包载精氨酸脱亚胺酶纳米反应器的构建的制作方法

本发明涉及酶纳米反应器，特别是一种包载adi纳米反应器的构建。

背景技术：

最近，以肿瘤代谢为基础治疗某些恶性肿瘤的方法已成为人们关注的焦点。采用代谢酶降解或剥夺肿瘤存活所必须的氨基酸即所谓的氨基酸剥夺疗法，已经用于治疗急性淋巴细胞白血病。精氨酸是成年人体内一种非必需的氨基酸，它源于瓜氨酸通过两种关键酶催化转化合成。这两种酶分别是精氨基琥珀酸合成酶(argininosuccinatesynthetase1，ass1)和精氨基琥珀酸裂解酶(argininosuccin-atelyase，asl)，其中ass1又是合成过程中的一个关键限速酶。由于缺乏ass1，一些恶性细胞必须使用外源精氨酸，以满足其生长和增殖的需要。

通过静脉注射精氨酸代谢酶来降解体循环中的精氨酸，可以切断肿瘤细胞从血液中摄取精氨酸，从而抑制肿瘤的生长和增殖。目前，可用于精氨酸降解或剥夺的酶包括两种类型：一种是来源于人体的精氨酸酶-1(arg-1)，另一种是来源于细菌的adi。arg-1可将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素，但由于它对精氨酸的亲和力弱(km＝45mm)，并且其最适ph>9，不适宜在生理条件下使用，因而其用途受到限制。adi能催化精氨酸转化为瓜氨酸和氨，具有高活性。在正常细胞内，由于ass1表达正常，代谢生成的瓜氨酸可以经过再循环重新生成精氨酸，而肿瘤细胞由于缺乏ass1不能完成此循环。因此，采用adi剥夺精氨酸对正常人细胞没有什么影响，但对快速增殖的肿瘤细胞来说影响很大，因而成为靶向治疗恶性肿瘤的一种新途径。

尽管adi具有优于arg-1的一些好处，但其临床应用仍然有限，因为在体循环中它具有高免疫原性和短循环半衰期(大约5.0小时)。peg修饰可以延长其血液循环寿命并降低其免疫原性，但其活性也显著降低，例如来自支原菌的adi，其peg化仅保留了原始酶活性的57％。解决此问题一个更有效的策略是将其包封在合适的载体中。

酶纳米反应器(enzymenanoreactor)是一类具有仿生细胞结构及酶代谢功能的纳米囊反应系统。由于囊膜的半透性，封装在囊内的活性酶不能扩散出来，而酶的底物和代谢产物可以跨膜扩散。这种特性对保护酶在体内不受生理环境的影响，维持酶的高活性非常有利。目前，用于构建酶纳米反应器的载体主要有三种。脂质体(liposomes)、聚质体(polymersomes，一种由两亲性嵌段共聚物组装成的类似于脂质体结构的双分子层纳米囊)和基于层层自组装的纳米凝胶囊。前两种载体由于它们具有类似于细胞膜的双分子层结构，因而常被用作酶纳米反应器。但前者由于稳定差，包囊的酶容易从内部泄露到外部；后者虽然具有较高稳定性、能避免酶的泄露，但其双层膜中疏水链段形成的疏水层较厚，不利于亲水性小分子(如酶的底物及产物)自由透过，在用作酶纳米反应器时需要在其膜(或壳)中插入通道蛋白。相对于脂质体和聚质体，基于层层自组装的酶反应器可以通过选择不同的聚电解质种类或者控制交替吸附层数来调节囊膜的半透性，但该方法的一个最大缺点是聚电解质的交替吸附和纯化过程耗时长，制备效率低，而且最后去除模板也可能影响到酶的活性。

羧甲基壳聚糖是天然高分子壳聚糖的一种羧甲基化产物，因其具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性，在医药、生化和生物医学工程等诸多领域备受关注，是常用的药用载体材料。使用羧甲基壳聚糖的另一个考虑是由羧甲基壳聚糖或其衍生物构建的纳米粒带负电荷。已有文献报道表明带负电荷的纳米粒显示出蛋白质对抗的潜力，某些能明显延长体循环的功能。中国专利文献201310112299.5公开了一种以羧甲基壳聚糖为载体材料的脲酶纳米反应器，但脲酶的封装过程伴随着超声，这会影响到脲酶的活性；另外，更重要的是以羧甲基壳聚糖为载体材料构建adi纳米反应器未见报道。

本发明所要解决的主要技术问题是：(1)adi在体内的半衰期较短，在小鼠体内仅为4h。(2)adi具有较强的抗原性。(3)peg的修饰可以延长其血液循环寿命并降低其免疫原性，但其活性也显着降低。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：为解决现有技术中存在的问题，构建一种用于催化降解或剥夺l-精氨酸的高活性、低免疫原性(或无免疫原性)的adi纳米反应器，为治疗ass缺陷类肿瘤提供技术支持。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的包载adi纳米反应器的构建，其有效成分别为一种光交联两亲性聚合物和adi，该酶纳米反应器采用以下方法制成：采用ph诱导可光交联的cmcna胶束转化成纳米囊，实现温和条件下封装adi；通过紫外光光辐射交联，快速锁定纳米囊构造，获得稳定高活性的包载adi纳米反应器。

上述方法中，按照cmcna的结构单元与az的摩尔比为1:(0.1～2)，将溶解在95％乙醇中的az滴加到cmcna水溶液中，在室温下搅拌8小时，得到az-cmcna溶液。向该溶液中加入95％乙醇，过滤收集所得的沉淀，然后用95％的乙醇(v/v)洗涤三次，最后于45℃真空干燥，得到az-cmcna。使用探针型超声波仪将az-cmcna水溶液超声处理3分钟得胶束分散液，然后向溶液中加入adi，随后边搅拌边滴加稀盐酸溶液直到添加的盐酸与az-cmcna中离子化羧基的摩尔比为1:1，此时胶束转化成含adi的纳米囊。将该囊溶液暴露于uv光20～30秒，以诱导壳中az基团原位交联，获得壳交联的adi纳米反应器。

所述cmcna的dd≥90.0％，ds为0.4～1.2。

所述紫外光波长是250～260nm。

所述az-cmcna水溶液的浓度为0.1～1.0％。

所述的adi在胶束中的浓度为30～90ug/ml的浓度。

本发明提供的adi纳米反应器的制备方法，其步骤包括：

(1)az-cmcna的制备

将溶解在乙醇中的az滴加到cmcna水溶液中，并将该混合物在室温下搅拌过夜，得到可光交联的羧甲基壳聚糖溶液。向溶液中加入95％的冷乙醇，通过过滤收集所得的沉淀，然后用95％的醇(v/v)洗涤三次，最后于45℃真空干燥，得到az-cmcna。

(2)az-cmcna基胶束的制备

使用探针型超声波仪将az-cmcna水溶液超声处理3分钟，得到az-cmcna基胶束分散液。

(3)az-cmcna基adi纳米反应器的制备

在温和搅拌将adi溶解在上述胶束溶液中，然后边搅拌边滴加稀盐酸溶液直到添加的盐酸与az-cmcna中离子化羧基的摩尔比为1:1，此时胶束转化成含adi的纳米囊。将该囊溶液暴露于uv光20～30秒，以诱发壳中az基团原位交联，获得壳交联的adi纳米反应器。

本发明采用ph诱导az-cmcna胶束转化成纳米囊，实现温和条件下封装adi；随后通过uv光辐射壳交联，快速锁定纳米囊构造，获得稳定高活性的adi纳米反应器。与现有技术相比，该方法具有以下的主要优点：

(1)囊的形成过程无需加入表面活性剂和有毒的有机溶剂，也无需使用模板核等其它物质。

(2)adi的包封过程在温和条件下进行，且壳交联反应迅速，形成的壳交联网络非常有利于酶底物和产物的通透性，同时又能阻止adi酶向外泄漏，所得adi纳米反应器显示出高催化活性(见表1)。

(3)采用紫外光引发壳中叠氮基交联来锁定adi纳米反应器的形态，获得的adi纳米反应器在血清中显示出很好的稳定性(见图2)。

(4)adi纳米反应器表面带有羧基，有利于体内长循环(见图2)。

(5)由于选用了生物相容性良好的羧甲基壳聚糖为包囊材料，所得纳米反应器无免疫原性或仅有微弱免疫原性(见图3)。

(6)载体基质材料具有无毒和可生物降解性。

附图说明

图1a为az-cmcna基胶束在ph7.2溶液中的透射电镜图。

图1b为az-cmcna基壳交联前的空纳米囊在ph7.0溶液中的透射电镜图。

图1c为az-cmcna基壳交联后的空纳米囊在ph7.0溶液中的透射电镜图。

图1d为az-cmcna基的adi酶纳米反应器在ph7.0溶液中的透射电镜图。

图1e为az-cmcna基的adi酶纳米反应器在ph4.0溶液中的透射电镜图。

图2为游离adi和adi纳米反应器在50％小鼠血浆中孵育期间的剩余活性。剩余活性值为相对于零时间点的活性值。

图3为游离adi和adi纳米反应器在小鼠体内的免疫原性评估。

具体实施方式

本发明涉及包载adi纳米反应器的构建，该酶纳米反应器的有效成分为一种光交联聚合物和adi的组合物，该酶纳米反应器由以下方法制成：按照cmcna的结构单元与az的摩尔比为1:(0.1～2)，将溶解在乙醇中的az滴加到cmcna水溶液中，室温搅拌8小时制得可光交联的az-cmcna，然后超声处理az-cmcna水溶液获得纳米胶束分散液。向该分散液中加入adi，随后滴加稀盐酸直到胶束转化成含adi的纳米囊。将该囊溶液暴露于uv光20～30秒，引发壳交联获得包载adi的纳米反应器。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明，但不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

按照cmcna(dd＝95.2％,ds＝1.02)的结构单元与叠氮苯甲醛(az)的摩尔比为1:1，将溶解在乙醇中的az滴加到cmcna水溶液中，在室温下搅拌8小时，得到az-cmcna溶液。向溶液中加入95％乙醇析出粗产物，然后用95％的乙醇(v/v)洗涤三次，最后于45℃真空干燥，得到az-cmcna。

使用探针型超声波仪将0.4％(w/w)az-cmcna水溶液超声处理3分钟得胶束分散液，然后向胶束分散液中加入adi至其浓度为30ug/ml，随后边搅拌边滴加稀盐酸溶液直到添加的盐酸与az-cmcna中离子化羧基的摩尔比为1:1，此时胶束转化成含adi的纳米囊。将该囊溶液暴露于250nmuv光照射20秒，以诱导壳中az基团原位交联，获得壳交联的adi酶纳米反应器。

实施例2:

按照cmcna(dd＝90.0％,ds＝0.62)的结构单元与叠氮苯甲醛(az)的摩尔比为1:2，将溶解在乙醇中的az滴加到cmcna水溶液中，在室温下搅拌8小时，得到az-cmcna溶液。向溶液中加入95％乙醇析出粗产物，然后用95％的乙醇(v/v)洗涤三次，最后于45℃真空干燥，得到az-cmcna。使用探针型超声波仪将0.2％(w/w)az-cmcna水溶液超声处理3分钟得胶束分散液，然后向溶液中加入adi至其浓度为45ug/ml，随后边搅拌边滴加稀盐酸溶液直到添加的盐酸与az-cmcna中离子化羧基的摩尔比为1:1，此时胶束转化成含adi的纳米囊。将该囊溶液暴露于254nmuv光30秒，以诱导壳中az基团原位交联，获得adi酶纳米反应器。

实施例3:

按照cmcna(dd＝93.0％,ds＝0.87)的结构单元与叠氮苯甲醛(az)的摩尔比为1:0.5，将溶解在95％乙醇中的az滴加到cmcna水溶液中，在室温下搅拌8小时，得到az-cmcna溶液。向溶液中加入95％乙醇析出粗产物，然后用95％的乙醇(v/v)洗涤三次，最后于45℃真空干燥，得到az-cmcna。使用探针型超声波仪将0.1％(w/w)az-cmcna水溶液超声处理3分钟得胶束分散液，然后向溶液中加入adi至其浓度为65ug/ml，随后边搅拌边滴加稀盐酸溶液直到添加的盐酸与az-cmcna中离子化羧基的摩尔比为1:1，此时胶束转化成含adi的纳米囊。将该囊溶液暴露于260nmuv光20秒，以诱导壳中az基团原位交联，获得adi纳米反应器。

实施例4:

按照cmcna(dd＝92.1％,ds＝1.20)的结构单元与叠氮苯甲醛(az)的摩尔比为1:0.1，将溶解在95％乙醇中的az滴加到cmcna水溶液中，在室温下搅拌8小时，得到可光交联的羧甲基壳聚糖钠盐(az-cmcna)溶液。向溶液中加入95％乙醇析出粗产物，然后用95％的乙醇(v/v)洗涤三次，最后于45℃真空干燥，得到az-cmcna。使用探针型超声波仪将0.8％(w/w)az-cmcna水溶液超声处理3分钟得胶束分散液，然后向溶液中加入adi至其浓度为80ug/ml，随后边搅拌边滴加稀盐酸溶液直到添加的盐酸与az-cmcna中离子化羧基的摩尔比为1:1，此时胶束转化成含adi的纳米囊。将该囊溶液暴露于256nmuv光25秒，以诱导壳中az基团原位交联，获得adi纳米反应器。

实施例5:

按照cmcna(dd＝99.6％,ds＝0.40)的结构单元与叠氮苯甲醛(az)的摩尔比为1:1.5，将溶解在95％乙醇中的az滴加到cmcna水溶液中，在室温下搅拌8小时，得到az-cmcna溶液。向溶液中加入95％乙醇析出粗产物，然后用95％的乙醇(v/v)洗涤三次，最后于45℃真空干燥，得到az-cmcna。使用探针型超声波仪将1％(w/w)az-cmcna水溶液超声处理3分钟得胶束分散液，然后向溶液中加入adi至其浓度为90ug/ml，随后边搅拌边滴加稀盐酸溶液直到添加的盐酸与az-cmcna中离子化羧基的摩尔比为1:1，此时胶束转化成含adi的纳米囊。将该囊溶液暴露于258nmuv光20秒，以诱导壳中az基团原位交联，获得adi纳米反应器。

为了证明adi酶被封装到壳交联纳米囊内，我们以实例3的空心纳米囊为对照，采用透射电镜(tem)表征了实例3的adi酶纳米反应器。图1(a)是az-cmcna在去离子水中通过超声分散组装成胶束的tem照片，图中显示胶束具有核-壳结构并且平均粒径为102±11.2nm。当向该胶束溶液中逐滴滴加稀hcl直至加入的hcl与离子化羧基的摩尔比为1:1，此时胶束转化成了平均粒径为150±5.4nm的空心纳米囊，参见图1(b)。最后，将该囊的水溶液置于254nm紫外光下辐射20秒，引发壳中叠氮基交联获得结构锁定的壳交联纳米囊，参见图1(c)。

为了包载adi酶，可在上述胶束溶液中加入适量adi，同样操作可得封装adi的壳交联纳米囊，即adi纳米反应器。该纳米反应器在ph7.0溶液中的tem照片见图1(d)。图中可见粒子中心显示出比空心壳交联纳米囊图1(c)更暗的核，且该核被一个代表聚合物交联膜的可区分的光晕封闭着。这是由于在ph7.0介质中带负电荷的adi(其pi＝4.7)和交联壳上离子化羧基(其pka≈4.0)之间的静电排斥，adi均匀分布在纳米囊内。为了进一步证明adi被封装在囊内，将adi酶纳米反应器转入ph4.5的溶液中，由于带正电荷的adi被吸附到带负电荷的壳上，通过tem观察到空心球形结构，参见图1(e)。此时样品显示出粒径约100±6.8nm的一个收缩结构。

为了评价封装过程对酶活性的影响，使用游离adi为对照，测定了实例1-5制得的adi纳米反应器的相对活性。具体如下：

将adi纳米反应器与10mml-精氨酸，0.1m磷酸钾(ph7.0)在37℃下孵育30分钟，并通过加入1毫升h2so4与h3po4的浓度比为1:3混合物(v/v)停止反应。将混合物在15000rpm的高速下离心10分钟。上清液中瓜氨酸的含量通过测定由瓜氨酸与二乙酰单肟的结合形成的有色反应产物在460nm处的吸光度来确定。一个酶活性单位定义为在所使用的测定条件下每分钟将1.0μmol的l-精氨酸转化为l-瓜氨酸的酶的量。使用相同的分析方法(除去离心分离步骤)，也可以测定游离adi的活性。以游离adi的活性为对照，使用以下方程式计算adi纳米反应器的相对活性(ra)：

从表1可看出adi纳米反应器的活性几乎与游离adi酶的活性相同，这个结果表明封装过程对酶活性没有不利影响，并且壳交联不是l-精氨酸流入和l-瓜氨酸流出的屏障。

使用游离adi作为对照，我们也评价了实例3中的adi酶纳米反应器在50％老鼠血浆中孵育7天期间的剩余活性(即相对于零时间点的绝对活性值)。具体如下：取一定体积的小鼠血浆，向其中加入相同体积的adi纳米反应器溶液。将混合物首先在37℃下孵育至少5分钟，然后在不同的时间点取出样品的等分试样，并根据上述方法测定adi的绝对活性(所有样品平分成三等分进行测量)。采用剩余活性描述样品在其孵育期间的活性变化，其被定义为相对于零时间点的活性值。

从图2中，我们可以看出az-cmcna基adi纳米反应器在37℃下于小鼠血浆中孵育7天仍保留全部活性，而游离adi显示出约55％的活性损失。这表明adi酶纳米反应器在血浆中具有高活性和稳定性，能大大延长adi的体内半衰期。

使用游离adi作为对照，我们也评估了实例3中的adi纳米反应器在小鼠体内的免疫原性。具体如下：取雌性小鼠(每组5只)，静脉注射800iu/m²的adi或adi-peg，每周一次共8周。在第一次注射之前和第5周及第9周，通过腔静脉收集血液(每只小鼠约40ul)。将小鼠血液收集在用edta包被的毛细管中；将样品在-22℃冷冻储存。采用酶联免疫分析法测定小鼠血清样品中的igg水平。

从图3中，我们可以看出adi酶在小鼠体内显示出明显的免疫原性；而az-cmcna基adi纳米反应器显示出非免疫原性或微弱免疫原性。

上述实施例制得的adi酶纳米反应器集自组装与载酶于一体，制备方法简单，并且对精氨酸代谢显示高活性，在癌症治疗等领域有潜在的应用价值。

表1.adi酶纳米反应器的相对活性(ra)