本发明属于药物技术领域，涉及中药有效成分提取及纯化方法，特别是涉及一种从马钱子中提取、分离马钱子总生物碱的方法。
背景技术：
马钱子又名番木鳖，是常用的剧毒中药，始载于《本草纲目》，药典记载其具有“通络止痛，散结消肿”之功效，对癌性疼痛、三叉神经痛、风湿关节痛等各种疼痛症状有良好的临床疗效。马钱子的主要活性成分是吲哚类生物碱，其中士的宁与马钱子碱两者含量超过马钱子生物碱总量的80%。士的宁含量最高，药典规定含12-22mg/g，约占生物碱总量的40-50%；其次是马钱子碱，药典规定不少于8mg/g，约占生物碱总量30-40%。马钱子碱具有良好的镇痛、抗炎作用，能抑制血小板的凝聚与抗血栓形成，是马钱子通络止痛主要活性成分；而士的宁却并无明显镇痛、抗炎的作用，且其为剧毒药物。口服士的宁5-10mg即可出现肌肉痉挛等中毒症状；超过30mg患者可能因肌肉强直痉挛而窒息死亡。即使临床患者按规定服用马钱子0.3-0.6g，士的宁摄入量已高达3.6-13.2mg，故临床服药过程中易出现中毒症状，过量服用马钱子则易导致患者死亡。
去除马钱子总生物碱所含部分士的宁，有助于降低其毒性，且能保留其镇痛、抗炎的药理活性，实现马钱子安全用药。专利申请号201110300527.2采用酸水热回流提取、减压浓缩、甲醇搅拌醇沉后制干膏、干膏用碱液溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯即得马钱子总碱。专利申请号201110294731.8采用5-12倍量酸水热回流提取、提取液调ph、过滤，滤液直接加到大孔吸附树脂上，去离子水、酸液洗脱后再用乙醇洗脱，浓缩洗脱液中的乙醇，调ph至8-11，加入硅藻土，蒸干，得固体物；固体物采用氯仿回流提取，过滤，回收有机溶剂，干燥，粉碎成药粉；药粉用甲醇处理，过滤，滤液减压浓缩，干燥，粉碎即得马钱子总生物碱。上述专利方法均采用酸水热回流提取从马钱子中提取马钱子总生物碱，生产时间长，能耗高，且酸易损伤大生产设备，提取液中水溶性杂质多，不利于后续纯化马钱子总生物碱；同时上述工艺需使用氯仿、甲醇等强毒的有机溶剂，总生物碱易出现有毒有机溶剂的残留。本发明拟采用闪式提取法提取马钱子，马钱子提取液浓缩后调ph至碱性，滤除沉淀，滤液经大孔吸附树脂纯化，由此获得纯度较高的去除大量士的宁的马钱子总生物碱。
闪式提取技术是一种用于植物软、硬组织破碎的新型提取技术，它能在室温下将溶剂中的药材粉碎至细微颗粒，有效成分在数秒钟或数分钟内扩散到溶剂中，能避免药材中活性成分受热破坏，提取时间短，效率高、安全可靠。近年闪式提取法受到了研究者的青睐，已有文献报道应用该技术提取白芍、龙胆、丹参、辣椒等多种中药的活性成分。从马钱子中提取马钱子生物碱的方法通常为热回流提取法，目前未见采用闪式提取法从马钱子中提取马钱子生物碱。大孔吸附树脂是一种新型非离子型高分子聚合物吸附剂，具有大孔网状结构，其物理化学性质稳定，吸附性能强，其特点是吸附容量大，再生简单，效果可靠。大孔吸附树脂近年来广泛运用于中药制剂的纯化精制领域，尤其适合于从中药提取液中分离活性成分。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种节能环保、高效迅速地从马钱子中提取、分离去除大部分士的宁的马钱子总生物碱的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种快速提取分离马钱子总生物碱的方法，包括下列步骤：
（1）闪式提取法提取马钱子粗粉；
（2）将步骤（1）所得马钱子提取液浓缩；
（3）将步骤（2）马钱子浓缩液加碱至碱性，滤除沉淀；
（4）将步骤（3）滤液用大孔吸附树脂上样，纯水洗脱杂质；
（5）将步骤（4）中纯水洗杂质后的大孔吸附树脂用乙醇洗脱，回收洗脱液中的乙醇，干燥，即得马钱子总生物碱。
本发明进一步提供上述技术方案的优选技术方案。
步骤（1）中乙醇浓度为30%～80%（v/v），溶剂用量为6～20倍马钱子粗粉（v/m），电机转速为3000～5000r/min，提取次数为1～3次，提取时间为1～2min；
步骤（2）中所述的浓缩可为常温或减压浓缩，优选为减压浓缩，药液浓缩至每100ml含马钱子20～100g；
步骤（3）中所用的ph调节剂为20%naoh，调ph值至10～13，滤除沉淀；
步骤（4）中所述的大孔吸附树脂型号为ab-8，d101，d3520，优选非极性大孔吸附树脂d101，所用吸附树脂的干重量为辣椒粗粉的1/12～1/6，纯水的用量为2～6倍柱体积；
步骤（5）中乙醇浓度为40%～95%，乙醇用量为4～10倍柱体积；
本发明采用闪式提取法提取，再应用大孔吸附树脂纯化。闪式提取法在常温下进行，提取时间仅需1～2min，具生产周期短、经济节能等优势；与回流提取法、超声提取法相比，采用闪式提取法时士的宁和马钱子碱的提取率更高。大孔吸收树脂分离纯化具有成本低廉、收率高、可再生等优点；经大孔吸附树脂分离纯化后的马钱子总生物碱中马钱子碱含量可高达75.0%，而此时总碱中士的宁含量仅为10.6%，且在制备过程中仅用乙醇为溶剂，产品无有毒溶剂的残留。因此，本发明采用闪式提取法提取马钱子，调ph后的马钱子浓缩液应用大孔吸附树脂纯化马钱子碱，本发明作为一个全新、整体的技术方案，具有制备工艺操作简便、生产周期短、成本低，节能环保等诸多优势。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行简单改进都属于本发明要求保护的范围。本发明各实施例所得的提取液均采用高效液相色谱法测定马钱子碱、士的宁的含量，色谱条件如下：色谱柱inertsustainc18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇～水（含1%甲酸和0.3%三乙胺）溶液(17：83)；流速：1ml·min-1；检测波长：马钱子碱254nm、士的宁264nm；柱温：40℃；进样量：50μl。
实施例1：
称取马钱子粗粉50.0g，置于圆底烧瓶中，第一次加50%乙醇400ml，热回流法提取2h，过滤，第二次加50%乙醇300ml，热回流法提取1.5h，过滤第三次加50%乙醇200ml，热回流法提取0.5h，过滤，合并三次滤液，用高效液相检测滤液中提取物浓度并计算提取率，滤液浓缩至恒重，计算浸膏率。
实施例2：
称取马钱子粗粉50.0g，置于圆底烧瓶中，第一次加50%乙醇400ml，超声波辅助提取法提取1h，过滤，第二次加50%乙醇300ml，超声波辅助提取法提取0.5h，过滤，第三次加50%乙醇200ml，超声波辅助提取法提取0.5h，过滤，合并三次滤液，用高效液相检测滤液中提取物浓度并计算提取率，滤液浓缩至恒重，计算浸膏率。
实施例3：
称取马钱子粗粉50.0g，置于闪式提取器中，第一次加50%乙醇400ml，闪提2min，过滤，第二次加50%乙醇300ml，闪提1min，过滤，第三次加50%乙醇200ml，闪提1min，过滤，合并三次滤液，用高效液相检测滤液中提取物浓度并计算提取率，滤液浓缩至恒重，计算浸膏率。
表1不同提取方法对活性成分提取率和浸膏率的影响
结论：由表1知三种方法中闪式提取法浸膏率最低，热回流提取4.5h和超声波2h提取的士的宁和马钱子碱有相近的提取率，而闪式提取法4min的提取率高于前两种方法，士的宁和马钱子碱的提取率均能达到百分之八十以上，体现了闪式提取高效、快速等优势。
实施例4：
称取马钱子粗粉50.0g，置于闪式提取器中，第一次加60%乙醇400ml，闪提2min，过滤，第二次加60%乙醇300ml，闪提1min，过滤，第三次加60%乙醇200ml，闪提1min，过滤，合并三次滤液，用高效液相检测滤液的浓度并计算提取率。
实施例5：
称称取马钱子粗粉50.0g，置于闪式提取器中，第一次加70%乙醇400ml，闪提2min，过滤，第二次加70%乙醇300ml，闪提1min，过滤，第三次加70%乙醇200ml，闪提1min，过滤，合并三次滤液，用高效液相检测滤液的浓度并计算提取率。
表2不同乙醇浓度提取对活性成分提取率的影响
结论：表2中60%乙醇提取效果最好，故选用60%乙醇作为提取溶剂。
实施例6
根据上述实施例4中的提取方法提取1000.0g马钱子，得滤液后将滤液减压浓缩至原体积的1/3，浓缩液平均分成三分，分别加入到预先处理好的非极性d3520、非极性d101、弱极性ab-8树脂中，吸附12h，过滤，吸附液分别取样，再分别将70%的乙醇加入到吸附饱和的树脂中，解吸12h，解吸液分别取样，高效液相色谱分别检测吸附液和解吸液，根据吸附液和解析液浓度计算吸附率、解析率。
表3三种树脂对马钱子碱的静态吸附和解吸性能
结论：由表3可以看出d101和ab-8大孔吸附树脂对士的宁和马钱子碱的吸附作用较好，强于d3520大孔吸附树脂的吸附。虽然d101和ab-8树脂对士的宁与马钱子碱的吸附率十分接近，但d101大孔吸附树脂中的马钱子碱解吸率明显高于ab-8树脂。综上，选择d101树脂分离纯化马钱子提取液。
实施例7
称取马钱子粗粉250.0g，置于闪式提取器中，第一次加60%乙醇2000ml，闪提2min，过滤，第二次加60%乙醇1500ml，闪提1min，过滤。合并两次滤液，滤液减压浓缩回收乙醇。浓缩液中加20%naoh，调ph值至13，过滤，滤液加入到预先处理好的d101型大孔吸附树脂上，先用纯水洗脱至无色；接着用10倍柱体积50%的乙醇进行洗脱，洗脱液回收乙醇，干燥，得马钱子总生物碱。
实施例8
称取马钱子粗粉250.0g，置于闪式提取器中，第一次加60%乙醇2000ml，闪提2min，过滤，第二次加60%乙醇1500ml，闪提1min，过滤。合并两次滤液，滤液减压浓缩回收乙醇。浓缩液中加20%naoh，调ph值至13，过滤，滤液加入到预先处理好的d101型大孔吸附树脂上，先用纯水洗脱至无色；接着用8倍柱体积70%的乙醇进行洗脱，洗脱液回收乙醇，干燥，得马钱子总生物碱。
实施例9
称取马钱子粗粉250.0g，置于闪式提取器中，第一次加60%乙醇2000ml，闪提2min，过滤，第二次加60%乙醇1500ml，闪提1min，过滤。合并两次滤液，滤液减压浓缩回收乙醇。浓缩液中加20%naoh，调ph值至13，过滤，滤液加入到预先处理好的d101型大孔吸附树脂上，先用纯水洗脱至无色；接着用6倍柱体积95%的乙醇进行洗脱，洗脱液回收乙醇，干燥，得马钱子总生物碱。
表4不同浓度乙醇的马钱子总生物碱洗脱量及其士的宁和马钱子碱含量