一种能进行MR‑荧光双模态淋巴成像、可降解小粒径纳米胶束及其制备方法和应用与流程

本发明涉及纳米医学与生物医学工程领域，具体地，涉及纳米胶束技术领域，更具体地，涉及一种能进行mr-荧光双模态淋巴成像、可降解的小粒径纳米胶束及其制备方法和应用。

背景技术：

据2012年2月世界卫生组织（who）发布的数据显示，恶性肿瘤的治愈已成为世界性难题，也是目前全世界的主要死亡原因之一，在2008年造成760万死亡，约占所有死亡人数的13%，且恶性肿瘤致死人数会逐年增加，到2030年将超过1310万。转移是恶性肿瘤难以治愈的主要原因，而淋巴道的转移是恶性肿瘤最重要的特征之一，因此淋巴结转移的早期检出和准确评判对于肿瘤分期和制定治疗计划具有十分重要的意义，对肿瘤患者的预后有非常重要的指导作用。淋巴系统是人体复杂的网状内皮系统，其主要功能是利用巨噬细胞清除组织间隙内的液体和大分子物质（如异物、毒素等）。传统影像诊断中，根据淋巴结大小、形态、内部结构及与周围组织器官的关系评价其良恶性易出现一定的假阳性和假阴性的误诊，诊断正确率较低，难以满足临床需要。

常规医学影像技术如x线淋巴造影、超声、ct、核素和常规mri对淋巴系统的诊断价值有限。mri具有极高的空间分辨率和软组织分辨率，然而常规mri技术基于淋巴结大小和信号强度变化用于淋巴结的评价仍然价值有限，且其敏感性仍相对较低。以超小型超顺磁性氧化铁（superparamagneticironoxide，spio）为代表的mr淋巴成像（mrlymphography）对肿瘤转移性淋巴结的检出和良恶性淋巴结的鉴别有很大帮助，显示了广阔的临床应用前景，然而仍然面临较大挑战，主要表现在其敏感性和特异性仍有待进一步提高。而多模态成像综合2种及以上成像技术，例如光学成像和mri，联合各成像技术的优势，将mri与光学成像技术进行结合，既能提高分辨率，获取更多结构的组织学信息，同时又能实现高灵敏度的功能学显像，最终达到完美的功能学显像与组织结构显像的统一。

然而，淋巴结成像本身具有一定的困难，具体表现在：当造影剂粒径大于40nm时候，进入体内后导致其被肝、脾网状内皮系统吞噬的比例大为增加，从而肿瘤（或淋巴结）靶向效应有所减低。控制造影剂粒径小于40nm时，可产生独特的被动靶向淋巴结的功能，使造影剂聚集于淋巴结，实现淋巴结的成像。然而，粒径小于40nm的单颗粒造影剂的造影能力又难以满足淋巴造影的需要，需借助聚合物胶束将小颗粒的造影剂包覆起来，利用集群增强效应实现淋巴结的高灵敏成像。高分子聚合物胶束具有粒径可控、生物安全及组织相容性好、细胞毒副作用低、结构稳定性好等优点，在药物传输和成像探针构筑领域显示出独特的优势。尽管已经有多篇关于纳米载体用于淋巴结成像的报道，但多数都是通过局部组织间注射来实现局部淋巴结的成像，在临床运用方面受到很大的限制。如何安全、有效的实现静脉淋巴结成像，仍然是淋巴结成像向临床转化的重要难题。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种可降解两亲性嵌段聚合物。

本发明的另一个目的是提供一种能同时负载spio和尼罗红的纳米胶束。

本发明的另一个目的是提供一种能同时负载spio和尼罗红的纳米胶束的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述两亲性嵌段聚合物在制备能进行mr-光学双模态成像的纳米胶束中的应用。

本发明的另一个目的是提供上述纳米胶束在对鼠单核巨噬细胞进行高效、安全标记中的应用。所述纳米胶束能对鼠单核巨噬细胞进行高效标记，且易水解，水解产物可用于临床使用，安全无毒副作用。

本发明的另一个目的是提供上述纳米胶束在对鼠单核巨噬细胞进行mr-荧光双模态淋巴结成像中的应用。所述纳米胶束能负载高敏磁造影剂及荧光染料，就淋巴结成像过程中对淋巴结内巨噬细胞对胶束的摄取及分布进行有效的、实时的定位监测。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种可降解两亲性嵌段聚合物，聚合物由聚乙二醇-树状低聚赖氨酸亲水段和胆酸疏水支链段构成；所述聚乙二醇-树状低聚赖氨酸亲水段分子量为2500da，胆酸疏水支链段长度为2～8个胆酸。

一种同时负载spio和尼罗红的纳米胶束，所述纳米胶束由可降解两亲性嵌段聚合物自组装形成，spio及尼罗红负载于其疏水内核；所述两亲性嵌段聚合物由聚乙二醇-树状低聚赖氨酸亲水段和胆酸疏水支链段构成；所述聚乙二醇-树状低聚赖氨酸亲水段分子量为2500da，胆酸疏水支链段长度为2～8个胆酸。

本发明所述的可降解两亲性嵌段聚合物自组装后能形成一种较小纳米尺寸的正电荷纳米胶束，将疏水性的spio及尼罗红负载于其疏水内核，得到同时负载mri造影剂及荧光造影剂的纳米胶束，将这种纳米胶束与鼠单核巨噬细胞在体外共同培养，实现了对鼠单核巨噬细胞高效率双模态标记。同时，由于该两亲性嵌段聚合物易水解，水解产物可用于临床使用，纳米胶束对鼠单核巨噬细胞显示了极小的细胞毒性，对人体安全无毒副作用。

本发明为了实现体外培养时对鼠单核巨噬细胞细胞的高效标记，选取聚乙二醇-树状低聚赖氨酸亲水段；选取胆酸为疏水段，能够同时负载疏水性spio和尼罗红，同时使spio在细胞内的再聚集，可满足高灵敏度mr-荧光双模态造影剂的要求。

本发明为了得到超小粒径纳米胶束，可以通过调控聚乙二醇-树状低聚赖氨酸连接的胆酸数目，得到能被动靶向淋巴结的造影粒子。所述纳米胶束粒径为25～40nm。

本发明为了实现体外培养时对鼠单核巨噬细胞的安全标记，将极易得到生物安全的聚乙二醇聚合物和胆酸通过可降解的酰胺键链接，水解产物（peg、赖氨酸和胆酸）均细胞毒性极小，对人体安全无毒副作用。

所述同时负载spio和尼罗红的纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：

s1.将(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸通过酰胺化反应接到聚乙二醇的氨基端；

s2.将氨基的保护基团叔丁氧羰基脱去，得到聚乙二醇-赖氨酸；

s3.在聚乙二醇-赖氨酸的基础上，重复s1和s2的步骤，得到末端接1～7个赖氨酸的聚乙二醇，表述为mpeg-lys1～7；

s4.在hbtu和hobt的偶联下，将胆酸通过酰胺化反应接到mpeg-lys1～7的氨基端，得到可降解两亲性嵌段聚合物；

s5.可降解两亲性嵌段聚合物进行自组装，将疏水性的spio及尼罗红负载于其疏水内核，得到同时负载spio和尼罗红的纳米胶束。

如上所述的可降解两亲性嵌段聚合物在制备能进行mr-荧光双模态成像的纳米胶束中的应用。

所述同时负载spio和尼罗红的纳米胶束在进行mr-荧光双模态淋巴成像的应用。

所述同时负载spio和尼罗红的纳米胶束在对鼠单核巨噬细胞进行体外实验的应用。

如上所述的纳米胶束在对鼠单核巨噬细胞进行体外标记及体内mr-荧光双模态实验中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种mr-荧光双模态淋巴成像的纳米胶束的制备方法及应用，针对现有淋巴结成像难度大、敏感型及特异性较低的问题，得到同时负载mri造影剂及荧光造影剂的小粒径纳米胶束，将这种纳米胶束与鼠单核巨噬细胞在体外共同培养，能够对巨噬细胞进行高效的spio、荧光标记，就淋巴结成像过程中对淋巴结巨噬细胞对胶束的摄取及淋巴结内分布进行有效的、实时的动态mr-荧光双模态定位监测。同时，由于该两亲性嵌段聚合物极易水解，水解产物可用于临床使用，该纳米胶束对巨噬细胞显示了极小的细胞毒性，对人体安全无毒副作用，有望真正实现纳米载体标记淋巴结巨噬细胞从基础研究向临床应用的转化。

附图说明

图1为纳米胶束的制备示意图。

图2为纳米胶束的tem图、粒径。

图3为纳米胶束弛豫率的mri检测。

图4为纳米胶束标记鼠单核巨噬细胞的荧光标记检测：激光共聚焦显微镜法。

图5为纳米胶束标记鼠单核巨噬细胞的铁标记检测：（a）mrit2值测量法；（b）普鲁士蓝铁染色法。

图6为纳米胶束对鼠单核巨噬细胞的毒性测试：mtt法。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明进行进一步解释说明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应包括在本发明权利要求的保护范围之内。

以下实施例和对比例中，所用原料均为市售商品。

实施例1

s1.聚乙二醇-双(叔丁氧羰基)-l-赖氨酸（mpeg-lys(boc)2）的合成，反应机理及过程如下：

首先，将boc-lys(boc)-oh通过酰胺化反应接到聚乙二醇的氨基端（mpeg-nh2）。具体地，1.0gmpeg-nh2（0.5mmol），207mg(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸（0.60mmol），81mg1-羟基苯并三唑（hobt,0.60mmol），238mgo-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（hbtu,0.60mmol）和100µln，n-二异丙基乙胺（dipea）装入反应瓶（25ml）中，加入无水dmf（15ml）溶解，室温下搅拌反应8h。用茚三酮测试验证反应进行是否完全：反应液与茚三酮检测液显棕黄色（无蓝色）说明反应完全。反应完后的溶液用乙醚沉淀并多次洗涤，经分离干燥得到目标分子聚乙二醇-双(叔丁氧羰基)-l-赖氨酸（mpeg-lys(boc)2）。

s2.聚乙二醇-赖氨酸（mpeg-lys）的合成，反应机理及过程如下：

用三氟乙酸将氨基的保护基叔丁氧羰基脱去，按每1g聚合物加10ml三氟乙酸的用量，反应在常温进行，保持搅拌半小时后沉淀在无水乙醚中，过滤、洗涤、干燥后得到聚乙二醇-赖氨酸。

s3.mpeg-lys3的合成，反应机理及过程如下：

在聚乙二醇-赖氨酸的基础上，重复上述的接boc-lys(boc)-oh和脱保护的步骤，得到mpeg-lys3（末端接三个赖氨酸的peg，氨基变成四个）。

s4.聚乙二醇-树状低聚赖氨酸-胆酸（mpeg-lys3-ca4）合成，反应机理及过程如下：

在hbtu和hobt的偶联下，将胆酸通过酰胺化反应接到mpeg-lys3的氨基端。具体地，0.6gmpeg-lys3（0.25mmol），490mg胆酸（1.2mmol），162mg1-羟基苯并三唑（hobt,1.2mmol），476mgo-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（hbtu,1.2mmol）和200µln,n-二异丙基乙胺（dipea）装入反应瓶（25ml）中，加入无水dmf（15ml）溶解，室温下搅拌反应8h。用茚三酮测试验证反应进行完全后，装入透析袋内（截留分子量：1kda）在无水甲醇中透析两天，沉淀在无水乙醚中，经过滤、洗涤、干燥后，得最终产物mpeg-lys3-ca4。

s5.负载尼罗红和spio的纳米胶束制备

20mgmpeg-lys3-ca4用0.5mldmso溶解后与溶有1mgspio，0.2mg尼罗红的1.5ml氯仿溶液混合，超声作用下，乳化在20mlpbs中，旋蒸除去氯仿后，用450nm的针筒过滤器除去大的聚集体和游离的spio和尼罗红，pbs中透析（14kda）两天除去dmso，然后用100kda的超滤管浓缩并洗涤，得到同时负载尼罗红和spio的纳米胶束，制备思路如图1所示。所得纳米胶束平均粒径为33.8±5.8nm。

制备的纳米胶束表征

取实施例1得到的纳米胶束溶液，测定其水力学直径及形貌结构，结果如图2所示。（a）纳米胶束粒径为33.8±5.8nm。（b）电镜结果表明，纳米粒子呈均匀的球形结构。

纳米胶束弛豫率的mri检测

将实施例1制备的纳米胶束于96孔板内按浓度梯度逐级稀释，进行mri（gediscoverymr750，3.0t）体外测试。使用快速自旋回波序列，获取t2加权图像，成像参数如下tr/te=5000/111ms，fov为100mm，矩阵：256*256，层厚：2mm，间隔：0，roi=28mm²，获取t2的弛豫时间。以铁浓度（ug/ml）为横坐标，t的倒数（r2）为纵坐标，采用线性最小二乘回归分析，直线斜率即为t2的弛豫度。图3结果显示，负载于纳米胶束内的spio由于团簇效应，具有很高的t2弛豫率，能够实现对鼠巨噬细胞的有效标记。

纳米胶束标记神经干细胞的荧光标记检测

将实施例1制备的纳米胶束在铁浓度为10μg/ml的情况下标记鼠巨噬细胞6小时后，激光共聚焦显微镜观察纳米胶束对细胞的荧光标记情况。图4结果表明：激光共聚焦显示细胞被载有荧光染料尼罗红的纳米胶束高效标记。

纳米胶束对神经干细胞的铁标记检测

将实施例1制备的纳米胶束在铁浓度为10μg/ml的情况下标记神经干细胞6小时后，收集细胞pbs洗涤三次后重悬细胞于200μl1%琼脂糖凝胶中（细胞密度为2.5×10⁶/ml），mri、普鲁士蓝检测纳米胶束对鼠单核巨噬细胞的spio标记情况，mri参数同弛豫率的检测。图5结果显示：（a）mr示标记后细胞的t2信号明显降低，低于空白对照组；（b）普鲁士蓝染色示标记鼠单核巨噬细胞胞质内有较多蓝染铁颗粒；满足后续活体mr示踪的条件。

纳米胶束的细胞毒性检测

采用mtt法检测实施例1制备的纳米胶束与鼠单核巨噬细胞孵育后细胞的存活率，评价纳米胶束对细胞的毒性，结果如图6所示，纳米胶束显示了极小的细胞毒性，对人体安全无毒副作用，有望真正实现纳米载体标记巨噬细胞从基础研究向临床应用的转化。

实施例2

参照实施例1合成两亲性嵌段聚合物，其中聚乙二醇-氨基（mpbla-nh2）其末端氨基经1次与(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸耦合、脱保护后，可得到末端带两个氨基的peg-lys。pbla-lys按实施例1的方法接上胆酸，可得到末端接2个胆酸的两亲性聚合物。负载尼罗红和spio的纳米胶束制备方法同实施例1。所得纳米胶束平均粒径为38±2.0nm。

实施例3

参照实施例1合成两亲性嵌段聚合物，其中聚乙二醇-氨基（mpbla-nh2）其末端氨基经3次与(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸耦合、脱保护后，可得到末端带8个氨基的peg-lys7。pbla-lys7按实施例1的方法接上胆酸，可得到末端接8个胆酸的两亲性聚合物。负载尼罗红和spio的纳米胶束制备方法同实施例1。所得纳米胶束平均粒径为32.5±5.4nm。