PEG‑MZF‑NPs/DDP复合物及其制备方法与流程

本发明属于医学及基因工程技术领域，具体涉及一种peg-mzf-nps/ddp复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

卵巢癌是女性生殖系统中最常见的肿瘤之一，恶性程度很高，死亡率占妇科肿瘤的首位。由于卵巢癌在早期症状往往不明显，不易早期发现，超过70％的患者就诊时已为中晚期，5年生存率仅为25％。目前对卵巢癌的早期诊断尚缺乏特异有效的方法或手段。卵巢癌的治疗目前主要以手术治疗后辅以化疗，但是常规化疗副作用较大，且手术后复发率和转移率较高。因此，探索卵巢癌新型高效的早期诊断手段和治疗方法意义重大。将多种手段有机结合对卵巢癌进行联合靶向诊疗已成为重要的研究方向。肿瘤热疗是通过热能杀死肿瘤细胞，不仅可以独立应用，还可以增强放化疗的敏感性。随着纳米技术的发展，将纳米技术应用于肿瘤的治疗也日益受到关注。若能以磁性纳米材料为载体，将化疗、热疗有机结合，互补协同，有可能形成一种新的肿瘤联合治疗方法。

磁性纳米颗粒作为纳米材料的一种，除了具有一般纳米载体的功能外，由于其具有特殊的磁学性质，可被应用于磁共振成像。磁性纳米材料在外加磁场的作用下产生和周围组织不同的磁场敏感性，使t1和t2磁共振成像的弛豫时间发生变化。磁性纳米颗粒在交变磁场的作用下能够产生热效应，热能不仅能增加化疗药物的功能，还可以对肿瘤细胞进行靶向热疗。其中金属氧化物颗粒fe3o4是应用较多的磁性纳米粒子。在纳米氧化铁结构中加入锰、锌等金属元素可以制备成各种铁氧体，其中mn0.6zn0.4fe2o4不仅具有载体、热疗的功能，还具有自动控温和恒温的特征。

化疗是临床上最常用的肿瘤治疗手段，但是绝大多数的化疗药物都会产生严重的毒副作用，而且化疗主要对增殖期细胞有效，单一化疗很难将肿瘤彻底治愈。顺铂(ddp)已成为临床最常用的化疗药物之一，可抑制癌细胞的dna复制，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌作用，尤其是在卵巢癌的治疗中显示了较好的疗效。但目前临床上所用的顺铂是静脉注射，静脉给药后，由于血浆ddp浓度很快升高并迅速弥散至周围组织，可使病人出现食欲减退、恶心、呕吐、腹泻等消化道症状和骨髓抑制、肾脏毒性、神经毒性、过敏反应等毒副作用。因此，改变化疗药物的给药方式及剂型具有重要的临床意义。对肿瘤进行靶向给药，不仅能有效杀死肿瘤细胞，而且能大大降低化疗药物的用药量，减轻其毒副作用。

基于单纯磁流体热疗、顺铂化疗在肿瘤治疗研究方面都显示了良好的效果，前景广泛，但作用仍显单一，在肿瘤联合治疗原则的指导下，本研究设想：以mn0.6zn0.4fe2o4纳米粒作为药物载体，利用其优良的磁响应性和有效升温控温的效果，将ddp化疗、磁流体热疗有机结合，优势互补，有可能形成一种联合靶向诊疗卵巢癌的新方法。

技术实现要素：

为了解决现有卵巢癌治疗中存在的问题，本发明提供一种以peg修饰的mn0.6zn0.4fe2o4纳米粒(peg-mzf-nps)为载体的携载ddp化疗药物的复合物及其制备方法，该复合物在外加磁场作用下，可以将ddp化疗与磁流体热疗有机结合，优势互补，对肿瘤进行靶向治疗，有效解决了现有技术的问题。

一种peg-mzf-nps/ddp复合物，是以peg-mzf-nps为载体，负载ddp；peg-mzf-nps与ddp质量比为40:1-80:1。

本发明还公开了所述peg-mzf-nps/ddp复合物的制备方法，包括以下步骤：取一定量的peg-mzf-nps磁流体与适量的ddp溶液混合，加入蒸馏水，超声分散15min，使其充分反应，过滤，滤液即为peg-mzf-nps/ddp复合物，将其置于4℃冰箱中避光保存备用。

进一步地，peg-mzf-nps与ddp质量比优选40:1-80:1，加入蒸馏水后peg-mzf-nps终浓度为60μg/ml。

本发明还公开了该复合物在制备治疗卵巢癌药物中的应用。

本发明用不同方法对卵巢癌ho8910细胞进行干预，实验分为四组,分别为：阴性对照组；ddp组；peg-mzf-nps/mfh组；peg-mzf-nps/ddp/mfh组；分别计算各组细胞增殖抑制率和凋亡率。结果显示peg-mzf-nps/ddp/mfh组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于其余三组。ddp化疗联合磁流体热疗能够明显抑制卵巢癌细胞的生长,并诱导其凋亡，效果明显优于其中任何单一治疗。

本发明采用的peg-mzf-nps(mn0.6zn0.4fe2o4)磁性纳米材料体外磁感应升温实验中，在外加235khz、4kw、35a的高频交变磁场条件下，不同浓度的peg-mzf-nps均能迅速升温，0～20min升温急剧，20min后升温平缓，并保持一定的恒温，说明该材料有良好的升温恒温能力。其中浓度为60μg/ml的peg-mzf-nps在20min内达到42℃～43℃，该温度为肿瘤热疗的理想温度。

本发明采用的peg-mzf-nps，具有良好的分散性、磁响应性和生物相容性；成功制备了peg-mzf-nps/ddp复合物，该复合物和peg-mzf-nps同样具有良好的磁热效应，可用于肿瘤的热化疗研究；体外磁共振扫描显示其具有作为磁共振t2弛豫造影剂的应用潜能，有可能实现靶向诊断与治疗一体化的目标。

经实验证实，在外加交变磁场作用下，peg-mzf-nps/ddp复合物对卵巢癌细胞有较好的增殖抑制作用和凋亡诱导作用，效果明显优于单一的磁流体热疗和ddp化疗。

附图说明

图1为peg-mzf-nps/ddp复合物的透射电镜图(tem)。

图2为peg-mzf-nps和peg-mzf-nps/ddp复合物的红外光谱图。

图3为peg-mzf-nps在交变磁场中升温曲线图。

图4为peg-mzf-nps/ddp复合物在交变磁场中升温曲线图。

图5peg-mzf-nps的体外mri成像。

图6不同浓度的peg-mzf-nps的t2横向弛豫时间r2。

图7peg-mzf-nps/ddp复合物的体外mri成像。

具体实施方式

为了理好地理解本发明，下面结合附图、具体材料对本发明进一步说明，不应理解为对本发明的具体限定。本发明中所采用的材料如下：

纳米材料：peg-mzf-nps购于南京东纳生物科技有限公司；

ddp(顺铂)购于江苏豪森药业集团有限公司。

实施例：

1.peg-mzf-nps/ddp复合物的制备及表征

1.1peg-mzf-nps/ddp复合物的制备

取一定量的peg-mzf-nps磁流体与适量的ddp溶液混合(peg-mzf-nps与ddp质量比40:1-80:1)，加入蒸馏水(peg-mzf-nps终浓度为60μg/ml)，超声分散15min，使其充分反应，过滤，滤液即为peg-mzf-nps/ddp复合物，将其置于4℃冰箱中避光保存备用。

1.2peg-mzf-nps/ddp复合物的稳定性检测

peg-mzf-nps/ddp复合物放在4℃冰箱储存，一周后管底可见少量褐色沉淀物，经超声分散1min后即可重悬，说明该复合物具有较好的悬浮稳定性。

1.3peg-mzf-nps/ddp复合物透射电镜观察

取少量peg-mzf-nps/ddp复合物，加无水乙醇超声分散15分钟，滴有膜铜网，自然晾干后，在透射电镜(tem)下观察其形貌。电镜图见图1，制备的peg-mzf-nps/ddp复合物平均粒径为10nm左右，大小较一致。

1.4peg-mzf-nps/ddp复合物的傅立叶红外光谱(ftir)分析

用傅立叶红外光谱(ftir)分析peg-mzf-nps和peg-mzf-nps/ddp特征峰的变化。红外光谱图见图2，在peg-mzf-nps/ddp复合物的红外光谱中，在530cm^-1附近出现了一个新峰，为顺铂的pt－n特征吸收峰，表明peg-mzf-nps已将ddp成功地包裹。

1.5peg-mzf-nps和peg-mzf-nps/ddp复合物在交变磁场中的升温实验

配制浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的peg-mzf-nps磁流体，分别取500μl置于平底试管中，将温度计直接插入试管中(避免接触到试管壁)，启动交变磁场，参数设置为235khz、4kw、35a，磁感应线圈直径为3cm，试管底部距磁感应线圈约0.5cm，每隔5min记录一次温度，以时间为横坐标，温度为纵坐标，绘制peg-mzf-nps磁性纳米材料的升温曲线。

取peg-mzf-nps/ddp复合物1ml加入平底试管中，交变磁场参数设置为：235khz、4kw，输出电流分别为15a、25a、35a、45a下进行升温实验，检测方法同peg-mzf-nps升温实验，以时间为横坐标，温度为纵坐标绘制该复合物升温曲线。

peg-mzf-nps和peg-mzf-nps/ddp复合物在交变磁场中的升温特性见图3、图4，二者均能升温至43℃，并保持稳定，可用于肿瘤的热疗。

1.6peg-mzf-nps和peg-mzf-nps/ddp复合物的体外磁共振成像(mri)研究

将浓度为0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml的peg-mzf-nps置于含1％琼脂糖的ependoff管中，对照组为加入去离子水的琼脂糖。另取peg-mzf-nps/ddp复合物100μl置于ependoff管中。采用7.0tmicro-mr扫描仪，内径3.0cm的体线圈，set2w1序列，参数设置如下：重复时间tr2500ms，回波时间te36ms，层厚1.0mm，fov4cmx3.5cm，矩阵256×256。读取各样本相应的t2值，之后在origin下作r2曲线(r2＝1/t2)，由此得出各浓度样品的r2弛豫率。

从磁共振成像(图5)上可以观察到，随着peg-mzf-nps浓度增加，其t2w1信号明显降低，测量出各浓度材料的t2值，由此得出peg-mzf-nps材料的弛豫率r2＝6.06(μg/ml^-1s^-1)，见图6，提示peg-mzf-nps具有作为磁共振t2弛豫造影剂的应用潜能。图7为peg-mzf-nps/ddp复合物的加权图像，其信号明显低于对照组，表明peg-mzf-nps与ddp结合后同样可以作为造影剂使用。

2.1peg-mzf-nps/ddp复合物对ho8910细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用

将ho8910细胞接种于含10％胎牛血清的imem培养液中，置于37℃、饱和湿度、5％co2的培养箱中培养，每2～3天传代一次，取对数生长期细胞实验。实验分组：a组为阴性对照组；b组为ddp组；c组为peg-mzf-nps/mfh组；d组为peg-mzf-nps/ddp/mfh组。b组加入ddp；c组加入peg-mzf-nps磁流体；d组加入peg-mzf-nps/ddp复合物；mfh组(c、d组)细胞放入spg-10a-ii高频磁感应加热仪平板线圈上加热1h，非mfh组(a、b组)室温放置1h，然后将各组细胞在培养箱中继续培养48h，mtt方法检测各组细胞增殖的抑制率，流式细胞仪分析细胞凋亡情况，结果如表1、表2。

表1peg-mzf-nps/ddp复合物磁感应加热对卵巢癌细胞ho8910增殖抑制作用

^ap＜0.001与阴性对照组对比；^bp＜0.001与ddp组对比；^cp＜0.001与peg-mzf-nps/mfh组对比；^等dp＜0.001与ddp/mfh组对比

表2peg-mzf-nps/ddp复合物磁感应加热对卵巢癌细胞ho8910的凋亡诱导作用

结果显示，peg-mzf-nps/ddp复合物磁感应加热组(peg-mzf-nps/ddp/mfh组)细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于其他各组，显示了ddp和磁热二者联合治疗的明显优势。