儿茶素用于缓解二甲基甲酰胺致肝损伤的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，进一步涉及物质的新的医药用途，具体涉及儿茶素用于缓解二甲基甲酰胺致肝损伤的应用。

背景技术：

二甲基甲酰胺(dmf)是一种透明液体，能和水及大部分有机溶剂互溶。它是化学反应的常用溶剂。二甲基甲酰胺在强碱如氢氧化钠或强酸如盐酸或硫酸的存在下是不稳定的，并水解为甲酸与二甲基胺。工业应用中，二甲基甲酰胺主要用作萃取乙炔和制造聚丙烯腈纤维的溶剂，亦用于有机合成、染料、制药、石油提炼和树脂等工业。在以上工作岗位可因接触dmf蒸汽而中毒。急性中毒发生原因多数由于生产故障，设备漏裂，或在检修设备时，未采取有效的防护措施，大量接触毒物所致，中毒常是吸入和皮肤吸收并存，且以皮肤吸收为主。其他中毒情况少见，但有口服以及将该品灌肠作为治疗溃疡性结肠炎的药物而引起严重中毒的病例。

dmf的毒性作用机制尚未完全明了，现在认为与其体内代谢过程有关。dmf其甲基烃基化，生成n-甲基-甲醇酰胺(hmmf)，hmmf部分脱羟甲基分解成甲基甲酰胺(nmf)和甲醛，nmf还可羟基化，然后再分解成甲酰胺(f)，还有少部分dmf以原形从尿中排出。实验表明，nmf毒性强于dmf及hmmf。nmf或hmmf生成n-甲基氨基甲酰半胱氨酸(amcc)过程中的活性中间产物(可能是异氰酸甲酯)，具有亲电性，可以与蛋白质、dna、rna等大分子的亲核中心共价结合，造成机体肝肾器官损伤。现有技术中针对dmf导致的肝损伤尚无有效的治疗手段，常用的处理方法是b族维生素、葡萄糖，同时可给以酵母片、肝泰乐、肝乐、维丙肝、胆碱等恢复性药物，对于较重者可用糖皮质激素，一般用地塞米松20～60mg/天，分次肌注，用药不超过一周，逐步减量。

儿茶素又称儿茶精，茶单宁。为黄烷醇的衍生物，分子式c15h14o6，呈无色结晶形固体，能溶于水；其水溶液受热或在无机酸存在下，容易聚合成无定形鞣质。现有技术中，有研究表明儿茶素具有抗氧化、调节脂质代谢等作用，因此已被用于作为减肥药物和抗衰老药物，此外还有报道称儿茶素具有降血压、降血糖等功效。现有技术中未见儿茶素对肝脏保护作用、尤其是特定中毒损伤条件下的肝脏保护作用。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供儿茶素用于缓解二甲基甲酰胺致肝损伤的应用，以解决现有技术中缺乏一种此类中毒性肝损伤治疗手段的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是进一步拓展儿茶素的用途范围。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

儿茶素用于缓解二甲基甲酰胺致肝损伤的应用，所述儿茶素结构式如式(1)所示：

作为优选，所述儿茶素是微晶体儿茶素。

作为优选，该微晶体儿茶素使用cu-kα辐射，以2θ角度表示的x射线粉末衍射光谱特征如下表所示：

作为优选，所述肝损伤是由接触二甲基甲酰胺所导致的肝脏氧化性损伤。

作为优选，所述缓解二甲基甲酰胺致肝损伤，是通过提高肝脏组织中抗氧化酶sod、gsh-px、cat活性实现的。

作为优选，所述药物还降低肝脏组织中谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量。

作为优选，所述肝损伤是由接触二甲基甲酰胺所导致的肝脏炎症性损伤。

作为优选，所述缓解二甲基甲酰胺致肝损伤，是通过降低细胞因子il-1β、il-6的表达量实现的。

作为优选，所述药物的剂型为口服剂。

作为优选，所述药物的有效剂量为50～200mg/kg。

本发明提供了儿茶素用于缓解二甲基甲酰胺致肝损伤的应用，该技术方案中首先研究了dmf通过接触方式侵入人体后的代谢途径，根据肝脏代谢过程的产物类别、损伤情况考察儿茶素对毒性损伤治疗的可行性。在此基础上，本发明利用实验动物进行dmf中毒模型构建，并以此为实验对象考察了儿茶素对中毒动物的治疗效果。实验结果表明，口服儿茶素可以显著提升肝脏组织中的抗氧化酶活性，同时，谷草转氨酶、谷丙转氨酶等过高现象也得到了恢复。此外，本发明发现儿茶素对dmf所造成的炎症性损伤具有确切的缓解作用，并进一步发现其药理作用是通过降低促炎细胞因子il-1β、il-6的表达量实现的。本发明的研究成果拓展了儿茶素的医药用途范围，同时实现了二甲基甲酰胺致肝损伤的有效治疗。

附图说明

图1是本发明具体实施方式中儿茶素对dmf染毒模型大鼠肝组织形态学变化的影响；图中从左至右依次为空白对照组、dmf染毒模型组、以及dmf染毒模型同时口服200mg/kg儿茶素的治疗组。

图2是本发明具体实施方式中不同实验组之间肝脏组织抗氧化酶sod、cat、gsh-px活性对比图。

图3是本发明具体实施方式中不同实验组之间肝脏谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量对比图。

图4是本发明具体实施方式中不同实验组之间肝脏组织促炎细胞因子il-1β、il-6的含量对比图。

图5是本发明中儿茶素的化学结构式示意图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

1、实验方法

1.1动物实验设计

健康成年雄性sd大鼠56只，体重(160±180)g，大鼠在12h：12h明暗循环的动物房内适应性饲养1周。然后将小鼠随机分为6组，每组8只，灌胃给药：1组为正常对照组，给同体积生理盐水；2组为dmf染毒模型组，dmf水溶液(20mg/kgbw)；3-6组为毒性抑制组，分别在染毒dmf水溶液中同时添加儿茶素低剂量(50mg/kgbw)、中剂量(100mg/kgbw)、高剂量(200mg/kgbw)。正常对照组给予等体积的生理盐水，2-5组在给予相应药物半小时候后，口腔灌胃dmf水溶液，每天一次，连续30d，最后一次给药24h后处死动物，进行各相关指标的测定。

1.2大鼠处理及样品的收集

大鼠处理及血清的制备：最后一次给药24h后，用4％的水合氯醛(1ml/100g)进行麻醉，用摘眼球取血法取大鼠外周血，放置室温待血清分层后，以4000r/min，4℃冷冻离心10min，吸取上层血清部分，4℃条件下备用。

解剖分离收集肝组织。并用生理盐水清洗，放置于ep管中，放于-80℃备用。

用于制作肝组织切片：取适量组织，在冰冷生理盐水中漂洗净后，于2.5％戊二醛-多聚甲醛中固定；其余肝组织放置于ep管中，放于-80℃备用。

1.3肝组织切片材料的准备及形态学的观察

按石蜡切片的常规制作方法：经固定-冲洗-脱水-透明-浸蜡-包埋-切片-固定-染色(脱蜡-染色-脱水)-封片-观察记录结果。光镜下观察组织形态学变化。

肝组织切片的制作：

(1)固定：大鼠解剖后，迅速取出肝组织，截取5cn左右的组织，注意不能人为损伤组织，并小心去除粘附的结缔组织，将取出的肝组织立即投入装有4％多聚甲醛的ep管中，固定5h后在横切面切口，利于组织内部固定，后再固定24h。

(2)脱水：将组织依次从低浓度酒精投入到高浓度酒精。具体为85％酒精2h，95％酒精ⅰ1.5h，95％酒精ⅱ2h，100％酒精ⅰ1.5h，100％酒精ⅱ1h。

(3)透明、浸蜡：将组织置于二甲苯中25min使组织透明，后移入石蜡内，于60℃孵箱3h。

(4)包埋、切片：将石蜡加热溶解后倒入长条纸盒内，浸蜡组织放于纸盒中央，应注意应切面朝下，位置正放，待石蜡变成固体状；于切片机上切成3μm的切片后，放入温水中，使切片平整无褶皱；将平整的切片小心移于载玻片上，放在40℃孵箱24h以烘干。

(5)石蜡切片脱蜡入水：将有切片的载玻片放入二甲苯ⅰ(56℃)20min，二甲苯ⅱ(56℃)20min，然后置于梯度酒精：100％酒精3min，95％酒精3min，85％酒精3min，70％酒精3min，自来水冲洗5min，蒸馏水漂洗5min。

(6)染色：将载玻片放入苏木精溶液中5min，过蒸馏水；饱和碳酸锂10～20s，自来水洗数秒；盐酸酒精分化2～3s，自来水冲洗数秒。

(7)石蜡脱水、透明及封片：将载玻片放入梯度酒精以脱水：95％酒精ⅰ3min，95％酒精ⅱ3min，95％酒精ⅲ3min，100％酒精ⅰ3min，100％酒精ⅱ3min，100％酒精ⅲ3min，然后放入二甲苯以透明：二甲苯ⅰ5min，二甲苯ⅱ5min，二甲苯ⅲ5min，中性树脂胶封片。

(8)显微镜观察组织病理变化。

1.4肝组织中氧化与损伤相关指标的测定

氧化损伤指标：超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、丙二醛(mda)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)活性。按试剂盒说明书上的操作步骤进行检测和计算。

1.5肝组织中免疫指标的测定

用预冷的生理盐水或者pbs(0.01m，ph7.0-7.4)冲洗组织，去除残余血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的pbs(一般按照1：9的重量体积比)加入组织匀浆器中，于冰上充分研磨，最后将匀浆液于4000×g离心15min，取上清检测。上清液可分装保存-80℃备用。免疫功能指标：il-1β、il-6；均采用酶联免疫吸附法(elisa)试剂盒检测。按照说明书上的操作步骤进行检测和计算。

1.6肝损伤指标的测定

谷草转氨酶(ast)试剂盒、谷丙转氨酶(alt)试剂盒。按说明书上的操作步骤进行检测和计算。

2、结果与分析

2.1儿茶素对dmf染毒模型大鼠肝组织形态学变化的影响

如图1所示，经检测得，空白组对照组的大鼠肝组织形态正常，无异常状态，肝小叶结构完整，无细胞破裂、自溶或坏死等。与空白组相比，dmf染毒组中组织病理结果显示肝组织出现严重病变。炎细胞浸润现象严重，肝小叶排列素乱，而且肝细胞肿胀严重甚至出现成片坏死现象，胞浆稀松，肝细胞之间边缘模糊的现象，以上病变特征表明造模实验有效，实验动物已处于二甲基甲酰胺致肝脏损伤状态。儿茶素处理组病理结果表明能够对dmf造成组织病变起到明显的改善作用，其中儿茶素不同剂量组病理切片与模型组相比，肝组织病变情况得到很好地改善，具体表现为：肝细胞未见明显病理症状，肝细胞排列正常，结构完整。结果表明儿茶素能够有效改善dmf造成肝损伤的组织损伤。

2.2儿茶素对dmf染毒模型大鼠肝脏组织抗氧化酶活性的影响

儿茶素对dmf染毒模型大鼠肝组织抗氧化酶活性(sod、cat、gsh-px)的影响如图2所示。

经检测得，儿茶素处理组结果可以看出，肝sod、cat、gsh-px显著性差异，与染毒模型组相比，儿茶素处理组中sod、cat、gsh-px的活力均有所升高，与染毒组相比，具有明显的显著性差异。而儿茶素单独处理组(200mg/kgbodyweight)中抗氧化物酶：sod、cat、gsh-px与正常组相比，无明显的显著性差异，可以说明，儿茶素单独处理时，对机体内的抗氧化防御系统无损伤、对机体无毒害作用。

2.3儿茶素对dmf染毒模型大鼠肝组织中谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)含量的影响

儿茶素对肝组织中谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)含量的影响如图3所示。与染毒模型组相比，不同浓度的儿茶素保护组检测得ast、alt含量均明显的降低。

2.4儿茶素对dmf染毒模型大鼠肝组织免疫因子的影响

儿茶素对dmf染毒模型大鼠肝组织中促炎因子il-1β、il-6含量的影响如图4所示。与染毒模型组相比，儿茶素对体内炎症因子具有下调作用，使用不同浓度儿茶素处理的实验组大鼠其体内肝组织中促炎细胞因子il-1β、il-6含量均有所降低，尤其是对促炎细胞因子il-1β的作用显著。从图4结果可以发现，口服不同浓度的儿茶素均可以有效的缓解二甲基甲酰胺所导致的炎症临床症状，儿茶素能够抑制dmf诱导的大鼠肝组织中促炎细胞因子il-1β、il-6的表达，对其细胞因子的分泌的抑制作用均具有显著性。

3、实验结论

儿茶素可显著提升肝脏组织中的抗氧化酶活性，使其接近空白对照组的自然水平；同时，儿茶素干预条件下因二甲基甲酰胺毒性所致的谷草转氨酶、谷丙转氨酶升高现象得到恢复。同时，本发明还发现儿茶素对二甲基甲酰所造成的炎症性损伤具有确切的缓解作用，并进一步确认其药理作用是通过下调促炎细胞因子il-1β、il-6、的表达量实现的。基于以上药理作用，可利用儿茶素以口服给药的方式对由二甲基甲酰所造成的肝脏损伤实现治疗作用。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。