一种精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的制备方法、产品及应用与流程

本发明属于核磁共振成像造影剂制备领域，具体涉及一种精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的制备方法、产品及应用。

背景技术：

近年来，核磁共振成像技术(mri)以其强大的成像能力已经成为临床医学中非常重要的诊断工具。它能够穿透人体的组织深部，实时动态的对疾病损伤和治疗效果进行检测，同时整个检测诊断过程是非侵袭性的，不会给患者带来机体的损伤和痛苦。对于患者机体的异常情况和组织损伤，核磁共振成像技术能够为医生提供准确和详细的诊断依据。因此，核磁共振成像技术在临床诊断中越来越得到患者接受和医生的重视。

但是mri的敏感性和分辨率并不高，因此需在被检测对象中加入一类能改变氢质子弛豫时间的物质来增加核磁共振成像的敏感性和分辨率，这种物质被称为核磁共振造影剂。

目前，临床中用到的造影剂多为钆类造影剂，如钆喷葡胺注射液，但是钆作为造影剂对于机体具有潜在的毒性，能够引起肾源性系统性纤维化病变，因此并不能在临床中受到特别的欢迎。

近年来，各国的研究机构尝试将合成的氧化铁纳米粒作为t2造影剂，但是t2造影剂是一种阴性对比剂，在成像过程中看到的是黑暗的图像，在临床中很难和其他的一些能产生暗场的病变进行区分，比如出血、血凝块和钙化等。因此，将氧化铁纳米粒作为t2造影剂应用于临床还受到很大的限制。

同时，通过在油相条件下合成得到超小氧化铁纳米粒，以及基于锰和钆的纳米粒用于t1造影剂的研究，并有望转化为临床应用的造影剂。但是，油相条件下得到的纳米粒必须经过相应的方法将其转移到水相才能用于生物医学领域，如聚合物包裹，配体交换等。但是这种方法得到的造影剂合成过程复杂、不能批量生产、不同的纳米粒表面需要选用不同的配体，因而，油相条件下得到的无机纳米粒用于临床推广还有很长的路要走。

基于以上考虑，设计合成安全、有效的核磁共振t1造影剂，并用于临床研究依然是患者、医生以及材料学家共同的期待。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的制备方法、产品及应用，所制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒在核磁共振成像过程中能够产生很好的t1成像效果。

本发明所提供的技术方案为：

一种精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

1)将精氨酸溶解于水中，加入环己烷混合后加热，然后再加入正硅酸乙酯进行反应，反应完成后除去环己烷，得到精氨酸稳定的二氧化硅纳米粒；

2)将二氧化硅纳米粒、高锰酸钾、乙醇和水混合后进行水热反应，分离得到精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒。

上述的技术方案中，采用精氨酸及正硅酸乙酯制备精氨酸稳定的二氧化硅纳米粒，由于精氨酸是一种碱性氨基酸且具有较高的等电点，能够在二氧化硅合成的过程中提供碱性环境同时能够结合在二氧化硅表面，进而能够合成水中稳定存在、粒径较小且均一的二氧化硅纳米粒；继续将二氧化硅纳米粒、高锰酸钾、乙醇和水混合反应，得到中空泡状的形貌，主要是由于在高温高压条件下，二氧化硅纳米粒的表面可以形成一些原硅酸活性位点，同时高锰酸钾可以将乙醇氧化，生成二氧化碳，然后以二氧化碳气泡为模板，高锰酸钾中的锰离子可以和原硅酸生成精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒。

上述方法制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒，由于具有特殊的形貌，有效得增加了核磁共振成像的敏感性和分辨率，此外还具有较好的水溶性、生物相容性及生物安全性。

优选的，所述步骤1)中加热至50～60℃。

优选的，所述步骤1)中反应时间为20～30h。

优选的，所述步骤1)中精氨酸、环己烷与正硅酸乙酯的投料比为30～60mg:2～5ml:3ml。

优选的，所述步骤2)中二氧化硅纳米粒和高锰酸钾的质量比为1:1～3。

优选的，所述步骤2)中水热反应的温度为180～200℃，反应时间为20～30h。

本发明还提供一种如上述的制备方法制备得到的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒。该精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒具有很好的增强t1成像的作用，为核磁共振成像技术用于临床疾病的精确诊断提供详细可靠的依据，最终实现对疾病的精准、个体化治疗。

优选的，所述精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的粒径为5～10nm。进一步优选为5～6nm。

本发明还提供一种如上述的制备方法制备得到的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒在制备t1造影剂中的应用。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明通过水热反应制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒具有较好的水溶性、生物相容性。

(2)本发明制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒具有很好的增强t1成像效果的功能，同时与钆基相应的t1成像造影剂相比具有更好的生物安全性。

(3)本发明中的反应步骤操作简单，条件可控，合成过程中不涉及毒性较大的有机溶剂，具有良好的临床转化可能性。

(4)本发明制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒可以大量合成，有利于将来的临床转化。

附图说明

图1为实施例1制备的精氨酸稳定的二氧化硅纳米粒的透射电子显微镜(tem)图；

图2为实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的透射电子显微镜(tem)图；

图3为实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的水合粒径分布图；

图4位实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的zeta电位分布图；

图5为实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的xrd图；

图6为实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的磁滞曲线图；

图7为实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的xps图；

图8为单纯的精氨酸和实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的紫外吸收图谱；

图9为单纯的精氨酸的热重分析(tga)曲线；

图10为实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的热重分析(tga)曲线；

图11为实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的t1加权成像图以及纳米粒的弛豫效率曲线；

图12为实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒在不同ph条件分散24小时的tem图；

图13为实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒在不同ph条件分散24小时的磁共振成像信号强度图；

图14为mada-mb231细胞对实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的摄取情况曲线图；

图15为在裸鼠肿瘤模型中肿瘤部位的磁共振成像效果冠状面扫描图片，白色框内为肿瘤部位；

图16为在裸鼠肿瘤模型中肿瘤部位的磁共振成像效果横断面扫面图片，白色框内为肿瘤模型；

图17为材料在裸鼠肝脏部位的分布与代谢磁共振成像图片；

图18为材料在裸鼠肾脏部位的分布与代谢磁共振成像图片；

图19裸鼠在给药24小时后，锰离子在其体内的分布情况。

具体实施方式

下面结合具体的实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)称取精氨酸50mg，加入到装有40ml去离子水的圆底烧瓶中，在磁力搅拌器500～600r/min条件下搅拌溶解，然后加入3ml环己烷，加热至50℃，然后再加入正硅酸乙酯(teos)3ml，反应24小时，反应结束后用分液漏斗静置分离，除去上层环己烷，得到精氨酸稳定的二氧化硅纳米粒。

对所制备的精氨酸稳定的二氧化硅纳米粒进行tem表征，结果如图1所示，二氧化硅纳米粒的粒径约为20nm。

(2)称取高锰酸钾固体25mg，去离子水4ml，乙醇1.5ml，二氧化硅纳米粒0.5ml(20mg/ml)，将其混合后放入到高压反应釜中，190℃反应24小时，反应结束后冷却至室温。然后用去离子水洗涤、离心3次，最后将所得到的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒分散于10ml水中。

对所制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒进行tem表征，结果如图2所示，精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的粒径为5～6nm。

精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的水合粒径分布图如图3所示，说明在水相中纳米粒的水粒半径为185.5nm；精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的zeta电位分布图如图4所示，表面电荷为-20.8mv。

对精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒进行xrd表征，如图5所示，证明所合成的纳米材料确实为硅酸锰纳米粒；精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒的磁滞曲线图如图6所示，说明合成的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒是顺磁性的；对精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒进行xps表征，如图7所示，说明合成的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒中含有硅，锰，碳和氧等元素；对单纯的精氨酸和精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒进行uv表征,如图8所示，两者在202nm有最大紫外吸收，证明精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒表面有精氨酸修饰；对单纯的精氨酸和精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒进行热重(tga)表征，如图9、10所示，单纯精氨酸失重在160℃～250℃左右，精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒在此温度范围内也有相应的失重，证明精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒表面有精氨酸修饰。

实施例2

(1)称取精氨酸50mg，加入到装有40ml去离子水的圆底烧瓶中，在磁力搅拌器500～600r/min条件下搅拌溶解，然后加入4ml环己烷，加热至60℃，然后再加入正硅酸乙酯(teos)3ml，反应24小时，反应结束后用分液漏斗静置分离，除去上层环己烷，得到精氨酸稳定的二氧化硅纳米粒。

(2)称取高锰酸钾固体25mg，去离子水4ml，乙醇1.5ml，二氧化硅纳米粒0.5ml(20mg/ml)，将其混合后放入到高压反应釜中，200℃反应24小时，反应结束后冷却至室温。然后用去离子水洗涤、离心3次，最后将所得到的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒分散于10ml水中。

实施例3

(1)称取精氨酸50mg，加入到装有40ml去离子水的圆底烧瓶中，在磁力搅拌器500～600r/min条件下搅拌溶解，然后加入3ml环己烷，加热至60℃，然后再加入正硅酸乙酯(teos)3ml，反应30小时，反应结束后用分液漏斗静置分离，除去上层环己烷，得到精氨酸稳定的二氧化硅纳米粒。

(2)称取高锰酸钾固体25mg，去离子水4ml，乙醇1.5ml，二氧化硅纳米粒0.5ml(20mg/ml)，将其混合后放入到高压反应釜中，180℃反应30小时，反应结束后冷却至室温。然后用去离子水洗涤、离心3次，最后将所得到的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒分散于10ml水中。

性能试验

1、体外精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒t1加权成像和弛豫效率的评价

(1)将实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒溶液浓度按等比稀释，设置不同的浓度梯度，分别为0，0.4375，0.875，1.75，3.5(mm)。

每个浓度量取200μl液体分别加入到ep管中，然后将ep管放于临床3.0t核磁共振仪的线圈中。调整用于t1成像的序列为tr＝240.00ms，te＝15ms，fa＝90.00。如图11所示，测得的r1值为0.3082mm^-1s^-1。

(2)将实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒在不同ph条件的pbs缓冲液中，研究材料在肿瘤弱酸性微环境条件下的降解情况，证明这种精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒具有一定得ph响应性。

分别将等量的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒分散于ph＝7.4，7.0，6.5，6.0，5.5，5.0的pbs缓冲液中，24h后通过透射电子显微镜观察材料的ph响应情况，以及在不同ph条件下的磁共振成像效果评价。

图12为精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒在不同ph条件分散24小时的tem图，可知随着ph的降低，这种泡状纳米粒的结构会发生降解；图13为精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒在不同ph条件分散24小时的磁共振成像信号强度图，说明随着ph的降低，材料的结构发生降解，锰离子从结构中释放出来，从而使得其成像能力得到加强。

(3)将mada-mb231细胞种于10cm细胞培养皿中，培养箱中培养12小时，使细胞贴壁生长，待细胞密度到达70-80％，将实施例1制备的不同浓度的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒，分别为0，5，10，25，50，100μg/ml加入到细胞培养皿中，24h后，消化，离心，洗涤细胞，然后通过磁共振成像判断细胞对纳米粒的摄取情况。结果如图14所示，说明泡状的硅酸锰纳米粒通过内吞作用进入细胞内，且随着材料浓度的增加，细胞的摄取量也在增加。

2、精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒作为t1造影剂的体内成像效果评价

裸鼠乳腺癌模型的构建：将培养的mda-mb231乳腺癌细胞通过皮下注射到裸鼠(nu/nu)体内，每个小鼠种植的乳腺癌细胞个数为1×10⁷个，将裸鼠饲养2周后，尾静脉注射实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒溶液，评价其体内成像能力。

每只小鼠加药量为200μl(2.6mg/ml)，分别在0min，15min，30min，2h，5h，24h，48h，对裸鼠进行扫描观察其成像效果。

图15，16，17和18为精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒用于乳腺癌裸鼠模型的肿瘤部位核磁共振成像效果的评价以及纳米粒在裸鼠体内的代谢情况。

图15为裸鼠的冠状面扫描图片，白色框内为肿瘤模型；图16为裸鼠肿瘤部位的横断面扫面图片，白色框内为肿瘤模型；图17为材料在肝脏部位的分布与代谢情况；图18为材料在肾脏部位的分布与代谢情况。从图15和16可以看出，尾静脉给药两个小时后肿瘤部位的成像开始增强，并且可以持续到48小时。

3、给药后24小时评价材料在小鼠体内的分布代谢情况

通过尾静脉注射200μl(2.6mg/ml)实施例1制备的精氨酸稳定的中空泡状硅酸锰纳米粒溶液到肿瘤模型的裸鼠体内，24小时后，将裸鼠解剖，取出主要的器官和肿瘤组织，通过电感耦合等离子体质谱分析裸鼠体内各个主要器官锰离子的分布情况。图19为给药24小时后，锰离子在裸鼠体内的分布情况。

以上所述实施例仅是对本发明较佳的技术方案，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并非是对本发明作其他形式的限制，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改，补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。