸酶或脂肪酶)分解的用途。四氢嘧啶的学名是2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸以及羟基四氢嘧啶的学名是5-羟基-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸。天然l-四氢嘧啶((s)-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸)的结构如下所示：天然羟基四氢嘧啶((4s,5s)-5-羟基-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸)的结构如下所示：所示的立体异构体的使用是优选的但非强制性的，也就是说，也可使用其它立体异构体或外消旋体。甘油葡萄糖苷，或更具体的2-o-α-d-甘油葡萄糖苷，是一种(例如)由利用其用于渗透保护目的的性质的蓝细菌合成的天然物质。通过此方式，蓝细菌可在浓度高达1.5mnacl的盐水介质中生长。分子以高浓度积聚在细胞质中并以此方式使因高盐浓度在此环境中存在的现有渗透压力降低，因此防止细胞水损失。此处实例是蓝细菌集胞藻属pcc6803。并且，该分子也是由香灌木属的植物合成的。这些植物在湿-干环境中生长。密罗木是一种在非洲的南部地区所见的小型灌木，生长在高达60cm高的石板上。在那发生并持续几个月的旱期期间，植物存活下来，完全没有受到伤害并呈现干枯状态。但是，一旦再次下雨，植物就开始在几个小时内发芽，也被赋以代名词“还魂植物”。甘油葡萄糖苷作为保湿剂在化妆品及皮肤病学领域中的应用是已知的(de19540749a1)。并且，如公开号de102008039231a1中所述，也将甘油葡萄糖苷用于增强细胞保护酶的表达。2-o-α-d-甘油葡萄糖苷的结构如下：所用的甘油葡萄糖苷优选地是天然存在的2-o-α-d-甘油葡萄糖苷，其例如通过集胞藻属的蓝细菌积聚。但是，从葡萄糖与甘油分子的β-糖苷键或葡萄糖与甘油在1-位的连接也可预料到相当效果。除了使用天然存在的甘油葡萄糖苷，因此，也可想到使用d及l构型的1-o-α甘油葡萄糖苷、1-o-β甘油葡萄糖苷、及2-o-β甘油葡萄糖苷。单个分子(文中仅以d-构型显示)如下所示：在本发明范围内，其再生可被包含四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶或甘油葡萄糖苷的组合物促进的身体组织可具体地为皮肤或粘膜。损伤可具体地具有创伤性质。此意指，损伤是由外部影响引起的，例如，踢、切割、刺伤、咬伤等。这些以机械的方式造成的伤口可因意外引起或是外科手术造成的。粘膜的损害也可因粘膜炎引起，其治疗也应属于关于促进损伤的身体组织的再生的本发明范围内。粘膜炎可具有多种起因。因为粘膜细胞的再生速率高的事实，所以粘膜炎例如常作为化疗或放射治疗期间的癌症治疗的不良反应发生。而且，变弱的免疫系统当例如存在于免疫系统受损的患者中时逐渐导致感染，此随后可导致粘膜的炎症。尤其，口腔以及胃肠道的粘膜可受到影响。除了以机械的方式造成的伤口，也有其它性质的组织损伤，其也可利用本发明提出的组合物治疗。这包括，例如，由热、火、烫伤或冻伤造成的热伤口，烧伤创面，化学烧伤或由电离辐射超声的伤口。除了伤口以外，挫伤/擦伤也可借助于本发明组合物治疗。挫伤因所施加的机械力使器官或身体部位受损，而皮肤本身没有损伤。尤其当在此情况下，血液从损伤的毛细血管流出并进入周围组织，引起血肿。除了促进损伤的身体组织的再生以外，在此损伤是由外部影响引起的情况下，由本发明所提出的组合物也适于治疗溃疡。溃疡可因多种原因形成，例如，因循环障碍、肿瘤或感染引起的。可借助于根据本发明的组合物治疗的溃疡的实例为小腿溃疡(“患溃疡的腿”)、褥疮(压力性溃疡)、穿通病(足压力性溃疡)、下疳、软下疳、蚕蚀性溃疡、角膜溃疡、以及其它。该组合物具有用于治疗慢性损伤(具体地讲慢性伤口或慢性溃疡)的特殊意义。在此上下文中的一个实例是糖尿病足综合症(dfs)，通俗地称为糖尿病足。关于这一点，最初产生轻微的损伤，尤其指足或小腿，此一般将愈合而没有并发症，但由于不良的伤口愈合，糖尿病患者倾向于常常具有长期性。在其它因素中，糖尿病患者所患有的循环障碍损害了适宜的伤口愈合过程。糖尿病足综合症的特征是溃疡，其可深入地发展到身体的那部位，具有可发生微生物引起的感染的额外风险。因糖尿病足综合症而需每年进行的截肢术数目是相当大的，以使有需要和有必要提供有效的治疗可能性。另一个多发的组织损害被称为术语褥疮(褥疮性溃疡、压力性溃疡)。尤其，需要护理并卧病在床的人因压力永久地施加在身体的某个部位的事实而患有褥疮。在作用于血管的压力超出血管的毛细血管血压的情况下，则不足量的氧及营养物输送给细胞，最终导致组织损伤。而压力性溃疡一般不会在健康人中发生，因为他们有规律地自身改变位置，因此消除了作用于所危及的皮肤区域的压力，这些本能反应在依赖于护理的人中受限或仅以有限的程度存在。褥疮可具体地讲发生在骨头紧邻皮肤表面的皮肤区域。也存在开放性褥疮性溃疡允许微生物渗透的危险。鉴于需要护理的人数众多以及严重的后果，褥疮的发生导致这种适应症尤其需要有益的治疗选项。可施用本发明所提出的组合物的身体组织的其它损伤为痔疮损伤或肛裂，在大多数情况中，它们是因机械应力引起的。如所述，促进损伤的身体组织的再生迄今也是有利的，因为瘢痕的形成可以此方式消除。已发现，通过施用本发明组合物，伤口(尤其皮肤伤口)的愈合可得到改善，使得可避免因视觉原因而不合乎需要的瘢痕形成。具体地讲，应将本发明所提出的组合物施用到损伤的身体组织，此意指具体地讲应局部施用或外用。因此，该组合物可以软膏剂、霜剂、洗剂、乳液、液体、乳剂、微乳剂、喷雾剂、悬浮液、糊剂、粉剂或其它固体物质的形式提供。该组合物可包含常见辅助物质，例如载剂、防腐剂、杀菌剂、增溶剂、维生素、稳定剂、消泡物质、增稠剂、着色剂、表面活性剂、乳化剂、湿润物质或类似物。软膏剂、糊剂、霜剂、以及凝胶可包含常见载体物质，诸如，例如，动物及植物脂肪、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石以及氧化锌或这些物质的混合物/掺和物。虽然该组合物可包含其它活性剂，但是，具体地讲，使用仅包含作为活性物质的四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶和/或甘油葡萄糖苷或它们的盐、酯或酰胺的组合物也是可能的并足以促进以及利于身体组织再生。例如，四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、甘油葡萄糖苷或分别相关的衍生物可与选自下列的一种物质或多种物质组合：右泛醇或衍生物、蒙大拿山金车提取物(山金车)、辣椒素、辣椒提取物、贯叶金丝桃提取物(金丝桃(stjohn’swort))、倒地铃(气球株)、北美金缕梅提取物(金缕梅(witchhazel))、生育酚、尿囊素、红没药醇、可可提取物、银、纳米银、微米银、无定形银、银盐、锌、氧化锌、金盏花提取物(万寿菊)、蜂蜜及蜂蜜提取物、蜂胶、草木犀提取物、紫草科植物提取物(聚合草属)、蓝蓟提取物、莳萝、当归提取物、阿魏酸、透明质酸、芦荟提取物、母菊(洋甘菊)提取物、洋葱(葱头(onion))鳞茎提取物、蓍提取物(西洋蓍草)、胀果甘草提取物(欧亚甘草)、甘草查尔酮a、硅酮、尿素、松果菊(紫松果菊(purpleconeflower))提取物、菊苣酸。四氢嘧啶/羟基四氢嘧啶、甘油葡萄糖苷和/或各自的盐、酯或酰胺的浓度可具体地讲在0.01与50％w/w之间，尤其在0.5与20％w/w之间，以及特别地优选在1与10％w/w之间。附图说明图1表示多种物质对伤口愈合的影响-参照pbs。图2表示多种物质对伤口愈合的影响-参照pbs。具体实施方式实施例1：四氢嘧啶对体外伤口闭合的作用将hacat细胞(人皮肤细胞)在涂覆了胶原蛋白-i的24-孔平板上接种。利用完全培养基(10％fcs＝胎牛血清)，在24h内，细胞共同生长成单层。在此细胞层闭合后，利用平均0.68mm的定义直径的无菌尖端(0.363mm2)，对中心造成环状损伤。造成损伤时，将完全培养基变成只包含0.5％w/wfcs(胎牛血清)而非10％w/wfcs的饥饿培养基。然后，将以下测试溶液吸移到细胞上(每种溶液：n＝4)：0.5％fcs+pbs(磷酸盐缓冲盐水)，对照溶液0.5％fcs+1mm四氢嘧啶0.5％fcs+10mm四氢嘧啶0.5％fcs+100mm四氢嘧啶在48h的时间段内，使细胞与测试溶液一起孵育，期间借助于数码相机记录了伤口闭合。在每种情况下，在开始以及随后以24-h间隔拍照。测量或计算在每种情况下仍空白的区域并以mm2表示。可从下表中看到结果(sd：标准差，mw：平均值)：利用与1mm或10mm四氢嘧啶一起孵育的溶液，与所用的对照溶液相比，可确定对细胞层造成的环状损伤有显著更快的闭合趋势。只有当施用100mm的四氢嘧啶溶液时，才发现损伤组织的愈合迟缓。实施例2：当与四氢嘧啶/羟基四氢嘧啶一起孵育时的再上皮化利用处于无血清以及含血清的培养基中的0、0.1、0.5、1、2.5及5mm的四氢嘧啶/羟基四氢嘧啶的孵育24小时后，从arpe-19细胞(粘附的视网膜色素上皮细胞)的汇合细胞层中移除(划痕试验)定义的细胞区域。在预先标记的位置，通过显微镜确定所施用间隙的宽度。在每种情况中，24及48小时后，利用在各个位置再次确定的间隙宽度制得图像资料。针对每个浓度，进行6次测试。在头两天内，可观察到再上皮化的最高生长速率，发现利用四氢嘧啶/羟基四氢嘧啶处理的细胞培养物中的间隙宽度消失较快。利用羟基四氢嘧啶比利用四氢嘧啶的再上皮化稍微更有效。虽然血清一般来讲促进间隙的闭合，但尤其在无血清培养物中观察到可通过添加四氢嘧啶/羟基四氢嘧啶达到的阳性结果。未经四氢嘧啶处理的样品的24h后的间隙宽度的平均值被确定为100％。可检测到以下间隙宽度百分比：c(四氢嘧啶)/mm间隙宽度％01000.1100.6870.596.434191.6322.593.012588.418实施例3：根据猪离体皮肤穿刺，通过四氢嘧啶及甘油葡萄糖苷促进伤口愈合使用离体猪伤口愈合模型，因为其已在专利公开号de10317400b4中描述过。样品：从清洗并消毒的猪耳朵皱襞样品中，制成直径6mm的穿孔。从穿孔中心处，移除3mm区域内的表皮及上部真皮。在模型产生后，立刻将5μl测试物质引入伤口中，而将5μlpbs施加到对照模型中。48h(t48h)后，模型快速冷冻并在-80℃储存。各进行14个测试系列以使每个样品可得到8到11个可评价的模型。来自模型的切片的制备：将模型完全地埋入组织冷冻培养基(companyofleica,nussloch)中，并利用低温保持器，制备6μm薄切片。应注意注意力要一直集中在各个模型的中心处。将切片放在superfrost载玻片上，空气干燥，在-20℃冷丙酮中固定10min，并在-80℃保存。利用苏木精/伊红(各2片切片)对所有模型染色。染色方法的顺序如下：1)与苏木精一起孵育6分钟2)在自来水中简单冲洗3)在hcl醇中简单冲洗4)在流动的自来水中冲洗15分钟5)在蒸馏水中简单冲洗6)在伊红(0.2％)中孵育1分钟7)在自来水中简单冲洗8)在蒸馏水中孵育20秒9)在递升的醇系列(50％、50％、96％、2x100％)中每次孵育20秒10)在二甲苯中孵育20秒11)按照以下：干燥切片并利用eukitt固封利用leica光学显微镜dmls和olympuscamedia数码相机评价染色情况。统计评价(伤口愈合得分)：0:无伤口愈合过程1:小伤口舌2:大伤口舌3:闭合片4:多层闭合片在创缘都可评价的情况下，确定左与右创缘之间的平均值。利用学生配对t-检验进行统计评价。评价：1)完全伤口愈合进展(所有14个模型都可评价，也就是说，没有模型的伤口或大坑具有2个毛囊)，he：羟基四氢嘧啶；gg：甘油葡萄糖苷；mw：平均值；σ：标准差：mwσsemhei1.920.960.30he高渗2.080.720.23ggi2.120.810.31gg高渗1.660.930.30pbs高渗1.600.840.28pbs等渗1.840.810.26图1以条形图形式显示结果。将标准差表示成棒条上的破折号(pbs＝pbs等渗)。2)基于pbs对照的伤口愈合进展；做此评价以考虑利用pbs得到的值所确定的单个猪的伤口愈合潜能：图2以条形图形式显示结果。将标准差表示成棒条上的破折号(pbs＝pbs等渗)。发现羟基四氢嘧啶及甘油葡萄糖苷提供改善的伤口愈合潜能。当前第1页12