桐花树叶石油醚提取物及其制备和治疗结肠癌的应用的制作方法

本发明属于桐花树技术领域，尤其涉及一种桐花树叶石油醚提取物及其制备和治疗结肠癌的应用。

背景技术：

桐花树(aegicerascorniculatum)为紫金牛科蜡烛果属植物，是红树植物中分布很广的一种植物，生长于海边潮涨潮落的污泥滩上。目前研究显示其化学成分主要含有萜类、甾体、黄酮、多酚等，药理作用主要有细胞毒性，抗真菌、止泻、抗氧化等。由于植物化学成分的多样性与复杂性，即使是同一种植物，其不同药用部位的功效及其所含化学成分也会存在很大差异，如麻黄和麻黄根，麻黄主要含麻黄碱和伪麻黄碱，而麻黄根则主要为大环精胺类生物碱。而对于桐花树的研究，多见于桐花树茎、枝和皮，且多关注于其乙醇、水提部位，对桐花树叶石油醚部位抗癌的研究尚未见有报道。

随着发病率以及死亡率的上升，恶性肿瘤已成为中国城市和农村居民的第1位死亡原因。结肠癌属于大肠癌，是消化系统恶性肿瘤。在我国发病率及病死率较高。近年来，城市人口结肠癌发病率比10年前上升1/3，农村上升9％。早期诊断率只有11％～15％，80％以上患者确诊时已属中晚期，如能早期发现、治疗，术后5年生存率可达90％以上，而晚期结肠癌五年生存率低于20％。由于癌症多重复杂的病机，日益发达的医疗技术仍未能解决这一医学难题。目前治疗癌症主要采用手术、放疗、化疗以及三者联合治疗等方案，但其毒副作用较大，且易引起肿瘤变异及耐药性的产生。中医药在提高患者生存质量，减轻临床症状，延长生存期等方面显示出了一定的优势。近年来研究表明，传统中医药作为结肠癌手术及放化疗的辅助治疗手段，在提高患者生存质量，减轻临床症状，延长生存期等方面显示出了一定的优势。如扶正抗癌方与化疗药或免疫疗法联用都能起到协同增效的作用，不仅可以减轻毒副作用，降低复发与转移，还能增强癌细胞对放化疗的敏感性，提高结肠癌患者体力指数。因此，从中医药中寻求新型、安全有效的的治疗药物是目前治疗结肠癌的重要研究方向。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供一种桐花树叶石油醚提取物及其制备和治疗结肠癌的应用，以扩大桐花树的使用范围，为癌症治疗开辟新途径。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

桐花树叶石油醚提取物在制备治疗结肠癌药物方面的应用。

药物为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膏剂、合剂、混悬剂，该药物以桐花树叶石油醚部位为活性成分，加入常规辅料按照常规工艺制成。

结肠癌源于人结肠癌细胞ht-29、sw480、dld-1。

桐花树叶石油醚提取物的制备方法，将桐花树叶加入乙醇浸泡得到桐花树叶乙醇总提物，将乙醇总提物中乙醇挥发后，加入石油醚进行萃取获取上层石油醚部位提取物，再经水浴干燥，即得。

上述桐花树叶石油醚提取物的制备方法，按以下操作进行：将桐花树叶晒干打成粗粉，加入25倍量95％乙醇浸泡7天；通过减压浓缩得到桐花树叶乙醇总提物，将乙醇总提物加纯水溶解成混悬液，挥发至无乙醇味后，加入石油醚进行萃取，获取上层石油醚部位提取物，将上层石油醚部位提取物水浴干燥，即得桐花树叶石油醚提取物。

上述制备方法得到的桐花树叶石油醚提取物。

为充分开发桐花树资源，发明人建立了一种桐花树叶石油醚提取物的制备方法，将桐花树叶加入乙醇浸泡得到桐花树叶乙醇总提物，将乙醇总提物中乙醇挥发后，加入石油醚进行萃取获取上层石油醚部位提取物，再经水浴干燥，即得。体外分子生物学实验研究表明，桐花树叶石油醚提取物对人结肠癌ht-29、sw480、dld-1细胞具有增殖抑制作用，并可明显抑制人结肠癌细胞ht-29、sw480、dld-1的克隆形成。因此，桐花树叶石油醚提取物在制备治疗结肠癌药物方面具有潜在应用前景，可用于制备抗结肠癌药物。深入开发桐花树叶石油醚提取物可以扩大桐花树的使用范围，为癌症治疗开辟新途径。

附图说明

图1是本发明桐花树叶石油醚提取物对结肠癌细胞增殖抑制作用结果图。

图2是本发明桐花树叶石油醚提取物对结肠细胞活性影响的平板克隆形成实验结果图。

图3是本发明桐花树叶石油醚提取物对结肠细胞活性影响的结果柱状图。

具体实施方式

一、桐花树叶石油醚部位提取物(pacl)的制备

1.药材：桐花树叶采于广西防城港，经广西北部湾海洋研究中心许铭本鉴定为金牛科蜡烛果属植物桐花树的叶子。

2.提取与分离：将桐花树叶晒干打成粗粉(2500g)，加入25倍量(62.5l)95％乙醇浸泡7天；通过减压浓缩得到桐花树叶乙醇总提物，将乙醇总提物加纯水溶解成混悬液，加热挥发至无乙醇味后，加入石油醚进行萃取，获取上层石油醚部位提取物，将上层石油醚部位提取物水浴干燥，即得桐花树叶石油醚提取物。

二、桐花树叶石油醚部位提取物对多种癌细胞的增殖抑制作用研究

1.实验材料

细胞株——人结肠癌细胞ht-29，sw480，dld-1，由中国科学院细胞库提供。

药材——桐花树叶

主要试剂和耗材——

主要试剂——

细胞增殖检测试剂盒(mts)：美国promega公司；

结晶紫染色液：中国碧云天公司；

1640培养液：维森特公司

胎牛血清：美国gibco公司

氯仿、异丙醇、无水乙醇、水合氯醛等为国产分析纯试剂。

主要耗材——

25cm²细胞培养瓶：美国bd公司；

10cm细胞培养皿：美国bd公司；

96孔板：美国bd公司；

15毫升离心管、50毫升离心管：美国bd公司；

冻存管：美国bd公司；

移液管：美国corning公司；

枪头盒、ep管、pcr管：美国axygen公司；

主要仪器——

电动移液器、可调式移液器、低温高速离心机：德国eppendorf公司生产；

细胞培养孵箱、生物安全柜、液氮罐：美国thermo科学公司；

-80℃生物超低温冰箱：美国thermo科学公司；

超净工作台：苏州金净公司；

37℃细菌培养箱、烤箱：中国精宏公司；

倒置荧光显微镜：日本olympus公司；

掌上离心机：美国thermofisherscientific公司；

高压灭菌锅、-20℃生物冰箱、4℃生物冰箱：中国海尔公司；

碎冰制冰机：日本sanyo公司；

计算机：中国联想公司；

nanodrop2000分光光度计：美国thermoscientific公司；

电磁搅拌器、酶联免疫检测仪：美国thermoscientific公司。

2.实验方法

2.1细胞增殖实验(mts)

(1)取对数生长期细胞，加入dpbs清洗细胞，弃掉dpbs后加入0.25％胰酶进行消化，当细胞欲脱离瓶壁时加入含10％胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液枪吸取培养液将细胞从培养瓶壁上吹打下来，转移至15ml离心管中，放入离心机中离心，1000转/分钟，离心3分钟，弃去上清，加入完全培养基重悬、混匀，进行细胞计数，将细胞重悬后调整密度为2×10⁴个/ml，接种于96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，即每个孔2000个细胞，每组设置3个复孔，共设5个给药梯度组(37.5，50，75，100，150μg/ml)，以及培养液对照组、dmso对照组。置于37℃，5％co2恒温孵箱中进行常规培养。

(2)配置待测药物母液：用分析天平称取待测药物溶于dmso中配成100mg/ml的母液，设置超声仪水浴温度60℃，超声溶解，并用0.22μm尼龙过滤筛过滤后分装于ep管，保存于-20℃。

(3)细胞培养过夜后，每组细胞分别加入不同浓度梯度的桐花树叶石油醚部位提取物(37.5，50，75，100，150μg/ml)，对照组加入等体积的含对应浓度dmso的完全培养基，以及单独只含完全培养基的对照组。继续培养24、48、72h。

(4)分别在培养24、48、72h后，用排枪于每孔加入20μl完全融化后的celltiter96aqueousonesolutionreagent，然后将细胞放回培养箱中继续培养2h，于酶标仪上在490nm波光处处读取吸光度值。将无细胞仅含培养基的孔作为空白孔扣除由于药物颜色产生的误差。并用软件计算细胞生长抑制率，其公式为：

(5)以上实验重复3次，用spss21检验统计分析，与空白组相比，p＜0.01，差异有显著性；并用graphpadprism5作线性图，求出ic50。

2.2单细胞克隆形成实验

(1)将对数生长期的细胞常规消化，加入含10％胎牛血清的完全培养基终止，转移细胞到15ml离心管，置于离心机离心。弃掉上清液，加入新鲜完全培养基重悬细胞，吹打均匀，尽量使细胞充分分散，使分散度达到95％以上。进行细胞计数，调整细胞浓度为400个/ml，每孔接种1ml于6孔板中，培养过夜。

(2)第二天加入桐花树叶石油醚部位提取物进行处理，设两个药物浓度，分别为12.5，25μg/ml，另设一个空白组(完全培养液)。

(3)细胞经药物作用4天后，弃掉培养液，重新给予同样的药物。

(4)当有细胞团交合时，弃掉培养液，加dpbs缓冲液清洗两次，然后用4％的多聚甲醛固定15min。

(5)吸弃多聚甲醛，用结晶紫染色液染色35min。

(6)回收结晶紫，用dpbs缓冲液清洗细胞两次，弃掉dpbs缓冲液，待孔板晾干后，用扫描仪扫描六孔板。

(7)用spss21检验统计分析本实验重复三次的结果，与空白组相比，p＜0.01，差异有显著性，并用graphpadprism5作柱状图；

2.3统计学分析

应用spss统计软件处理分析数据，进行组间比较，*，p＜0.05，差异具有统计学意义，**，p＜0.01差异具有显著性统计学意义。

3.实验结果

3.1细胞增殖实验结果

桐花树叶石油醚部位提取物对人结肠癌细胞ht-29，sw480，dld-1的增殖具有抑制作用。其ic50如表1所示，细胞活性曲线如图1所示。

表1桐花树叶石油醚部位提取物作用于癌细胞的ic50(μg/ml)

3.2单细胞克隆形成实验结果

桐花树叶石油醚部位提取物可明显抑制人结肠癌细胞ht-29，sw480，dld-1的克隆形成，并与给药浓度呈浓度依赖性。ht-29细胞的对照组克隆形成率为86.50％，高、低浓度给药组克隆形成率分别为18.13％、81.25％；dld-1细胞的对照组克隆形成率为75.13％，高、低浓度给药组克隆形成率分别为2.50％、33.75％；sw480细胞的对照组克隆形成率为100％，高、低浓度给药组克隆形成率分别为13.75％、56.75％。细胞克隆形成数如图2和图3所示。