羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物在制备治疗糖尿病药物中的应用的制作方法

本发明涉及干细胞领域，具体而言，涉及羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
背景技术：
：糖尿病是一种常见的由内分泌系统代谢障碍引起的慢性终身疾病，长期患病可导致神经系统、心血管系统、泌尿系统等多种系统的慢性损害。随着我国经济的发展以及人民生活水平的提高，糖尿病患病率逐年增加，严重危害人们的健康，给家庭和社会带来沉重的经济负担。最新大样本流行病学调查显示，中国成人糖尿病患病率为11.6％，其中男性患病率为12.1％，女性患病率为11％，城市居民为14.3％，农村居民为10.3％；调查结果还显示糖尿病前期率为50.1％。目前主要是使用口服降糖药及胰岛素替代治疗，不能根治，且存在很多不足。人羊膜来源干细胞包括人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells，haec)、人羊膜间充质干细胞(humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hamsc)。人羊膜干细胞可在体内及体外向外胚层来源的神经细胞、神经胶质细胞，内胚层来源的胰腺细胞、肝脏细胞以及中胚层来源的心肌样细胞、肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞方向分化，并且具有无性集落形成能力和抗炎性。作为很多细胞的前体，羊膜干细胞又能抑制细胞免疫。不同的抗血管生成和抗炎症的蛋白都在羊膜干细胞中表达，这也解释了羊膜的抗血管生成和抗炎症的作用。这些性质使得羊膜干细胞已在很多治疗起到辅佐作用，而且大多数效果显著。人羊膜干细胞在具有类似胚胎干细胞性质的同时，因其无致瘤性、低免疫排斥性、含量丰富、容易获取、不引起伦理争议，极有潜力成为临床应用的干细胞来源之一。近年来，随着干细胞技术的发展，羊膜干细胞移植已经成为新的疾病治疗的发展方向。在临床应用上，羊膜干细胞在结膜损伤修复、重建眼表、防治睑球粘连与视网膜移植等眼科临床已开展了大量工作，而且在糖尿病难愈性皮肤溃疡、烧伤等创面修复愈合方面也有积极的疗效。而且，已经有实验证据证明羊膜干细胞能够分化在一定条件下能够分化为胰岛细胞。同时，也有学者报道了人羊膜间充质干细胞治疗糖尿病的病例，并取得了良好的效果。虽然现在在羊膜干细胞的应用研究上已经取得了一定的成果，但实际上，对于羊膜上皮细胞的功能开发和利用还不充分，更没有对羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物进行有效的研究开发和利用。因此，对羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物的开发和利用就成了目前亟待解决的技术问题。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物的应用，本发明羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物能够用于糖尿病的治疗中，并能够有效控制患者的糖尿病水平。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。本发明中，通过将所述羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合，并将所得到的混合物用于糖尿病的治疗中，从而能够有效控制患者的糖尿病水平，使得患者血糖恢复至正常水平。可选的，本发明中，所述应用还进一步包括从胎盘上分别分离得到羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞，然后将分离得到的羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞分别培养后混合，以制备羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物的步骤。可选的，本发明中，所述羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物中，羊膜上皮细胞与羊膜间充质干细胞的细胞数目比例为(1～100)：(1～100)，例如可以为，但不限于1:5,1:10,1:15,1:20,1:30，1:25，1:40，1:45,1:50,1:60,1:70,1:80,1:90,1:95，5:1，10:1,15:1，20:1,25:1,30:1，35:1,40:1,50:1,60:1,70:1,75:1,80:1,90:1,95:1等。可选的，本发明中，所述羊膜上皮细胞的分离和培养包括如下步骤：(1)将羊膜从胎盘组织上剥离后，以含3％双抗的hbss缓冲溶液进行清洗；(2)将清洗后的羊膜剪碎，并用胰酶消化处理；(3)将消化处理后得到的消化液过筛后，收集细胞滤液，并离心处理；(4)将离心处理得到的细胞用培养基悬浮后接种，并培养；(5)当培养的细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得人羊膜上皮细胞。可选的，本发明中，步骤(2)中所述胰酶消化处理是在33～39℃条件下用胰酶消化处理20～40min，并消化处理2～4次；优选的，本发明中，步骤(2)中所述胰酶消化处理是在35～37℃条件下用胰酶消化处理30～35min，并消化处理3次。可选的，本发明中，步骤(3)中所述过滤是以孔径为200～400目的筛网进行过滤；优选的，本发明中，骤(3)中所述过滤是以孔径为300～350目的筛网进行过滤。可选的，本发明中，步骤(5)中所述胰酶消化是在33～39℃条件下用胰酶消化处理3～10min；优选的，本发明中，步骤(5)中所述胰酶消化是在36～37℃条件下用胰酶消化处理8～10min。可选的，本发明中，所述羊膜间充质干细胞的分离和培养包括如下骤：(1)将羊膜从胎盘组织上剥离，并以含3％双抗的hbss缓冲溶液清洗；(2)将清洗后的羊膜剪碎后，加入胰酶处理；(3)将胰酶处理后的组织清洗后，加入胶原酶i消化处理；(4)将消化处理后的组织过滤，并离心；(5)用培养液将离心后得到的细胞悬浮后接种培养；(6)培养后细胞汇合度达到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培养基终止消化，并传代培养，即得到人羊膜间充质干细胞。可选的，本发明中，步骤(3)中所述消化处理为以浓度为0.3～0.6mg/ml的胶原酶i消化处理；优选的，本发明中，步骤(3)中所述消化处理为以浓度为0.4～0.5mg/ml的胶原酶i消化处理。可选的，本发明中，步骤(3)中所述消化处理为在35～39℃条件下消化处理1～2h；优选的，本发明中，步骤(3)中所述消化处理为在37～38℃条件下消化处理1～2h。可选的，本发明中，步骤(6)中所述胰酶消化是在35～38℃条件下消化3～6min；优选的，本发明中，步骤(6)中所述胰酶消化是在36～37℃条件下消化4～5min。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物能够用于糖尿病的治疗中，并能够有效控制患者的糖尿病水平。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为培养48h后，人羊膜上皮细胞在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；图2为培养基中细胞汇合度达到80％-90％时，人羊膜上皮细胞在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；图3为p1代人羊膜上皮细胞在在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；图4为p5代人羊膜上皮细胞在在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；图5为培养48h后，人羊膜间充质干细胞在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；图6为培养基中细胞汇合度达到80％-90％时，人羊膜间充质干细胞在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；图7为p5代人羊膜间充质干细胞在在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；图8为p10代人羊膜间充质干细胞在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；图9为p15代人羊膜间充质干细胞在4×显微镜下观察到的培养基中细胞形态；图10为细胞表面子在人羊膜上皮细胞上的表达分析检测图谱；图11为细胞表面子在羊膜间充质干细胞上的表达分析检测图谱。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1首先，按照如下方法提取和培养人羊膜上皮细胞，具体提取和培养方法步骤如下：(1)在无菌条件下，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，然后用含3％双抗的hbss缓冲溶液冲洗数次清除残留血迹；(2)将冲洗后的羊膜组织剪碎后，加入胰酶，并在37℃水浴锅内消化处理3次，每次消化处理30min；(3)将消化处理后所得的消化液过300目筛网，以去掉未消化组织，并收集过滤后所得的细胞滤液；然后将细胞滤液在1500rpm条件下，离心处理10min；(4)将离心后所得沉淀细胞用低糖dmem培养基重新悬浮，并按照1×106细胞密度接种于10cm培养皿内；并将培养基放入37℃co2培养箱内，在培养48小时后，得到图1所示细胞形态的培养基，并更换为新的低糖dmem培养基；(5)如图2所示，当培养基中细胞汇合度达到80％-90％后，向培养基中加入胰酶，并在37℃条件下消化5min；然后再向加入低糖dmem培养基终止消化，即得到图3所示的p1代人羊膜上皮细胞；然后按1:3进行传代培养，即得到传代培养的人羊膜上皮细胞。本发明方法培养的人羊膜上皮细胞可稳态传代至如图4所示的p5代。然后，按照如下所述方法分离和培养人间充质干细胞，具体分离和培养步骤如下：(1)在无菌条件下，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，然后，用含3％双抗hbss冲洗数次清除残留血迹；(2)将清洗后的羊膜组织剪碎，并加入胰酶进行处理，从而去除羊膜上皮；(3)将步骤(2)处理后所得组织用hbss清洗3次后，加入浓度为0.5mg/ml胶原酶i，并在37℃水浴锅中消化处理1-2h；(4)将消化处理后所得混合物用筛网过滤，并去掉未消化组；然后在1500rpm条件下，离心处理10min.(5)用羊膜间充质干细胞培养液重悬离心处理所得的细胞，并按1×106的细胞密度接种于10mm培养皿内，并放入37℃条件下的co2培养箱内进行培养，并在培养48小时后，得到图1所示细胞形态的培养基，并更换为新的dmem/f12培养基；(6)如图2所示，细胞汇合度达到80％-90％后，加入胰酶37℃消化5min加入培养基终止消化，按1:3进行传代培养。本发明方法培养的人羊膜间充质干细胞可稳态由如图3所示的p5代、如图4所示的p10代一直传代培养至图5所示的p15代。接着，分别收集适量含人羊膜上皮细胞以及含羊膜间充质干细胞混合后，并分别制成悬液后混合，即为本发明羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物。实验例1(1)人羊膜上皮细胞流式细胞仪检测收集实施例1人羊膜上皮细胞提取和培养方法步骤(3)中消化处理后，过滤离心得到的人羊膜上皮细胞，并收集约106个细胞；将收集得到的细胞用pbs缓冲溶液洗涤2次，并适当稀释；然后在流式细胞仪上加样检测；检测后，采用软件分析cd73、cd90、cd44、cd45、cd105等5种细胞表面子在人羊膜上皮细胞上的表达，分析结果如图10所示；进一步根据图10所示分析结果进行积分计算，得出5种细胞表面子在各代的表达情况，结果如下：cd73表达情况：种群数量占母本比例(％)占全部比例母本10000—100.0p1代757275.775.7p2代755799.875.6cd90表达情况：cd105表达情况：种群数量占母本比例(％)占全部比例母本10000—100.0p1代706576.076.0p3代360.50.4cd45表达情况：种群数量占母本比例(％)占全部比例母本10000—100.0p1代754275.475.4p3代00.00.0cd44表达情况：种群数量占母本比例(％)占全部比例母本10000—100.0p1代450945.145.1p3代449799.745.0然后统计各标志物表达情况，结果如下表所示：检测结果显示，本发明人羊膜上皮细胞高表达了cd73、cd44以及cd90，基本不表达cd105以及cd45。(2)人羊膜间充质干细胞流式细胞仪检测收集实施例1人羊膜间充质干细胞分离和培养方法步骤(3)中消化处理后，过滤离心得到的人羊膜间充质干细胞，并收集约106个细胞；将收集得到的细胞用pbs缓冲溶液洗涤2次，并适当稀释；然后在流式细胞仪上加样检测；检测后，采用软件分析cd73、cd90、cd44、cd45、cd105等5种细胞表面子在人羊膜间充质干细胞上的表达，分析结果如图11所示；进一步根据图11所示分析结果进行积分计算，得出5种细胞表面子在各代的表达情况，结果如下：cd73表达情况：种群数量占母本比例(％)占总体比例总体10000—100.0p1代617161.761.7p2代6168100.061.7cd90表达情况：种群数量占母本比例(％)占总体比例总体10000—100.0p1代602860.360.3p2代587297.458.7cd105表达情况：种群数量占母本比例(％)占总体比例总体10000—100.0p1代616461.661.6p3代611899.361.2cd45表达情况：种群数量占母本比例(％)占总体比例总体10000—100.0p1代635763.663.6p3代240.40.2cd44表达情况：种群数量占母本比例(％)占总体比例总体10000—100.0p1代621862.262.2p3代616199.161.6然后统计各标志物表达情况，结果如下表所示：细胞表面标志物羊膜间充质干细胞cd73100％cd4499.1％cd10599.3％cd9097.4％cd450.4％检测结果显示，本发明人羊膜间充质干细胞高表达了cd73、cd44、cd105以及cd90，基本不表达cd45。实验例2糖尿病治疗效果实验t1dm模型大鼠30只，随机分为四组，其中6只大鼠接受胰岛素治疗，记为胰岛素治疗组；6只大鼠接受人羊膜上皮细胞治疗，记为人羊膜上皮细胞治疗组；6只接受人羊膜间充质干细胞治疗，记为人羊膜间充质干细胞治疗；6只接受羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物，记为混合治疗组；6只不接受任何治疗，记为对照组。同时随机选取6只正常大鼠作为正常对照组，记为正常组。其中，胰岛素治疗组为在每日大鼠进食前1h腹部注射3u胰岛素；人羊膜上皮细胞治疗组为将大鼠禁食12h后麻醉，并舌下静脉注射p3代人羊膜上皮细胞(1×106)悬液300μl/只；人羊膜上皮细胞治疗组为将大鼠禁食12h后麻醉，并舌下静脉注射p3代人羊膜间充质干细胞(1×106)悬液300μl/只；混合组为将大鼠禁食12h后麻醉，并舌下静脉注射p3代羊膜上皮细胞和p3代羊膜间充质干细胞混合物(1×106)悬液300μl/只，其中悬液中羊膜上皮细胞与羊膜间充质干细胞混合物细胞数数量比例约为1:1；对照组不做任何治疗。然后，每周对各组大鼠定时取血检测血糖，至第6周，并统计和计算各组小鼠血糖平均值，结果如下表所示：由上述实验结果可知，本发明羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞混合物能够有效控制血糖含量，并能够使得大鼠血糖水平基本达到正常范围值。进一步的，临床试验表明，本发明羊膜上皮细胞对人体由于糖尿病引发的高血糖也有很好的控制作用，经注射本发明羊膜上皮细胞悬浮液后，83％的糖尿病患者的血糖能够恢复至较正常水平；且体内胰岛素水平明显有所升高。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页12