本发明涉及美容护肤品及美容护肤品制备方法的技术领域，尤其涉及一种载外源性表皮生长因子的羊膜面膜及其制备方法。
背景技术：
面膜作为一种常见的美容产品，因其使用便捷、效果好而广受消费者喜爱，自2013年以来，面膜已成为大众化妆品消费的第一选择；目前市场上售卖的面膜按功效可分为营养面膜、清洁面膜、补水(保湿)面膜、美白面膜、滋养面膜、抗皱面膜、祛斑面膜、修复面膜8大类；按面膜的材质分类，有无纺布、蚕丝、生物纤维、泥膜等；各种面膜的品种达数百种之多。
面膜作为快速、有效改变肌肤状况的护肤类产品，近几年的发展呈现出飞速增长趋势；其关注点是：(1)提倡发展生物面膜产品，减少或消除化学成分面膜。目前生物纤维面膜是国内仅有的生物类面膜产品，其优势之处在于：①生物面膜具有良好的亲水性、透氧性、粘附性；②与皮肤有良好的帖合度；③对皮肤无刺激、无损伤。2007年，第一个隐形面膜诞生，是将原用于医学界处理烫伤专用之仿生真皮——“隐形薄膜”演变成当今美容行业面膜的顶级材质；隐形面膜符合人体脸部工学设计，超强贴合度可以最大限度地保留并补充肌肤所需的水分和养分的面膜，隐形面膜是仿造人体皮肤表皮组织的天然材料，承托高浓度精华液，可贴于整个面部，与肌肤完全贴合，且具有良好的通透性，保证肌肤的正常呼吸，阻隔空气中的污染物。(2)开发天然、绿色无刺激性的面膜材料与面膜产品。生物纤维面膜是由木醋杆菌自然发酵制成的纤维体，具有类似皮肤的功能；该面膜质地非常柔软，弹性好，韧性强，无刺激无异味，不易生长细菌、不含荧光物质，容易清洗，是纯天然健康环保用品；由于具有不被人体排斥的特性，在医学界被用来作为心血管修复与人造皮肤使用；鉴于上述特点，生物纤维素面膜在市场广受青睐。(3)多功能、多用途性。面膜所承载的功能众多：营养、美白、清洁、补水、美白、滋养、抗皱、修复等，所以，一款产品所具备的功能越多越好，这就要求面膜产品具有多功能性和多用途性，从而满足广大消费者日益增长的要求。
纵观国内外的面膜产品，缺乏真正意义的生物面膜，表现为化学成分添加或面膜载帖物的非生物源性。
羊膜是众多哺乳动物胎盘的一种重要结构，为一种透明、有韧性，无神经、血管、淋巴管分布的天然生物膜，其厚度约0.02～0.05mm。羊膜由5层组织结构：上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维细胞层及海绵层。上皮细胞层含有羊膜上皮细胞和由羊膜上皮细胞分泌的各种生物活性成份，上皮细胞合成并分泌基质成份，维持膜的稳定性。基底膜以网状纤维为主，富含具硫酸肝素的蛋白多糖，是羊膜中发挥屏障作用的组织结构。致密层薄而致密，起支撑和滤过作用。
羊膜是一种天然高分子生物材料，含有胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分，表达多种生长因子及mrna相关蛋白，可为细胞的增殖、分化提供丰富的营养与功能成分，有利于细胞的生长繁殖和新陈代谢，是羊膜在医学临床广泛应用的结构基础，根据羊膜内生物活性成分研究的现状和作用将其分为三大类：即基质成分、生长因子和酶类。
羊膜中的生长因子有多种，如表皮生长因子(egf)、转化生长因子(tgf)、角质细胞生长因子(kgf)、肝细胞生长因子(hgf)和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)等，它们主要存在于羊膜的表皮细胞中。已经证实的生物学功能是：促进表皮细胞、基质细胞的增殖、移行与趋化，维持表皮组织的完整性；刺激表皮生长，增加细胞的能动性，促进表皮组织的修复、愈合。
(1)表皮生长因子(egf)：egf是一种由53个氨基酸组成、分子量6kd的多肽类结构。在新鲜的天然羊膜中，egf的浓度为1.0pg/mg，该浓度是正常组织中egf浓度的10倍，表明新鲜羊膜在促进表皮组织增殖、分化与修复方面具有天然的优势。
egf是体内最强的细胞因子之一，能刺激体内多种类型的组织细胞进行分裂与增殖，在相同的条件下，是角质细胞生长因子(kgf)、肝细胞生长因子(hgf)的10倍以上。此外，egf还对成纤维细胞的生长及胶原的沉积有明显的促进作用，且具有浓度依赖性，这种作用与羊膜抑制纤维化的结果并不矛盾，体现了细胞因子间相互作用的复杂性。
(2)角质细胞生长因子(kgf)：kgf是一条具有163个氨基酸残基的单链多肽，已证实有促进表皮源性细胞的分裂、增生作用，但对成纤维细胞无此作用。有实验表明，kgf在1～100ng/mg浓度有明显的促进人角膜表皮细胞dna合成、细胞增生的作用，且呈剂量依赖性。新鲜羊膜中kgf的浓度显著高于此浓度，因而产生明显的表皮修复作用。
(3)肝细胞生长因子(hgf)：hgf是一种生物学作用尚未完全明了的多向性因子，能刺激各种靶细胞生长，包括肝细胞、表皮细胞、内皮细胞、角质细胞和造血细胞。对视网膜色素表皮细胞除具有促进其增殖的能力外，还有重塑视网膜结构的功能。hgf的另一重要作用是增加细胞的能动性，有利于表皮细胞修复。它能改变细胞旁连接阻力，使被动离子流经表皮的阻力降低，通过影响表皮细胞移行速度和延伸反应加快创面愈合。新鲜羊膜中hgf的浓度为44.7pg/mg，较正常组织中的9.4pg/mg显著为高，而高浓度的hgf即与其表皮组织修复作用有关。
(4)转化生长因子(tgf)：tgf包括tgf-α和tgf-β两种，二者之间具有相互竞争效应。tgf-α可刺激细胞合成dna，诱导表皮细胞形成单层集落，促进组织修复。在羊膜中tgf-α的含量为0.7pg/mg，在临床是角膜表皮细胞健康状态的指示因子。tgf-β具有5个亚型，羊膜中主要以tgf-β1和tgf-β2为主。tgf-β对表皮细胞的移行没有影响，但能抑制egf对表皮细胞移行的刺激作用，说明tgf-β可能在表皮细胞的愈合过程中起修饰作用，其意义在于局部存在的tgf-β可能有避免过度增殖的功能。大量的研究表明，羊膜通过有效地抑制tgf-β信号系统的表达，抑制肌纤维细胞分化，从而抑制瘢痕形成。
(5)碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)：bfgf是哺乳动物组织中普遍存在的一种微量蛋白，能诱导神经外胚层和中胚层来源的细胞增殖与分化。它能有效地刺激体外培养的动物及人的眼表和视网膜色素细胞增殖，与egf不同的是，bfgf主要是促进基质成纤维细胞的增殖、移行与分化。
羊膜组织的抗原性极低，不引起异物反应，这是因为羊膜的上皮细胞层未表达白细胞抗原(hla-ii)，导致其缺乏免疫原性；羊膜取材方便，来源广泛，成本低，在医学临床作为一种生物学重建材料而广泛应用；羊膜还具有抑制炎症、减少纤维化、降低疼痛等生物学作用，此外，天然羊膜还具有一定的抗感染能力，有人(uberti等，2011)报道，巨噬细胞杀灭大肠杆菌的能力与羊膜源性细胞因子溶液的浓度呈正相关关系。
羊膜的种种生物学特性表明，把动物(绵羊、山羊、鹿)羊膜用作制备面膜在技术上是可行的，并克服了使用人类羊膜而产生的伦理和道德问题：首先，动物(绵羊、山羊、鹿)羊膜来源广泛，成本低廉；其次不存在因种间差异而产生的排异反应，且种间差异越大其生物学效应越好；第三，国内外大量的羊胎盘产品(如各种胎盘素、冻干粉、胶囊、口服液及外用产品等)通过注射、口服、外用的方式用于人类，其安全性、有效性毋容质疑，然而目前没有现有技术采用羊膜作为面膜的制备原料。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种载外源性表皮生长因子的羊膜面膜及其制备方法，以解决现有的化学成分面膜刺激和损害皮肤，生物面膜含化学成分添加或面膜载帖物具有非生物源性，生物面膜品种单一、功效单一，羊膜用途较少等技术问题。
本发明所解决的技术问题可以采取以下方案来实现：一种载外源性表皮生长因子的羊膜面膜，其特征在于：所述面膜包括面膜载贴物及贴合于所述面膜载贴物上的羊膜基膜，所述羊膜基膜由动物胎盘羊膜经去除海绵层和纤维细胞层并保留上皮细胞层、基底膜及致密层而制成，所述羊膜基膜不与面膜载贴物贴合的一面载有外源性表皮生长因子。
上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜：所述羊膜基膜不与面膜载贴物贴合的一面为所述羊膜基膜的上皮细胞层。
上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜：所述外源性表皮生长因子为重组人表皮生长因子rhegf。
上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜：所述羊膜基膜的上皮细胞层经浸渍重组人表皮生长因子rhegf溶液而载有重组人表皮生长因子rhegf，所述重组人表皮生长因子rhegf溶液的浓度为0.8～1.2pg/mg。
上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜：进行浸渍时将所述羊膜基膜的上皮细胞层在15～20℃的温度条件用重组人表皮生长因子rhegf溶液浸渍30min以上。
上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜：所述面膜载贴物为纤维蛋白胶膜，所述纤维蛋白胶膜由哺乳动物血液纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液混合、凝固制成。
上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜：所述羊膜基膜由动物胎盘羊膜经去除海绵层和纤维细胞层并保留上皮细胞层、基底膜及致密层之后，先经滋养液滋养、再经消毒液消毒而制成。
上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜：所述滋养液为在生理盐水中添加维生素c及硫酸软骨素，所述消毒液为在蒸馏水中添加质量分数为15％～20％的过氧乙酸。
上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜：每1000ml所述生理盐水中添加8～12g的所述维生素c以及8～12g的所述硫酸软骨素，每1000ml所述蒸馏水中添加10～15ml的所述过氧乙酸。
上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜：在进行滋养时将羊膜置于所述滋养液中，在18～23℃的温度条件下浸渍30分钟以上，在进行消毒时将羊膜用所述消毒液在18～23℃的温度条件下浸泡4小时以上。
上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜：提供所述动物胎盘的动物为山羊或绵羊或鹿。
一种用于制备上述的载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)制备羊膜基膜：具体包括如下制备步骤：(a)动物健康检查：检查、评估胎盘供体活体的健康状况，选择健康供体；(b)胎盘收取与清洗：收取所选择的健康供体的胎盘，并对收取的胎盘进行清洗；(c)羊膜分离与加工：将羊膜从经清洗后的胎盘上分离，分离后的羊膜首先剥离子叶，之后去除所述海绵层和纤维细胞层形成羊膜基膜；(2)羊膜基膜处理：将经步骤(1)制好的所述羊膜基膜在外源性表皮生长因子溶液中浸渍后取出；(3)载外源性表皮生长因子的羊膜基膜的处理：将经步骤(2)处理得到的载外源性表皮生长因子的羊膜基膜置于滋养液中进行滋养，之后使用消毒液对经滋养后的羊膜基膜进行消毒，对消毒后的羊膜进行清洗；(4)制备面膜：将步骤(3)中经清洗后的羊膜基膜与所述面膜载贴物贴合制成所述羊膜面膜。
上述的用于制备载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法：所述步骤(2)具体包括如下步骤：(a)配液：采用重组人表皮生长因子rhegf作为外源性表皮生长因子，配置浓度为0.8～1.2pg/mg的重组人表皮生长因子rhegf溶液；(b)羊膜基膜浸渍：将羊膜基膜的上皮细胞层浸渍于重组人表皮生长因子rhegf溶液中；(c)凉干：取出经浸渍的羊膜基膜，控干重组人表皮生长因子rhegf溶液后凉干；在所述步骤(3)中，将羊膜基膜的致密层与所述面膜载贴物贴合。
上述的用于制备载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法：在所述步骤(2)的所述步骤(b)中，进行浸渍时将所述羊膜基膜的上皮细胞层在15～20℃的温度条件用重组人表皮生长因子rhegf溶液浸渍30min以上，所述步骤(2)的所述步骤(c)中所述控干时间为2～3min，所述凉干时间为20min以上。
上述的用于制备载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法：所述面膜载贴物为纤维蛋白胶膜，且所述步骤(4)具体包括如下步骤：(a)制备纤维蛋白胶膜：分别溶解纤维蛋白原冻干粉和凝血酶冻干粉，制成纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，再把纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液均匀混合，混合后的溶液凝固后形成纤维蛋白胶膜；(b)贴合：采用纤维蛋白胶，将羊膜基膜的致密层与经步骤(a)制得的纤维蛋白胶膜贴合制成所述羊膜面膜。
上述的用于制备载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法：在所述步骤(4)中的所述(a)步骤中对形成的纤维蛋白胶膜进行臭氧消毒。
上述的用于制备载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法：所述的臭氧消毒在10ppm的浓度下消毒60～120min。
上述的用于制备载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法：所述滋养液为在生理盐水中添加维生素c及硫酸软骨素，所述消毒液为在蒸馏水中添加质量分数为15％～20％的过氧乙酸。
上述的用于制备载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法：每1000ml所述生理盐水中添加8～12g的所述维生素c以及8～12g的所述硫酸软骨素，每1000ml所述蒸馏水中添加10～15ml的所述过氧乙酸。
上述的用于制备载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法：在所述步骤(3)中将羊膜置于所述滋养液中，在18～23℃的温度条件下浸渍30分钟以上，将羊膜用所述消毒液在18～23℃的温度条件下浸泡4小时以上。
上述的用于制备载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法：在所述步骤(3)中，将经消毒并清洗后的载外源性表皮生长因子的羊膜基膜放置15分钟以上，之后放入甘油与dmem混合液中密封，在温度为零下80摄氏度以下的环境下进行保存。
上述的用于制备载外源性表皮生长因子的羊膜面膜的方法：所述甘油与所述dmem的体积比为1:1，所述dmem包含如下组分：无水氯化钙、硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、丁二酸、丁二酸钠、l-盐酸精氨酸、l-盐酸胱氨酸、甘氨酸、l-盐酸组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-盐酸赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸、d-泛酸钙、酒石酸胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺、盐酸吡哆辛、葡萄糖、丙酮酸钠、酚红。
作为外源性生长因子的重组人表皮生长因子(recombinanthumanepidermalgrowthfactor,rhegf)是由53个氨基酸残基组成的小肽，是类egf大家族的一个成员，为一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。rheg具有与机体正常组织分离的egf相同的生物学活性。rhegf具有广泛的生物学效应，能极强地促进各种表皮组织生长，在医学上用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗；rhegf能促进正常表皮细胞的新陈代谢,具有美白、抗皱、延缓衰老的养颜作用。rhegf的美容功能可归纳为以下几点：(1)嫩肤作用：rhegf能剌激外胚层和内胚层起源的各种细胞如角膜上皮和内皮细胞、表皮、真皮层细胞(如纤维母细胞)、乳腺腺泡及间质细胞等,使其增殖迁移,加快新陈代谢,达到嫩肤的效果；(2)滋润皮肤：rhegf能促进dna、rna和功能蛋白质的生物合成,能促进细胞外大分子的合成(如透明质酸、弹性纤维蛋白等),增加皮肤含水量,进而增加皮肤弹性,滋润肌肤；(3)消除皱纹：rhegf促进细胞营养物质从细胞外主动运至细胞内,增加细胞内的营养。促进真皮层细胞分泌合成胶原纤维、多糖、糖蛋白等功能分子,使皮下真皮组织饱满、肌纤维排列整齐紧密,从而减少和消除皱纹；(4)修复创伤：通过与egf受体结合剌激表皮细胞(包括多种组织来源的上皮细胞、各种间质细胞)进入细胞分裂周期,启动细胞内一些重要功能基因活化、表达、分泌生物活性蛋白质等。促使胶原纤维呈线状排列,表皮细胞快速规则生长并及时覆盖创面。明显加速美容、整容术后及其它皮肤创伤等伤口愈合,并保持创面平整光滑，使癍痕减少或消失及减少色素沉着；(5)预防色斑：rhege对表皮细胞的增殖有较强的促进作用,使用后表皮细胞变得年轻化,使得表皮组织中较少有色素及死亡细胞的残留等累积，使皮肤表现出嫩白无暇,消除色斑及色素沉着等异常皮肤表现。在祛斑的治疗期和恢复期使用egf能有效遏制色斑的复发。
天然羊膜中含有一定浓度的表皮生长因子(egf)，其含量(0.1～1.0pg/mg)与羊膜的新鲜程度有关，即新鲜羊膜的egf含量最高可达1.0pg/mg，随着保存时间的增加egf含量显著下降。羊膜基底膜富含胶元纤维和网状纤维，交织排列成网状，网孔间隙约0.5～15.0μm。能容纳大量药物分子，可吸附药液作为“药库”。羊膜可自行降解，在较长时间内逐步释放药物，维持局部有效药物浓度，成为良好的膜控半定量释药系统，羊膜的结构基础及易于吸纳外源性活性物质的特点，理论上保证了羊膜可以与任何药物相结合成为药物羊膜或改良羊膜，从而提高天然羊膜的生物学活性，增加羊膜的生物学功能。因此，羊膜可吸纳外源性表皮生长因子，并通过缓释机制在较长的时间里使局部药物浓度保持在有效水平。
表皮生长因子(egf)具有比其他类生长因子(如kgf、hgf、tgf、bfgf)更强的生物学活性，因此，载表皮生长因子的羊膜面膜具有更好的美容功能。
因此，采用本发明的技术方案带来如下有益效果：(1)表皮生长因子的生物学活性具剂量正相关特性，含量越高活性越强；羊膜中固有的表皮生长因子与外源性表皮生长因子(优选人重组表皮生长因子，rhegf)具有相同的生物学活性，且无种属特异性。通过吸纳外源性表皮生长因子，使羊膜中此类活性物质的含量提高(≥10％)，使羊膜有更多的生长因子释放于作用部位，能显著促进表皮组织增殖、移行、分化与修复，同时促进成纤维细胞的生长及胶原成分的沉积。(2)羊膜吸纳外源性表皮生长因子，在羊膜内构成一个天然的药物缓释库，大大延长了药物的作用时长，因而提高了药物的生物利用度，极大地改善其对局部表皮细胞生长的促进作用。(3)天然绿色，无毒、无任何刺激性，可生物降解，绿色无污染，生态效应良好。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚地展示，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例
本发明所采用的方案：载表皮生长因子天然羊膜面膜的制备方法分为3个步骤：即羊膜基膜制备、羊膜基膜处理、面膜帖合。
1、羊膜基膜：动物健康检查→胎盘收取与清洗→羊膜分离与加工→羊膜滋养与消毒→羊膜基膜
2、羊膜基膜处理：羊膜基膜→含外源性表皮生长因子溶液浸渍→30min后取出凉干→载表皮生长因子天然羊膜
3、面膜帖合：纤维蛋白胶冻干粉溶液配制→配胶成膜→载表皮生长因子天然羊膜与纤维蛋白胶膜帖合→载表皮生长因子的天然羊膜面膜
以绵羊、山羊和鹿胎盘获取羊膜，具有来源广泛、成本低廉的特点，我国每年经屠宰场集中淘汰的怀羔母羊超过600万只，以每只胎盘收取25×25cm羊膜为计，理论上全年可产羊膜375×107cm2。
以下以羊胎盘为例说明：
(一)羊膜基膜制备
(1)动物健康检查即屠宰前检查。为取得健康羊胎盘，通过检查排除羊布鲁氏病、结核病、口蹄疫，支原体、衣原体感染等病，确认供体羊健康。
(2)胎盘收取与清洗
①通常于有资质的屠宰场收取胎盘，在屠宰车间收取集中宰杀的健康母羊胎盘。
②胎盘成熟度与收取
怀羔时间90～150天，离体胎盘的收取时间不超过2个小时，胎盘收取、清洗、检验的全过程不超过2小时。
③胎盘收取与清洗
洁净条件下收取胎盘、除去胎儿、羊水、污物、血水、血块等，用清水冲洗3次，再用无菌生理盐水洗2次。
④胎盘的检验
a，胎盘质量检验
按胎盘质量标准，依次检验胎盘外观、子叶饱满度、子叶分离数、重量，应符合要求。检验合格的胎盘-20℃速冻保存，保存时间以不超过6个月为宜。胎盘的质量标准为：新鲜胎盘淡红色，无异味、赘生物，无创伤、变色或腐败，手感柔软无结节。子叶饱满，直径≥1.0cm，母体子叶和胎儿子叶结合完好，分离子叶数不超过子叶总数的10％。单只胎盘的重量应为500～1000g。
b，胎盘病原微生物检验通过实验室检查排除羊布鲁氏病、结核病、口蹄疫，支原体、衣原体感染等病，确认胎盘合格。
布鲁氏病：应用豚鼠接种法检验，应符合要求。具体方法为：3批供试胎盘各取样10g，剪成块状(1×1cm)，加等量灭菌生理盐水分别浸泡30min后，取出胎盘组织，所留液体摇匀，各取1ml混匀。豚鼠3只皮下注射1.0ml/只，3～4周后剖杀豚鼠，如脾脏、肝脏与肾脏出现炎性坏死小病灶，并在脾脏、淋巴结涂片中找到病原体，可判为阳性。
结核病：应用p氏固体培养基法检验，应符合要求。具体方法为：3批供试胎盘各取样10g，剪成块状(1×1cm)，加等量灭菌生理盐水分别浸泡30min后，取出胎盘组织，所留液体摇匀，各取1ml混匀。接种于培养基上，室温(培养箱)培养至少20日。若无菌生长判为阴性。若有呈黄白色颗粒状、干燥、革兰氏染色阳性的菌落生长，判为阳性。
口蹄疫：应用乳鼠法检验，应符合要求。具体方法为：3批供试胎盘各取样10g，剪成块状(1×1cm)，加等量灭菌生理盐水分别浸泡30min后，取出胎盘组织，所留液体摇匀，各取1ml混匀。取2～3日龄的乳鼠4～5只(不少于4只)，颈部皮下接种0.1ml/只，连续观察7日，不出现以下症状并全部健活为阴性。出现下述症状者可判为阳性：后腿运动障碍、进而麻痹，头部不能抬起，呼吸困难，终因心肌麻痹死亡。
支原体：按现行《中国兽药典》附录进行检验，不得检出。
衣原体：应用小白鼠腹腔接种法检验，应符合要求。具体方法为：3批供试胎盘各取样10g，剪成块状(1×1cm)，加等量灭菌生理盐水分别浸泡30min后，取出胎盘组织，所留液体摇匀，各取1ml混匀。接种于小白鼠腹腔内(0.5ml/只)，如全部健活可判为阴性；若接种动物在7～10日内死亡，取脾、肺、肝制涂片检查，检出衣原体和嗜硷性包涵体可判为阳性。
(3)羊膜分离与加工
①羊膜分离取胎盘，自羊膜和绒毛膜之间的空隙处人工钝性分离。冷冻保存的羊膜应在完全解冻后分离羊膜。
②羊膜加工分离后的羊膜首先剥离子叶，再表皮细胞层朝下平铺于乙酸纤维薄膜纸上，用细胞刮子刮除海绵层和纤维细胞层，后用无菌生理盐水洗3次除去纤维细胞层和海绵层残余。
除去纤维细胞层和海绵层的羊膜按需要裁剪、成形、补洞。
(二)羊膜基膜处理
外源性表皮生长因子既有天然提取产品，也有生物工程产品即重组人表皮生长因子rhegf，两种产品的功效完全一致，本实施例中采用rhegf。
①配液取rhegf，用灭菌的蒸馏水配成浓度为1.0pg/mg的溶液，装入容器中，液面高度视羊膜数量决定，每3张羊膜设1ml溶液，1个容器内一次浸渍羊膜不超过9层。rhegf溶液应现用现配。
②羊膜浸渍把羊膜平铺，上皮细胞面朝下，依次浸渍于rhegf溶液中，容器加盖，记时30min。
③凉干羊膜浸渍30min后分别取出，控去rhegf液，细胞层朝上平铺于无菌面膜载帖物上20min凉干。
④条件浸渍工作温度15～20℃，rhegf液控干时间2～3min。
(三)载外源性表皮生长因子的羊膜基膜的处理
①羊膜基膜滋养将载外源性表皮生长因子的羊膜基膜置于滋养液中，在18～23℃的温度条件下浸渍30分钟后取出用无菌生理盐水清洗。所述羊膜基膜滋养液为：维生素c10g、硫酸软骨素10g、无菌生理盐水加至1000ml。
②羊膜基膜消毒处理过的羊膜基膜用消毒液浸渍4小时(18～23℃)后取出，以无菌生理盐水充分清洗。所述羊膜基膜消毒液为：质量分数为15％的过氧乙酸15ml、蒸馏水加至1000ml。
③羊膜基膜保存暂不用于羊膜面帖膜制备的羊膜基膜按下法保存：于18～23℃下放置15分钟，使羊膜上的水分充分挥发，放入甘油与dmem(1:1，v/v)混合液中密封，-80℃保存。保存时间可达6个月。
所述dmem的组分及含量如下表所示：
(四)面膜帖合
(1)生物蛋白胶膜制备
①纤维蛋白原溶解液配制取纤维蛋白原溶解液适量加入纤维蛋白原冻干粉，充分搅拌至冻干粉完全溶解。
②凝血酶溶解液配制取凝血酶溶解液适量加入凝血酶冻干粉，充分搅拌至冻干粉完全溶解。
③纤维蛋白胶配制把纤维蛋白原溶解液与凝血酶溶解液混合(1：1)拌匀，成为纤维蛋白胶。
④纤维蛋白胶膜成型配制好的纤维蛋白胶注入模型，凝固后即为纤维蛋白胶膜，对形成的纤维蛋白胶膜进行臭氧消毒，在10ppm的浓度下消毒60～120min。
纤维蛋白胶或称生物蛋白胶是一种高分子生物材料，它是由哺乳动物血浆纤维蛋白原和凝血酶浓缩物冻干制成的。使用前分别以溶解液配制成纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，把两种溶液均匀混合后即为纤维蛋白胶。纤维蛋白胶广泛应用于医学临床，如各种手术创面、腔镜手术及内窥镜治疗中，具有快速止血、封闭创面、促进愈合的效果。
纤维蛋白胶具有如下特点及生物学活性：(a)良好的粘接耐水稳定性：羊膜或羊膜基膜富含水分，其组织结构和生物学特性赋予其强大的吸水性和保水能力，因此，很难得到完全干燥的粘接面，纤维蛋白胶具有在潮湿条件下固化的特点，且固化后有足够的韧性和弹性。(b)强大的粘接力：纤维蛋白胶产生的粘接力牢固而稳定，与羊膜基膜粘合后的单层胶联膜可提供良好的力学强度，保证了胶联羊膜的质量与临床使用。(c)纤维蛋白胶作为一种生物蛋白质，具备良好的组织相容性，无毒性，皮肤外用不产生任何不良反应。(d)使用方便：溶解后形成的纤维蛋白胶流动性、延展性均好，可根据面膜的要求改变涂胶的厚度、形状，方便使用。(e)易保存、快速成型。(f)来源广泛，价格低廉：国内市场上的纤维蛋白胶种类较多，有人血浆产品，也有猪和牛的血浆冻干产品。
(2)羊膜与纤维蛋白胶膜帖合
取纤维蛋白胶膜涂少许纤维蛋白胶，随即把羊膜与纤维蛋白胶粘帖，羊膜的上皮细胞层朝上。粘帖后15～20℃下避光放置20min。
(四)包装与贮藏
每片面膜单独真空密封包装，2～8℃下保存，保质期6个月。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本发明的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。