一种酶法高效制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法与流程

本发明涉及一种酶法高效制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

角膜疾病的致盲率在眼科疾病中占据第二位，我国每年也有数百万角膜盲患者。角膜病的早期治疗方法主要根据病因来对症治疗，晚期时，由于角膜多出现瘢痕、溃疡等，需要手术替换病变角膜，即角膜移植术。角膜移植术是治疗角膜盲最重要的方法。我国每年有数百万角膜盲患者，其中大部分患者更可以通过角膜移植术脱盲。角膜移植术的供体角膜绝大多数为人源角膜，因此数量极其有限，最终每年可以通过异体角膜移植术重见光明患者的只有数千例。这种情况下，替代材料的发展成为了角膜盲患者康复的希望，因而研究能够替代角膜的组织工程材料成为一种迫切的需求。

角膜基质层是构成角膜的主要部分，占角膜厚度的90％，主要成分为角膜基质细胞、胶原、糖蛋白和蛋白多糖。正常的角膜基质由200-250层胶原纤维板构成，交错排列，其中构成角膜纤维板层的胶原纤维相互平行排列，直径一致，集中分布于30nm附近，间距相等。角膜基质特征性组织学结构与角膜透明性状密切相关，是其他组织所不能替代的。因此，角膜基质组织的构建是组织工程技术构建角膜的主要任务、难点和关键所在。组织工程角膜载体材料需要有良好的三维立体结构和功能蛋白以支持种子细胞的生长，一定的机械强度，较好的透光度、屈光度、透氧性，以及良好的生物可降解性等等。角膜组织工程材料主要包括天然材料，人工材料及复合材料。天然材料包括羊膜，壳聚糖，胶原，异种角膜基质等。人工材料是人工合成的高分子物质，包括聚羟基乙酸，合成胶原等，但由于非酶性水解，未知的体内代谢过程及产物，作为角膜组织工程的支架材料，仍需进行深入的研究。另外，人工材料通常在曲率，透明度，机械强度，密度，孔隙率等性质上与天然角膜有一定差异。引用两种或两种以上的材料，通过不同的配比、合成方法等调节材料的性质，制成是复合材料。但在复合材料中，各部分的比例，混合方法，材料的具体物理、化学及生物学性质等，还需要进一步研究。因此，由于角膜组织结构的复杂性，人工和复合材料材料很难满足角膜移植后组织层次的正常重建。

鉴于这些问题，近年来异种动物组织因其来源丰富、成本低廉、并经脱去异种细胞处理后制备的支架可商业化生产，在角膜组织重建中的应用得到了越来越多的关注。动物眼球作为肉类加工的副产品，大多数企业并未将其加工利用而是直接掩埋丢弃，不仅会造成环境污染，更是对资源的一种极大浪费。因此以动物眼球作为一种基础材料制备角膜支架材料不仅提高肉类加工副产品的附加值，还能有效避免资源浪费及环境污染。不同种属的动物比较，猪角膜的免疫原性最低，而且猪、人眼角膜的应力-应变关系和强度实验证明二者十分相似。猪角膜脱细胞后作为支架拥有天然角膜的结构、厚度、曲率、韧性及微环境，其细胞外基质成分能够有效的支持细胞的黏附和移行，其含有的相关生物信息也能促进细胞的增殖和分化，其固有的组织结构层次能满足有效构建角膜内皮层，并与角膜上皮、基质细胞层有机整合，促进组织再生。此外其透明度高，由于其直接来源于生物活体而具有良好的生物安全性和生物相容性，因而具有良好的应用前景。但研究表明：处理工艺方法的不同会引起材料的孔径大小以及细胞外基质结构的不同。制备异种脱细胞支架的方法主要为物理法，化学法和生物法。物理法中较为常用的是反复冻融法和高静压法。但细胞的效率较差需要结合其他处理方法，或仪器过于昂贵，大大增加了应用成本。化学法的应用较为广泛，主要包括去污剂处理法，酸、碱处理，去污剂的使用较为成熟，包括sds，tritonx-100等，但制备过程对基质的胶原纤维有一定损伤和破坏，且去垢剂不易清洗干净，残留在组织中将对细胞和组织产生伤害作用。生物法主要为包括酶法(如胰酶)去细胞。胰酶可以较温和地去除细胞，细胞外基质结构和功能的完整与稳定性，整个过程最大限度的保证了基质层的结构和功能的完整性和稳定性。但胰酶破坏胶原蛋白的端肽，而且不能彻底去除去细胞处理(decellularizationoracellularization)过程中降解后所释放出的遗传物质，有时很难避免用可能引起的免疫排斥反应。此外，以胶原成分为主的角膜脱细胞基质的力学性能差，韧性张力小，在体内降解代谢过快，在含水条件下难以塑形，不利于人体器官的重建。因此，寻找有效的方法对角膜脱细胞支架进行改性来提高其力学性能也是保障其未来应用的必要措施，探索一种有效的制备脱细胞猪角膜基质的流程方法仍然是解决问题的关键。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种酶法高效制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法；该方法通过处理天然猪角膜支架，将其制备成可替代的生物材料，解决供体角膜有限的难题。

本发明技术方案如下：

一种酶法高效制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法，步骤如下：

(1)将猪角膜基质板层置于稀释的myroilysin中，在35～38℃条件下进行脱细胞处理10～18h，然后生理盐水、蒸馏水分别冲洗，制得猪角膜脱细胞支架板层；

(2)将步骤(1)制备的将猪角膜脱细胞支架放置在钻台上，滴加核黄素溶液20～40min，并在波长为365nm的紫外灯下照射30～60min，然后生理盐水、蒸馏水分别冲洗，制成核黄素交联的猪角膜脱细胞支架；

(3)将步骤(2)制得的交联的猪角膜脱细胞支架经脱水、灭菌，4℃保存待用。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的myroilysin酶溶液，采用如下方法制备：

(i)将经过活化的深海细菌(myroidesprofundi)d25菌株接种于液体发酵培养基中，14～16℃发酵培养70～75h；将发酵液离心取上清液，向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵饱和度为60％，收集沉淀，经tris-hcl重悬、透析后离心，再经离子交换层析分离纯化，g75分子筛分离纯化，制得弹性蛋白酶myroilysin粗酶液；

(ii)将步骤(i)制得的弹性蛋白酶myroilysin粗酶液经截留分子量为10000da的超滤管超滤浓缩，制得浓缩液，然后添加质量百分比15％的甘油，分装保存在-80℃，即得。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(i)中，离子交换层析为用deae阴离子柱通过0～0.8m的nacl梯度洗脱分离纯化。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(ii)中，浓缩液中myroilysin酶的浓度为1.8～2.2mg/ml。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，稀释的myroilysin酶溶液为用ph9.0的50mmtris-hcl缓冲液稀释myroilysin酶溶液，制得甘油体积百分比占18～22％、myroilysin酶质量浓度为100～1000μg/ml的myroilysin酶溶液。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，myroilysin酶质量浓度为100μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下处理18h；myroilysin酶质量浓度为300μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下处理16h；myroilysin酶质量浓度为500μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下处理16h；myroilysin酶质量浓度为800μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下处理10h；myroilysin酶质量浓度为1000μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下处理10h。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，猪角膜基质板层与稀释的myroilysin酶溶液的质量体积比为1：20～30。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，处理为在转速为80rpm的条件下震荡处理。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，核黄素溶液的浓度为1mg/ml。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，脱水为在无菌甘油中脱水22～28h。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，灭菌为在20k的条件下辐照灭菌。

有益效果

1、在角膜中，胶原纤维束构成片状紧密相连形成透镜结构，角膜的主要成分是胶原。海洋弹性蛋白酶myroilysin具有膨胀但不降解胶原蛋白的特性，可有效去除细胞及单性蛋白成分；因此，本发明制得的脱细胞支架仍保留足够的机械强度，并且形成了一定的孔隙，脱水后透明度较高，有利于细胞的生长和迁移；

2、通过海洋弹性蛋白酶myroilysin制备猪角膜脱细胞支架，不结合任何物理方法或化学试剂，属于单纯的酶法。该方法制得的脱细胞支架无细胞毒性，具有更良好的生物相容性；与人工材料相比，其物理化学性质与天然角膜更为相似，由于材料与正常角膜一致，因而移植后可以更好地行使角膜的生物学功能，促进机体角膜的重建，为角膜脱细胞基质组织工程支架的临床应用和推广奠定了基础。

附图说明：

图1.猪角膜脱细胞支架的照片；

其中：a：猪角膜脱细胞支架在甘油脱水前；b：猪角膜脱细胞支架在甘油中脱水24h后；

图2.猪角膜脱细胞支架的苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，he染色)染色照片；

其中：a：天然猪角膜基质；b：100μg/mlmyroilysin在37℃下处理18h制备的猪角膜脱细胞支架；c：200μg/mlmyroilysin在37℃下处理16h制备的猪角膜脱细胞支架；d：300μg/mlmyroilysin在37℃下处理16h制备的猪角膜脱细胞支架；e：500μg/mlmyroilysin在37℃下处理16h制备的猪角膜脱细胞支架；f：800μg/mlmyroilysin在37℃下处理10h制备的猪角膜脱细胞支架；g：1000μg/mlmyroilysin在37℃下处理10h制备的猪角膜脱细胞支架；h：1500μg/mlmyroilysin在37℃下处理6h制备的猪角膜脱细胞支架；i：100μg/mlmyroilysin在20℃下处理6h制备的猪角膜脱细胞支架；j：100μg/mlmyroilysin在35℃下处理6h制备的猪角膜脱细胞支架；k：200μg/mlmyroilysin在25℃下处理6h制备的猪角膜脱细胞支架；l：200μg/mlmyroilysin在35℃下处理6h制备的猪角膜脱细胞支架；

图3：通过其他处理方法制备的猪角膜脱细胞基质的苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，he染色)染色照片；

其中：a：通过超纯水及2mnacl，0.2％tritonx-100处理制备的猪角膜脱细胞支架；b：通过0.5％sds处理制备的猪角膜脱细胞支架；c：通过0.25％胰酶及1％tritonx-100制备的猪角膜脱细胞支架；

图4.猪角膜脱细胞支架的扫描电镜图；

其中：a：天然猪角膜基质；b：猪角膜脱细胞支架。

图5.猪角膜脱细胞支架及天然猪角膜的透明度检测曲线图；

其中：npc：天然猪角膜；apcs：猪角膜脱细胞支架；

图6.猪角膜脱细胞支架及天然猪角膜的稳定性检测曲线图；

其中：n：天然猪角膜，m：猪角膜脱细胞支架，0：ⅰ型胶原酶缓冲液，c：ⅰ型胶原酶；

图7.猪角膜脱细胞支架的细胞相容性荧光观察照片；

图8.新西兰兔角膜板层缺损模型的建立照片；

其中：a：使用负压环钻在新西兰兔角膜正中央做200μm深度的环形切口；b：隧道刀沿切口切除中央区域角膜板层，制成新西兰兔角膜板层缺损模型；

图9.新西兰兔角膜板层移植的术后恢复照片；

其中：a：板层移植手术后一周；b：板层移植手术后一个月；c：板层移植手术后两个月。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

实施例中所述深海适冷菌(myroidesprofundi)d25，购自中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号cctccm2012534。

实施例1：myroilysin的提取和纯化

1.弹性蛋白酶myroilysin的制备方法，具体包括如下步骤：

myroilysin粗酶液的制备

按照实验室已经建立的方法，将深海适冷菌myroidesprofundid25接种于液体种子培养基中，在15℃条件下震荡培养2天，活化菌种。

将上述步骤活化的菌种按1％(v/v)的接种量接种于液体发酵培养基中，在15℃，180rpm的条件下，震荡培养72小时，制得发酵液。

按照实验室已经建立的方法，将上述制得的发酵液进行硫酸铵沉淀、重悬、透析、deae阴离子交换，制得myroilysin粗酶液。

2.myroilysin浓缩酶溶液的制备

将上述步骤获得的myroilysin粗酶液进行超滤浓缩，浓缩后g75分子筛层析分离，获得去除大部分色素的myroilysin溶液。再将myroilysin溶液超滤浓缩，补加甘油至总体积的15％，分装保存于-80℃。

实施例2：角膜脱细胞支架制备方法

猪角膜脱细胞支架的制备方法，具体包括如下步骤：

取新鲜猪眼球，并将猪眼球固定在案板上，猪角膜朝向正上方。使用负压环钻在猪角膜正中央做深度约200μm的环形切口，隧道刀及刀片将角膜板层剥离下来，放置于生理盐水中；

将浓缩的myroilysin溶液用50mmtris-hcl(ph9.0)稀释至200μg/ml，其中甘油含量为总体积的20％。将角膜板层放置于myroilysin溶液中，在37℃下处理16h，转速为80rpm，制得猪角膜脱细胞支架；

蒸馏水将猪角膜脱细胞支架淋洗干净，再用生理盐水振荡洗涤3次，每次30min；蒸馏水振荡洗涤3次，每次30min。

将猪角膜脱细胞支架在20k辐照下灭菌后，放置于4℃条件下，储存备用。

结果分析

天然猪角膜经过myroilysin处理16h后，厚度增加，透明度降低(见图1a,c)；经甘油脱水24h后，透明度基本恢复(见图1b,d)；he染色观察表明天然猪角膜中上皮细胞层及基质内细胞(见图2a)经脱细胞过程后，基本被去除干净(见图2b～h)。通过sem观察，发现天然猪角膜支架中胶原纤维排列整齐呈束状(见图4a)；猪角膜脱细胞支架的胶原纤维并没有严重断裂，并且与天然猪角膜基质相比，猪角膜脱细胞支架的胶原纤维结构相对疏松(见图4b)。

实施例3：脱细胞角膜支架物化和生理特性检测

1.猪角膜脱细胞支架的透明度检测

将猪角膜脱细胞支架及天然猪角膜放置在96孔板上，以10nm为间隔，检测在300～800nm波长范围内，猪角膜脱细胞支架的透明度变化；

2.猪角膜脱细胞支架的稳定性检测

ⅰ型胶原酶的缓冲液为含有5mmca²⁺的pbs缓冲液，将500μg/mlⅰ型胶原酶溶于ⅰ型胶原酶溶液中，得到ⅰ型胶原酶溶液。

将猪角膜脱细胞支架及天然猪角膜分别浸泡在ⅰ型胶原酶溶液及ⅰ型胶原酶缓冲液中，每2h微量天平检测猪角膜脱细胞支架及天然猪角膜的残余质量，计算降解速率。

3.猪角膜脱细胞支架的细胞相容性检测

人角膜基质细胞培养液为含15％胎牛血清及50μg/mlbfgf的dmem/f12培养液；

将猪角膜脱细胞支架浸泡在人角膜支架细胞培养液中，浸泡3天后，按照每孔2.5×10⁴个细胞的数量接种人角膜支架细胞。继续常规培养3天后，福尔马林固定猪角膜脱细胞支架，取猪中央部位制备冰冻切片，300μg/mldapi避光染色10min后，pbs清洗两次，每次5min。将切片放置在荧光显微镜下，观察人角膜基质细胞在猪角膜脱细胞支架中的生长状况。

结果分析

甘油脱水后，猪角膜脱细胞支架保持较高的透明度(见图5)。在ⅰ型胶原酶溶液中，猪角膜脱细胞支架的降解速率略快于天然猪角膜，稳定性略差于天然猪角膜(见图6)。培养3天后，人角膜基质细胞生长进入猪角膜脱细胞内部(见图7)，说明猪角膜脱细胞支架可以支撑人角膜基质细胞迁移、生长，有良好的细胞相容性。

实施例4：猪角膜脱细胞支架的交联及新西兰兔角膜缺损模型建立和板层移植效果检测

1.猪角膜脱细胞支架的核黄素交联处理

将猪角膜脱细胞支架放置在钻台上，每3min滴加核黄素溶液，共计30min；再将猪角膜脱细胞支架及钻台放置在波长为365nm的紫外灯下，紫外强度为3000μw/cm²。每5min滴加核黄素溶液，共计50min。蒸馏水将交联支架淋洗干净，放置在生理盐水中振荡洗涤3次，每次30min；蒸馏水振荡洗涤3次，每次30min，制成核黄素交联的猪角膜脱细胞支架。

蒸馏水将交联支架淋洗干净，放置在生理盐水中振荡洗涤4次，每次20min；蒸馏水振荡洗涤4次，每次20min；

将制得的交联的猪角膜脱细胞支架脱水、灭菌，4℃保存待用。

2.3％戊巴比妥钠溶液按照1.5ml/kg耳缘静脉注射麻醉新西兰兔。常规消毒铺巾，剪除第三眼睑。用直径7.0mm的负压环钻在新西兰兔角膜正中央制备深度约200nm的环形切口(见图8a)，隧道刀沿切口切除中央区域角膜，制成新西兰兔角膜板层缺损模型(见图8b)。

3.将交联的猪角膜脱细胞支架植片放置在无菌生理盐水中复水3min，环钻固定植片直径为7.0mm。将植片覆盖在板层缺损的新西兰兔角膜植床上，10-0手术线缝合12针。术毕涂氧氟沙星眼膏。

术后每天滴地新滴眼液。观察新西兰兔的恢复情况。

结果分析

猪角膜脱细胞支架板层移植一周后，新西兰兔角膜未发现明显红肿、溶解、新生血管等症状(见图9a)；移植一个月后，猪角膜脱细胞支架植片从边缘开始透明化，呈现了良好的恢复趋势(见图9b)；移植三个月后，猪角膜脱细胞支架植片大体恢复透明(见图9c)。

实施例5

使用实施例1制备的myroilysin浓缩酶溶液按照实施例2的步骤制备猪角膜脱细胞支架，不同之处在于，分别按照如下条件进行反应：

a.用100μg/mlmyroilysin在37℃下处理18h制备的猪角膜脱细胞支架(如图2-b所示)；

b.用300μg/mlmyroilysin在37℃下处理16h制备的猪角膜脱细胞支架(如图2-d所示)；

c.用500μg/mlmyroilysin在37℃下处理16h制备的猪角膜脱细胞支架(如图2-e所示)；

d.用800μg/mlmyroilysin在37℃下处理10h制备的猪角膜脱细胞支架(如图2-f所示)；

e.用1000μg/mlmyroilysin在37℃下处理10h制备的猪角膜脱细胞支架(如图2-g所示)；

f.用1500μg/mlmyroilysin在37℃下处理6h制备的猪角膜脱细胞支架(如图2-h所示)。

以上制备方法脱细胞效果较好，与最终选取方案效果相似。因使用的酶浓度较低，时间较短，因此选取了200μg/mlmyroilysin在37℃下处理16h为最终处理方案。

对比例1

使用实施例1制备的myroilysin浓缩酶溶液按照实施例2的步骤制备猪角膜脱细胞支架，不同之处在于，分别按照如下条件进行反应：

a.用100μg/mlmyroilysin在25℃下处理6h制备的猪角膜脱细胞支架(见图2-i)；

b.用100μg/mlmyroilysin在35℃下处理6h制备的猪角膜脱细胞支架(见图2-j)；

c.用200μg/mlmyroilysin在25℃下处理6h制备的猪角膜脱细胞支架(见图2-l)；

d.用200μg/mlmyroilysin在35℃下处理6h制备的猪角膜脱细胞支架(见图2-k)；

以上制备方法去除基质中细胞成分不彻底。