本发明涉及医药，特别是一种金银花提取物在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用。
背景技术：
脑缺血性疾病是一组由多种原因导致大脑、小脑或脑干局部或多部位供血不足，从而引起相应神经系统症状的疾病。包括反复脑缺血和局灶性脑缺血，形成病因复杂，给人的身体健康带来很大伤害，因此对反复脑缺血和局灶性脑缺血的治疗是人们非常关心的问题，但目前虽有多种药物，由于种种原因，其疗效并不尽人意，因此，研制新的治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血的药物是人们所希望解决的技术问题。
金银花，又名忍冬(学名：lonicerajaponica)，性寒，味甘，入肺、心、胃经，金银花自古被誉为清热解毒的良药，具有清热解毒、抗炎、补虚疗风的功效，它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症，均效果显著，主治胀满下疾、温病发热，热毒痈疡和肿瘤等症。其对于头昏头晕、口干作渴、多汗烦闷、肠炎、菌痢、麻疹、肺炎、乙脑、流脑、急性乳腺炎、败血症、阑尾炎、皮肤感染、痈疽疔疮、丹毒、腮腺炎、化脓性扁桃体炎等病症均有一定疗效。但至今未见有金银花提取物制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物的公开报导。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种金银花提取物在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用，可有效解决从金银花中提取金银花提取物，并作为唯一活性成分在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血的药物问题。
本发明解决的技术方案是，一种金银花提取物在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用，所述的金银花提取物是，将金银花粉碎成粗粉，乙醚回流提取脱脂，弃去乙醚；金银花药渣挥干乙醚，加质量浓度70％乙醇浸泡，回流提取，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/ml的分散液，用乙酸调节ph值，分散液上hpd-600或ab-8型大孔吸附树脂，用质量浓度30％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，粉碎，得金银花提取物。
本发明可有效解决从金银花中提取金银花提取物，并有效用于治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血，开拓了金银花的新用途和药用价值，是药物上的一大创新，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合具体情况为本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种金银花提取物在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用，所述的金银花提取物是，将金银花粉碎成过20-30目筛的粗粉，先加10倍重量的石油醚回流提取1h，脱脂，弃去石油醚；金银花药渣挥干石油醚，加金银花10倍重量的、质量浓度70％乙醇浸泡0.5h，80℃回流提取1h，过滤，得第一次滤液；药渣再加金银花10倍重量的、质量浓度70％乙醇，80℃回流提取1h，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/ml的分散液，加乙酸调ph至2.4-4.2，分散液上hpd-600或ab-8型大孔吸附树脂，分散液中金银花质量/大孔树脂质量比为1︰6-8，用质量浓度30％乙醇洗脱，以2.3bv/h的流速进行洗脱，洗脱液用量为8-12倍大孔树脂体积，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得金银花提取物。
本发明所制备的金银花提取物经实验具有抗反复脑缺血和局灶性脑缺血之功效，有效用于制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血的药物，是治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物上的创新，并经实验取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下：
实验一金银花提取物对小鼠反复脑缺血再灌注模型的影响实验
1材料
1.1动物
km种小鼠，spf级，雄性，96只，体重25～30g，由河南省实验动物中心提供，合格证号：41003100000258；实验室合格证号：syxk(豫)2010-001。
1.2药品与试剂
本发明金银花提取物；尼莫地平片，亚宝药业集团股份有限公司；氯化钠注射液，河南双鹤华利药业有限公司；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司；甲醛溶液(分析纯)，烟台市双双化工有限公司；水合氯醛，天津市光复精细化工研究所；羧甲基纤维素钠(cmc)，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；医用乙醇(酒精)，新乡市三伟消毒制剂有限公司；细胞间粘附分子1(icam-1)elisa检测试剂盒，r&d公司；肿瘤坏死因子α(tnf-α)elisa检测试剂盒，r&d公司；神经元特异性烯醇化酶(nse)elisa检测试剂盒，r&d公司；髓过氧化物酶(mpo)测试盒，南京建成生物工程研究所。
1.3仪器
电子天平，上海精密科学仪器有限公司；电子称，上海精密科学仪器有限公司；
台式低速自动平衡离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；酶标仪，美国bio-rad公司；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；玻璃匀浆器，郑州玻璃仪器厂。
2方法
2.1造模与给药
健康小鼠96只，雄性，体重25～30g，正常饲养3天，称重，随机分为6组，每组16只，分别为假手术组﹑模型组、尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组。按0.1ml/10g灌胃尼莫地平混悬液(阳性对照药，给药剂量为30mg/kg，相当于临床剂量的15倍，临用前用0.5％cmc配成药物浓度3mg/ml)，大、中、小剂量金银花提取物混悬液(给药剂量分别为100mg/kg，50mg/kg，25mg/kg，临用前用0.5％cmc配成药物浓度10mg/ml，5mg/ml，2.5mg/ml)，假手术组﹑模型组给予同体积0.5％cmc灌胃，每天给药1次，连续给药7d。
于第6天晚上8点开始分批禁食不禁水，12h后，分批称重给药，1h后，用10％水合氯醛(0.03ml/10g)腹腔注射麻醉(小鼠的翻正反射消失)，用酒精颈部消毒，然后用手术刀作颈部正中切口，逐渐分离周围肌肉，直到见到双侧颈总动脉(cca)，再用弯头精密镊剥离周围神经，分离cca，穿线备用，每个颈总动脉用直径约为0.3mm的针灸针钩起来，使成约90度，缺血10min，放松针灸针，恢复灌流10min，再缺血10min，恢复供血。创伤处敷撒青霉素粉，缝合颈部伤口。假手术组除了不阻断cca外，其它操作同造模组。
2.2检测指标和检测方法
2.2.1检测指标
所有小鼠再灌注24h后，摘眼球取血，静置半小时后，3500r/min离心10min，取血清，测血清中nse、mpo含量。脱颈椎处死，迅速取脑，矢状切取一半放入10％福尔马林液中，固定一周，石蜡包埋，作he染色，观察脑组织形态学改变；另一半用生理盐水冲洗上面的血迹，再用滤纸上吸干净上面的生理盐水，准确称量其重量，根据此重计算该加入的冰冷的生理盐水量，以生理盐水(ml)：脑组织(g)＝9∶1的比例在盛有冰块的大烧杯中用玻璃匀浆器制成10％的脑匀浆，4℃，3000r/min离心10min，取上清液于-20℃以下低温保存，分别测定脑匀浆中icam-1、tnf-α含量。
2.2.2血清中nse的测定方法
检测原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(elisa)。往预先包被神经元烯醇化酶(nse)蛋白抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、hrp标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物tmb显色，tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的神经元烯醇化酶(nse)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，计算样品浓度。
操作步骤：从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃保存。设置标准品孔和样本孔，标准品孔加各种不同浓度的标准品50μl；样本孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(hpr)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值。
绘制标准曲线：在excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应od值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
2.2.3血清中mpo的测定方法
血清中mpo测定顺序表
混匀，60℃水浴10分钟，取出后立即在460nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值。
计算公式：
mpo活力(单位/升)＝(测定od值-对照od值)÷(11.3×取样量(升))
2.2.4脑组织中icam-1的测定方法
检测原理、操作步骤：同神经元烯醇化酶(nse)。
2.2.5脑组织中tnf-α的测定方法
检测原理、操作步骤：同神经元烯醇化酶(nse)。
3统计学处理方法
数据分析用spss17.0统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差
4结果
4.1对反复脑缺血再灌注模型小鼠死亡率、血清nse、mpo水平的影响(结果见表1)
表1金银花提取物对反复脑缺血再灌注模型小鼠死亡率、血清nse、mpo水平的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
由上表可以看出，模型组的死亡率最高，尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组小鼠的死亡率均有所降低，说明给药各组均能不同程度的降低反复脑缺血再灌注模型小鼠死亡率，减少脑组织损伤，保护脑组织。与假手术组比，模型组小鼠血清nse、mpo水平均显著升高(p<0.01)，说明造模成功；与模型组比，尼莫地平组小鼠血清nse、mpo水平明显降低(p<0.05)，大剂量金银花提取物组小鼠血清nse水平显著降低(p<0.01)，中、小剂量金银花提取物组小鼠血清nse水平有降低趋势(p＞0.05)，大、中剂量金银花提取物组小鼠血清mpo水平显著降低(p<0.01)，小剂量金银花提取物组小鼠血清mpo水平明显降低(p<0.05)，说明给药各组具有不同程度的保护反复脑缺血再灌注模型小鼠神经元，降低血清nse、mpo水平的作用。
4.2对反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织icam-1、tnf-α水平的影响(结果见表2)
表2金银花提取物对反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织icam-1、tnf-α水平的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
由上表可以看出，与假手术组比，模型组小鼠脑组织icam-1、tnf-α水平均显著上升(p<0.01)，说明造模成功；与模型组比，尼莫地平组、大剂量金银花提取物组小鼠脑组织icam-1水平显著降低(p<0.01)，中剂量金银花提取物组小鼠脑组织icam-1水平明显降低(p<0.05)，小剂量金银花提取物组小鼠脑组织icam-1水平有降低趋势(p＞0.05)，尼莫地平组、大、中剂量金银花提取物组小鼠脑组织tnf-α水平显著降低(p<0.01)，小剂量金银花提取物组小鼠脑组织tnf-α水平明显降低(p<0.05)，说明给药各组具有降低反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织icam-1、tnf-α水平，减轻炎症反应对脑组织损伤的作用。
4.3对反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织皮质区病理变化的影响(结果见表3)
对反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织皮质区组织病理观察如下：假手术组大脑皮质神经细胞正常；模型组大脑皮质神经细胞水肿，大部分神经元坏死；尼莫地平组大脑皮质少数神经细胞水肿，少数神经元变性，胞浆淡染，结构模糊，个别神经元坏死；大剂量金银花提取物组大脑皮质少数神经细胞水肿，散在、少数神经元变性，胞浆淡染，结构模糊；中剂量金银花提取物组大脑皮质部分神经细胞水肿，散在、少数神经元变性，胞浆淡染，结构模糊，个别神经元坏死；小剂量金银花提取物组大脑皮质神经细胞水肿，成片神经元变性，胞浆淡染，结构模糊，个别神经元坏死。
表3金银花提取物对反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织皮质区病理变化的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
“—”神经细胞正常；“+”大脑皮质神经细胞水肿，散在、少数神经元变性，胞浆淡染，结构模糊；“++”大脑皮质神经细胞水肿，成片神经元变性，胞浆淡染，结构模糊，个别神经元坏死；“+++”大脑皮质神经细胞水肿，大部分神经元坏死。
经ridit检验，与假手术组比，模型组有显著的统计学意义(p<0.01)，说明模型组小鼠脑组织皮质区出现显著的病理变化，造模成功；与模型组比，尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组有显著的统计学意义(p<0.01)，说明各给药组能显著改善反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织皮质区的病理损伤程度，保护脑组织。
4.4对反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织海马区病理变化的影响(结果见表4)
对反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织海马区组织病理观察如下：假手术组大脑海马神经细胞正常；模型组大脑海马神经细胞水肿，大部分神经元坏死；尼莫地平组大脑海马少数神经细胞水肿，少数神经元变性，胞浆淡染，结构模糊，个别神经元坏死；大剂量金银花提取物组大脑海马少数神经细胞水肿，散在、少数神经元变性，胞浆淡染，结构模糊；中剂量金银花提取物组大脑海马部分神经细胞水肿，散在、少数神经元变性，胞浆淡染，结构模糊，个别神经元坏死；小剂量金银花提取物组大脑海马神经细胞水肿，成片神经元变性，胞浆淡染，结构模糊，个别神经元坏死。
表4金银花提取物对反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织海马区病理变化的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
“—”神经细胞正常；“+”大脑海马神经细胞水肿，散在、少数神经元变性，胞浆淡染，结构模糊；“++”大脑海马神经细胞水肿，成片神经元变性，胞浆淡染，结构模糊，个别神经元坏死；“+++”大脑海马神经细胞水肿，大部分神经元坏死。
经ridit检验，与假手术组比，模型组有显著的统计学意义(p<0.01)，说明模型组小鼠脑组织海马区出现显著的病理变化，造模成功；与模型组比，尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组有显著的统计学意义(p<0.01)，说明各给药组能显著改善反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织海马区的病理损伤程度，保护脑组织。
5小结
通过观察金银花提取物对小鼠反复脑缺血再灌注模型的死亡率、血清nse、mpo水平、脑组织中icam-1、tnf-α水平、脑组织病理损伤变化的影响，提示金银花提取物可降低动物死亡率、降低血清nse、mpo水平和脑组织icam-1、tnf-α水平，减轻炎症反应对脑组织的损伤，保护神经元，减轻脑缺血再灌注对脑组织神经细胞的损伤，以大剂量金银花提取物组为最佳。
实验二金银花提取物对小鼠局灶性脑缺血再灌注模型脑梗死面积及血清s-100β蛋白的影响实验
1材料
1.1动物
km种小鼠，spf级，雄性，96只，体重25～30g，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，合格证号：0017138；实验室合格证号：syxk(豫)2010-001。
1.2药品与试剂
本发明金银花提取物；氯化钠注射液，河南双鹤华利药业有限公司；尼莫地平片，亚宝药业集团股份有限公司；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司；甲醛溶液(分析纯)，烟台市双双化工有限公司；水合氯醛，天津市光复精细化工研究所；羧甲基纤维素钠(cmc)，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；医用乙醇(酒精)，新乡市三伟消毒制剂有限公司；红四氮唑(ttc)，上海山浦化工有限公司；磷酸氢二钠，天津市致远化学试剂有限公司；磷酸二氢钠，天津市化学试剂三厂；s-100β蛋白elisa检测试剂盒，r&d公司。
1.3仪器
mcao线栓，北京沙东生物技术有限公司；电子天平，上海精密科学仪器有限公司；电子称，上海精密科学仪器有限公司；台式低速自动平衡离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；酶标仪，美国bio-rad公司；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；专业图像分析系统，nis-elementsar4.10.01；超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；玻璃匀浆器，郑州玻璃仪器厂。
2方法
2.1造模与给药
取健康小鼠96只，雄性，体重25～30g，正常饲养3天，称重，随机分6组，每组16只，分别为假手术组﹑模型组、尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组。按0.1ml/10g灌胃尼莫地平混悬液(阳性对照药，给药剂量为30mg/kg，相当于临床剂量的15倍，临用前用0.5％cmc配成药物浓度3mg/ml)，大、中、小剂量金银花提取物混悬液(给药剂量分别为100mg/kg，50mg/kg，25mg/kg，临用前用0.5％cmc配成药物浓度10mg/ml，5mg/ml，2.5mg/ml)，假手术组﹑模型组给予同体积0.5％cmc灌胃，每天给药1次，连续给药7d。
于第6天晚上8点开始分批禁食不禁水，第7天上午8点分批称重给药1h后，用10％水合氯醛(0.03ml/10g)腹腔注射麻醉小鼠，小鼠麻醉后，颈部正中偏左切口，逐层分离暴露左侧颈总动脉(cca)，颈外动脉(eca)、颈内动脉(ica)，结扎颈总动脉和颈外动脉，用动脉夹阻断颈内动脉，于颈总动脉距离分叉1mm处剪一个约0.2mm宽的小口，将线栓插入，经颈总动脉分叉部进入颈内动脉，向上深入至分叉以上8～10mm，直至有阻力，即阻断大脑中动脉入口处，结扎颈内动脉切口和栓线，2h后轻轻抽出栓线，实现再灌注，造大脑中动脉阻塞-再灌注(mcao)动物模型。假手术组只暴露左侧血管不做插线处理。
2.2检测指标和检测方法
2.2.1检测指标
所有小鼠再灌注22h后，对造模小鼠进行神经功能缺失评分：采用longa[13]标准进行评分。评分标准：0分：无神经功能缺失症状，活动正常；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：爬行时出现向偏瘫侧转圈；3分：行走时，身体向偏瘫侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失；5分：死亡。评分为0分和5分者剔除；摘眼球取血，静置半小时后，3500r/min离心10min，取血清，测血清中s-100β蛋白含量。小鼠脱颈椎处死，迅速剥取脑组织，置于-20℃冰箱冷冻15min，去掉小脑、嗅球和低位脑干后的剩余部分，冠状面切四刀，将大脑均匀切成五片，然后迅速将脑片置于以ph＝7.2磷酸缓冲液配置的1％ttc染液中，在37℃水浴、避光条件下孵育10min。取出后置于10％福尔马林液中避光保存24h。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗死区为白色。数码相机拍照，用图像分析软件分别计算五个脑片共10个平面的总面积和梗死区域的面积，求出梗死区域面积占总面积的百分比。
2.2.2血清中s-100β的测定方法
检测原理、操作步骤：同实验一中神经元烯醇化酶(nse)。
3统计学处理方法
数据分析用spss17.0统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差
4结果
4.1对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠死亡率和神经功能缺失评分的影响(结果见表5)
表5金银花提取物对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠死亡率和神经功能缺失评分的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
由上表可以看出，模型组的死亡率最高，尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组小鼠的死亡率均有所降低，说明给药各组均能不同程度的降低局灶性脑缺血再灌注模型小鼠死亡率，减少脑组织损伤，保护脑组织。与假手术组比，模型组小鼠神经功能缺失评分显著升高(p<0.01)，说明造模成功；与模型组比，尼莫地平组、大剂量金银花提取物组小鼠神经功能缺失评分显著降低(p<0.01)，中剂量金银花提取物组小鼠神经功能缺失评分明显降低(p<0.05)，小剂量金银花提取物组具有降低局灶性脑缺血再灌注小鼠神经功能缺失评分的趋势(p＞0.05)，说明给药各组具有不同程度的改善局灶性脑缺血再灌注小鼠脑神经功能的作用。
4.2对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠血清s-100β水平和脑梗死面积百分比的影响(结果见表6)
表6金银花提取物对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠血清s-100β水平和脑梗死面积百分比的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
由上表可以看出，与假手术组比，模型组小鼠血清s-100β水平、脑梗死面积百分比显著升高(p<0.01)，说明造模成功；与模型组比，尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组小鼠血清s-100β水平、脑梗死面积百分比均显著降低(p<0.01)，说明给药各组均具有不同程度的保护局灶性脑缺血再灌注模型小鼠脑细胞和神经系统功能，降低血清s-100β水平和脑梗死面积的作用。
5结论
通过观察金银花提取物对小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的死亡率、神经功能缺失评分、脑梗死面积百分比、血清s-100β蛋白水平的影响，提示金银花提取物可以降低动物死亡率、神经功能缺失评分以及脑梗死面积百分比，降低血清s-100β蛋白水平，对脑组织和神经元具有一定的保护作用，以大剂量金银花提取物组为最佳。
实验三金银花提取物对小鼠局灶性脑缺血再灌注模型脑匀浆生化指标及脑组织形态的影响实验
1材料
1.1动物
km种小鼠，spf级，雄性，96只，体重25～30g，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，合格证号：0017138；实验室合格证号：syxk(豫)2010-001。
1.2药品与试剂
本发明金银花提取物；氯化钠注射液，河南双鹤华利药业有限公司；尼莫地平片，亚宝药业集团股份有限公司；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司；甲醛溶液(分析纯)，烟台市双双化工有限公司；水合氯醛，天津市光复精细化工研究所；羧甲基纤维素钠(cmc)，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；医用乙醇(酒精)，新乡市三伟消毒制剂有限公司；b细胞淋巴瘤因子2(bcl-2)elisa检测试剂盒，r&d公司；bcl-2相关x蛋白(bax)elisa检测试剂盒，r&d公司；半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)elisa检测试剂盒，r&d公司；考马斯亮蓝蛋白定量测试盒，南京建成生物工程研究所；三磷酸腺苷(atp)酶测试盒，南京建成生物工程研究所。
1.3仪器
mcao线栓，北京沙东生物技术有限公司；电子天平，上海精密科学仪器有限公司；电子称，上海精密科学仪器有限公司；台式低速自动平衡离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；酶标仪，美国bio-rad公司；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；玻璃匀浆器，郑州玻璃仪器厂。
2方法
2.1造模与给药
取健康小鼠96只，雄性，体重25～30g，正常饲养3天，称重，随机分6组，每组16只，分别为假手术组﹑模型组、尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组。按0.1ml/10g灌胃尼莫地平混悬液(阳性对照药，给药剂量为30mg/kg，相当于临床剂量的15倍，临用前用0.5％cmc配成药物浓度3mg/ml)，大、中、小剂量金银花提取物混悬液(给药剂量分别为100mg/kg，50mg/kg，25mg/kg，临用前用0.5％cmc配成药物浓度10mg/ml，5mg/ml，2.5mg/ml)，假手术组﹑模型组给予同体积0.5％cmc灌胃，每天给药1次，连续给药7d。
于第6天晚上8点开始分批禁食不禁水，第7天上午8点分批称重给药1h后，用10％水合氯醛(0.03ml/10g)腹腔注射麻醉小鼠，小鼠麻醉后，颈部正中偏左切口，逐层分离暴露左侧颈总动脉(cca)，颈外动脉(eca)、颈内动脉(ica)，结扎颈总动脉和颈外动脉，用动脉夹阻断颈内动脉，于颈总动脉距离分叉1mm处剪一个约0.2mm宽的小口，将栓线插入，经颈总动脉分叉部进入颈内动脉，向上深入至分叉以上8～10mm，直至有阻力，即阻断大脑中动脉入口处，结扎颈内动脉切口和栓线，2h后轻轻抽出栓线，实现再灌注，造大脑中动脉阻塞-再灌注(mcao)动物模型。假手术组只暴露左侧血管不做插线处理。
2.2检测指标和检测方法
2.2.1检测指标
所有小鼠再灌注22h后，对造模小鼠进行神经功能缺失评分：采用longa标准进行评分。评分标准：0分：无神经功能缺失症状，活动正常；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：爬行时出现向偏瘫侧转圈；3分：行走时，身体向偏瘫侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失；5分：死亡。评分为0分和5分者剔除；小鼠脱颈椎处死，迅速取脑，矢状切取左半脑，弃去右半脑。将左半脑的一半放入10％福尔马林液中，固定一周，石蜡包埋，作he染色观察脑组织形态学改变；另一半用生理盐水冲洗上面的血迹，再用滤纸上吸干净上面的生理盐水，准确称量其重量，根据此重计算该加入的冰冷的生理盐水量，以生理盐水(ml)：脑组织(g)＝9∶1的比例在盛有冰块的大烧杯中用玻璃匀浆器制成10％的脑匀浆，4℃，3000r/min离心10min，取上清液于-20℃以下低温保存，分别测定脑匀浆中bax、bcl-2、caspase-3、atp酶。
2.2.2脑组织中bax、bcl-2、caspase-3的测定方法
检测原理、操作步骤：同实验一中神经元烯醇化酶(nse)。
2.2.3考马斯亮蓝蛋白定量测试盒的测定方法
考马斯亮兰蛋白测定操作顺序表
混匀，静置10分钟，波长595nm处，光径1cm，双蒸水调零，测各管吸光度值。
计算公式：
2.2.4脑组织中atp酶的测定方法
脑匀浆中atp酶测定操作顺序表
测试前a、b、c五种混合试剂的配制
酶促反应
混匀，37℃水浴30分钟，冷却至室温，在660nm处，1cm光径，蒸馏水调零比色。
注：a管为对照管；b管为na+k+-atp酶管；c管为mg++-atp酶管；
计算公式：
组织中atp活力(μmolpi/mgprot/hour)＝(测定管od值－对照管od值)÷标准管od值×标准管浓度(0.5μmol/ml)×反应体系中样品稀释倍数(2.5)×6÷匀浆蛋白浓度(mgprot/ml)
3统计学处理方法
数据分析用spss17.0统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差
4结果
4.1对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠死亡率和神经功能缺失评分的影响(结果见表7)
表7金银花提取物对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠死亡率和神经功能缺失评分的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
由上表可以看出，模型组的死亡率最高，尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组小鼠的死亡率均有所降低，说明给药各组均能不同程度降低局灶性脑缺血再灌注模型小鼠死亡率，减少脑组织损伤，保护脑组织。与假手术组比，模型组小鼠神经功能缺失评分显著升高(p<0.01)，说明造模成功；与模型组比，大剂量金银花提取物组小鼠神经功能缺失评分显著降低(p<0.01)，中剂量金银花提取物组小鼠神经功能缺失评分明显降低(p<0.05)，尼莫地平组、小剂量金银花提取物组小鼠神经功能缺失评分有降低趋势(p＞0.05)，说明给药各组具有不同程度的改善局灶性脑缺血再灌注小鼠脑神经功能的作用。
4.2对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织bax、bcl-2、caspase-3水平的影响(结果见表8)
表8金银花提取物对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织bax、bcl-2、caspase-3水平的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
由上表可以看出，与假手术组比，模型组小鼠脑组织bax、caspase-3水平显著升高，说明小鼠脑组织中促细胞凋亡因子增加，造模成功；与模型组比，尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组小鼠脑组织bax、caspase-3水平均显著降低(p<0.01)，尼莫地平组、大、中、小剂量金银花提取物组小鼠脑组织bcl-2水平均显著升高(p<0.01)，说明给药各组能不同程度增加局灶性脑缺血模型小鼠脑组织中抑细胞凋亡基因水平，降低促细胞凋亡基因水平，抑制细胞凋亡，从而保护脑组织，缓解脑缺血症状。
4.3对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠na+k+-atp酶活力和mg++-atp酶活力的影响(结果见表9)
表9金银花提取物对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠na+k+-atp酶和mg++-atp酶活力的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
由上表可以看出，与假手术组比，模型组小鼠脑组织na+-k+-atp酶和mg++-atp酶活力均显著降低(p<0.01)，说明造模成功；与模型组比，尼莫地平组、大、中剂量金银花提取物组小鼠脑组织na+-k+-atp酶活力均显著升高(p<0.01)，小剂量金银花提取物组小鼠脑组织na+-k+-atp酶活力明显升高(p<0.05)，尼莫地平组、大剂量金银花提取物组小鼠脑组织mg++-atp酶活力均显著升高(p<0.01)，中剂量金银花提取物组小鼠脑组织mg++-atp酶活力明显升高(p<0.05)，小剂量金银花提取物组小鼠脑组织mg++-atp酶活力有升高趋势(p＞0.05)，说明给药各组能不同程度升高局灶性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织atp酶活力，缓解脑组织能量代谢障碍。
4.3对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织皮质区病理变化的影响(结果见表10)
对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织皮质区组织病理观察结果如下：假手术组大脑皮质无水肿，神经细胞正常；模型组大脑皮质神经细胞水肿，大片神经元坏死，梗死面积占左侧皮质总面积的2/3以上；尼莫地平组大脑皮质部分神经细胞水肿，少数神经元坏死，梗死面积占左侧皮质总面积的1/3以内；大剂量金银花提取物组大脑皮质神经细胞水肿，少数神经元坏死，梗死面积占左侧皮质总面积的1/3以内；中剂量金银花提取物组大脑皮质神经细胞水肿，少数神经元坏死，梗死面积占左侧皮质总面积的1/3～2/3以内；小剂量金银花提取物组大脑皮质神经细胞水肿，成片神经元坏死，梗死面积占左侧皮质总面积的1/3～2/3以内。
表10金银花提取物对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织皮质区病理变化的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
“—”大脑皮质无水肿，神经细胞正常；“+”大脑皮质神经细胞水肿，少数神经元坏死，梗死面积占左侧皮质总面积的1/3以内；“++”大脑皮质神经细胞水肿，成片神经元坏死，梗死面积占左侧皮质总面积的1/3～2/3以内；“+++”大脑皮质神经细胞水肿，大片神经元坏死，梗死面积占左侧皮质总面积的2/3以上。
经ridit检验，与假手术组比，模型组有显著的统计学意义(p<0.01)，说明模型组小鼠脑组织皮质区出现显著的病理变化，造模成功；与模型组比，尼莫地平组、大剂量金银花提取物组有显著的统计学意义(p<0.01)，中剂量金银花提取物组有明显的统计学意义(p<0.05)，小剂量金银花提取物组无统计学意义(p＞0.05)，说明各给药组能不同程度的改善局造性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织皮质区的病理损伤程度，保护脑组织。
4.4对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织海马区病理变化的影响(结果见表11)
对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织海马区组织病理观察如下：假手术组大脑海马组织无水肿，神经细胞正常；模型组大脑海马组织水肿，大片神经元坏死，梗死面积占左侧海马组织的2/3以上；尼莫地平组大脑海马部分组织水肿，少数神经元坏死，梗死面积占左侧海马组织的1/3以内；大剂量金银花提取物组大脑海马组织水肿，少数神经元坏死，梗死面积占左侧海马组织的1/3以内；中剂量金银花提取物组大脑海马组织水肿，少数神经元坏死，梗死面积占左侧海马组织的1/3～2/3以内；小剂量金银花提取物组大脑海马组织水肿，成片神经元坏死，梗死面积占左侧海马组织的1/3～2/3以内。
表11对局灶性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织海马区病理变化的影响
注：与模型组比，**p<0.01，*p<0.05
“—”大脑海马组织无水肿，神经细胞正常；“+”大脑海马组织水肿，少数神经元坏死，梗死面积占左侧海马组织的1/3以内；“++”大脑海马组织水肿，成片神经元坏死，梗死面积占左侧海马组织的1/3～2/3以内；“+++”大脑海马组织水肿，大片神经元坏死，梗死面积占左侧海马组织的2/3以上。
经ridit检验，与假手术组比，模型组有显著的统计学意义(p<0.01)，说明模型组小鼠脑组织海马区出现显著的病理变化，造模成功；与模型组比，尼莫地平组、大、中剂量金银花提取物组有显著的统计学意义(p<0.01)，小剂量金银花提取物组有明显的统计学意义(p<0.05)，说明各给药组能不同程度的改善局造性脑缺血再灌注模型小鼠脑组织海马区的病理损伤程度，保护脑组织。
5结论
通过观察金银花提取物对小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的死亡率、神经功能缺失评分、脑组织中bax、bcl-2、caspase-3、atp酶水平、脑组织病理损伤变化的影响，提示金银花提取物可以降低动物死亡率、神经功能缺失评分，改善脑组织的损伤情况，提高bcl-2水平，降低bax、caspase-3水平，抑制神经细胞凋亡，升高atp酶水平，改善因能量代谢障碍对缺血脑组织的损伤，以金银花提取物大剂量组为最佳。
6临床实验资料
氯吡格雷加用金银花提取物治疗短暂脑缺血(中危层)60例
选择符合全国第四次脑血管病学术会议制订的短暂脑缺血诊断标准:即为短暂的、可逆的、局部的脑血液循环障碍，可反复发作，少者1～2次，多至数十次，每次发作持续时间通常在数分钟至1h左右，症状和体征应该在24h内完全消失。
abcd2评分标准:年龄＞60岁(1分)；血压为收缩压＞140mmhg或舒张压＞90mmhg(1分)；临床症状为单侧无力(2分)，不伴无力的言语障碍(1分)；症状持续时间＞60min(2分)，10～59min(1分)；患有糖尿病(1分)。危险分层:0～3分为低危组；4～5分为中危组；6～7分为高危组。
选择abcd2评分标准在中危层的患者60人，随机分为2组，每组30人，对照组口服氯吡格雷(商品名为波立维，75mg/片，法国赛诺菲公司)，每次75mg，1d1次，首剂300mg。治疗组除按对照组方法服用氯吡格雷外，加用金银花提取物(提取物制成胶囊，每粒0.25g，每次1粒，每天2次)。以上两组均治疗30d，治疗期间常规调控血压及血糖，停用其他能够影响凝血功能的药物。
氯吡格雷组与氯吡格雷加用金银花提取物组7d内短暂脑缺血发作终止的例数分别为24例、26例，7d内短暂脑缺血发作终止时的时间分别为(0.96±1.11)d、(0.62±1.18)d，7d后仍有发作的例数分别为6例、4例，30d内短暂脑缺血加重的例数分别为2例、0例。加用金银花提取物治疗组总体疗效优于常规氯吡格雷治疗组。
从上述实验中可以清楚的看出，本发明从金银花中提取的金银花提取物具有抗脑缺血之功效，有效用于制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血的药物，实现金银花提取物在制备治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用，其制备方法简单，易操作，开拓了金银花新的药用价值和商业价值，是治疗反复脑缺血和局灶性脑缺血药物上的创新，经济和社会效益显著。