本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种含神经生长因子的水凝胶的制备方法。
背景技术：
：神经生长因子(NerveGrowthFactor，NGF)作用广泛，其中β亚单位是神经生长因子的活性区。目前商品化的m-βNGF如恩经复是从成年雄性小鼠颌下腺分离和纯化获得。神经生长因子广泛应用眼科、神经外科、骨科、神经内科、儿科、内分泌科中的神经萎缩、神经变性、外伤修复等疾病的治疗，但目前尚无外用的神经生长因子的相关产品上市。压力性溃疡(PressureUlcer，PU)也称褥疮，是由外部压力引起血液和淋巴液流动受阻所致的皮肤及其以下组织的局部缺血性损伤，其是临床最常见并发症之一。随着我国人口老龄化的快速发展，造成各种慢性病的发生率增高，此外医疗技术的提高使大量危重病人得以救治，导致伴随并发症的病人数量增多，因此目前压力性溃疡的发病率日益升高。和其他给药途径相比，局部治疗压力性溃疡更易于应用且具有更少的副作用。另外，和其他药物相比，具有更短半衰期的局部药物具有更好的安全性。文献研究证实，神经生长因子的局部用药能引起神经功能的逐步恢复，如痛觉敏感性的再现。另有证据表明，神经生长因子能刺激血管的形成和角质形成细胞的生长和分化。神经生长因子可能有助于压力性溃疡伤口的恢复，通过对其它神经营养因子直接或间接的作用刺激角质形成细胞增殖和新生血管形成，从而加快伤口的愈合。因此，外用神经生长因子治疗压力性溃疡等难愈性溃疡中具有较大的潜在价值。开发外用剂型如含神经生长因子水凝胶剂意义重大。中国专利CN200310120873.8公开了一种神经生长因子外用药剂，其中凝胶剂的增稠剂为卡波姆940，保湿剂为单独使用丙二醇(或单独使用丙三醇)，主药为东北长白山蝮蛇蛇毒神经生长因子。但是，该凝胶剂的主药来源为东北长白山蝮蛇蛇毒，其来源受到限制，且蛇毒神经生长因子潜在的免疫原性，具有一定的临床风险。该凝胶剂基质使用的卡波姆940，其苯含量超标，有潜在的致癌风险，已不符合FDA和美国国家处方集的要求，需要使用安全无毒的新辅料代替。文献研究指出，确保溃疡处等作用部位的湿性愈合要求对加速溃疡愈合具有重要的意义，使用多种保湿剂组合使用能在多种情况下维持外用制剂的保湿性。但该凝胶剂单独使用丙二醇或单独使用丙三醇的保湿效果未经验证，可能导致不能满足溃疡处等作用部位的湿性愈合要求。此外，在未加或蛋白保护剂不足的情况下，大部分蛋白类包括神经生长因子的生物学活性会迅速衰减。而该凝胶剂缺乏必须的蛋白保护剂，造成水凝胶内神经生长因子蛋白的生物学活性稳定性欠佳。此外，特别需要指出的是，凝胶剂中增稠剂(如该水凝胶使用的卡波姆940)结构致密，使药物活性分子或蛋白难以释放，导致外用水凝胶制剂疗效不佳。综上，传统凝胶剂在多方面存在不足，尤其是神经生长因子作为一种蛋白，其难以从水凝胶中释放到溃疡面而发挥疗效，临床疗效欠佳。且保持含神经生长因子水凝胶的长期的生物学活性稳定也是工业化关键之一。因此，临床上急需新型的安全性更高、蛋白活性更稳定、释放更完全、能确保湿性愈合的新型神经生长因子水凝胶剂出现，其具有重要的临床和工业化价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种简单实用、稳定性及疗效好的水凝胶剂及其制备方法，并进一步应用于压力性溃疡等难愈性溃疡的治疗。为实现上述目的，本发明提供一种含有蛋白的水凝胶，其特征在于，组成为卡波姆980，丙三醇，丙二醇，聚维酮K30，尼泊金甲酯，EDTA-2Na，氮酮，人血白蛋白，甘露醇和蛋白，余量为水。进一步，所述聚维酮K30与卡波姆980之比为1:2-2:1；优选的，聚维酮K30与卡波姆980之比为1:1。进一步，其重量百分组成为，1％的卡波姆980，20％的丙三醇，20％的丙二醇，1％的聚维酮K30，0.15％的尼泊金甲酯，0.05％的EDTA-2Na，1％的氮酮，0.5％的人血白蛋白，0.5％的甘露醇，蛋白0.001-0.012％，余量为水。进一步，所述蛋白为神经生长因子。进一步，制备方法为，分别取丙三醇和丙二醇，加入注射用水搅拌均匀，加入尼泊金甲酯、EDTA-2Na、氮酮使之溶解，称取卡波姆980加入其中，过夜溶胀得混合溶液，然后将NaOH水溶液缓慢滴入所述混合溶液中，搅拌混合均匀成粘稠状凝胶、调节pH＝6.5-7.5，高温灭菌后冷却得到，再向其中加入聚维酮K30，再以注射用水补充，即得水凝胶基质。于2-8℃下向该水凝胶基质中加入神经生长因子溶液，缓慢搅拌均匀，避免气泡产生，即得含神经生长因子的水凝胶制剂；优选的，继续将含神经生长因子的水凝胶制剂离心后分装保存。进一步，制备方法为，分别取丙三醇5-20g和丙二醇5-20g，加入30-80ml注射用水搅拌均匀，加入尼泊金甲酯0.15g、EDTA-2Na0.05g、氮酮1g使之溶解，称取卡波姆980(Carbopol980，辅料进字F20130033，路博润先进材料公司)0.4-1.6g加入其中过夜溶胀得混合溶液，然后将0.5-1.2ml50％(w/w)NaOH水溶液缓慢滴入所述混合溶液中，搅拌混合均匀成粘稠状凝胶、调节pH＝6.5-7.5，在0.1MPa，121℃条件下高温灭菌20min，冷却至4℃，再向其中加入5-20ml的10％聚维酮K30，再以注射用水补充至总重量为95g，即得水凝胶基质95g；于4℃下向该水凝胶基质中加入5ml神经生长因子溶液，缓慢搅拌均匀，避免气泡产生，即得含神经生长因子的水凝胶制剂100g；优选的，继续将含神经生长因子的水凝胶制剂12000rpm离心5分钟，再分装保存。进一步，所述神经生长因子溶液含注射用鼠神经生长因子原液、人血白蛋白及甘露醇。进一步，所述神经生长因子溶液5ml含注射用鼠神经生长因子原液1-12mg、人血白蛋白0.5g及甘露醇0.5g，余量为水。本发明提供一种所述含有蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，分别取丙三醇和丙二醇，加入注射用水搅拌均匀，加入尼泊金甲酯、EDTA-2Na、氮酮使之溶解，称取卡波姆980加入其中，过夜溶胀得混合溶液，然后将NaOH水溶液缓慢滴入所述混合溶液中，搅拌混合均匀成粘稠状凝胶、调节pH＝6.5-7.5，高温灭菌后冷却至4℃得到，再向其中加入聚维酮K30，再以注射用水补充；即得水凝胶基质；于2-8℃下向该水凝胶基质中加入神经生长因子溶液，缓慢搅拌均匀，避免气泡产生，即得含神经生长因子的水凝胶制剂；优选的，继续将含神经生长因子的水凝胶制剂离心后分装保存；更优选的，分别取丙三醇5-20g和丙二醇5-20g，加入30-80ml注射用水搅拌均匀，加入尼泊金甲酯0.15g、EDTA-2Na0.05g、氮酮1g使之溶解，称取卡波姆980(Carbopol980，辅料进字F20130033，路博润先进材料公司)0.4-1.6g加入其中过夜溶胀得混合溶液，然后将0.5-1.2ml50％(w/w)NaOH水溶液缓慢滴入所述混合溶液中，搅拌混合均匀成粘稠状凝胶、调节pH＝6.5-7.5，在0.1MPa，121℃条件下高温灭菌20min，冷却至4℃，再向其中加入5-20ml的10％聚维酮K30，再以注射用水补充至总重量为95g，即得水凝胶基质95g；于4℃下向该水凝胶基质中加入5ml神经生长因子溶液，缓慢搅拌均匀，避免气泡产生，即得含神经生长因子的水凝胶制剂100g；最优选的，继续将含神经生长因子的水凝胶制剂12000rpm离心5分钟，再分装保存；任选的，所述神经生长因子溶液含注射用鼠神经生长因子原液、人血白蛋白及甘露醇；任选的，所述神经生长因子溶液5ml含注射用鼠神经生长因子原液1-12mg、人血白蛋白0.5g及甘露醇0.5g，余量为水。本发明所述水凝胶基质的配制中有加入氢氧化钠(强碱)调pH值，使水凝胶从液态变成凝胶状，强碱会使蛋白变性失活，所以先配水凝胶基质，再加入单独的神经生长因子溶液。所述水凝胶基质中卡波姆980作为增稠剂、聚维酮K30作为凝胶孔状结构调节剂，以调节水凝胶的润滑性、黏度和神经生长因子的释放性能；丙三醇与丙二醇主要作为保湿剂，以满足溃疡处等作用部位的湿性愈合要求；氮酮为透皮吸收剂，丙三醇与丙二醇也具有透皮吸收剂的作用，从而保证外用后神经生长因子的透皮吸收量，提高疗效；EDTA-2Na为金属螯合剂，其能螯合多种作为辅酶的金属离子，从而抑制酶促蛋白降解，保持神经生长因子的稳定性；尼泊金甲酯为防腐剂，能防止微生物生长，满足含神经生长因子水凝胶的无菌要求。而所述神经生长因子溶液中神经生长因子作为药物活性成分，起到促进伤口、溃疡愈合、加速新生血管形成的作用；人血白蛋白、甘露醇作为蛋白保护剂，以保持神经生长因子生物学活性的长期稳定性。本发明具有以下优点：1、本发明采用卡波姆980为基质材料制备水凝胶，水凝胶的润滑性和黏度好，具有延展性好、易于涂抹和附着于皮肤、生物相容性好，对皮肤无刺激性并能吸收组织渗透液等特性，且无传统卡波姆940含致癌物质苯的情况。2、本发明采用优选的保湿剂(丙二醇、丙三醇)组合配方，能确保伤口、溃疡处等作用部位的湿性愈合要求，有助于加速溃疡的愈合。3、本发明制备的含神经生长因子水凝胶稳定性好，通过添加蛋白保护剂(人血白蛋白、甘露醇)和金属螯合剂(EDTA-2Na)使凝胶中神经生长因子的生物学活性长时间保持稳定。4、本发明制备的含神经生长因子水凝胶通过添加凝胶孔状结构调节剂(聚维酮K30)，突破了水凝胶中神经生长因子难以释放的技术难点，大幅度提高了水凝胶中神经生长因子的透皮释放量，神经生长因子可以到达溃疡面发挥疗效。附图说明图1是G1组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G1组1号大鼠(总编号1)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G1组1号大鼠(总编号1)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。图2是G2组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G2组1号大鼠(总编号13)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G2组1号大鼠(总编号13)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。图3是G3组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G3组2号大鼠(总编号26)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G3组2号大鼠(总编号26)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。图4是G4组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G4组5号大鼠(总编号41)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G4组5号大鼠(总编号41)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。图5是G5组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G5组4号大鼠(总编号52)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G5组4号大鼠(总编号52)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。图6是G6组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G6组2号大鼠(总编号62)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G6组2号大鼠(总编号62)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。图7是G7组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G7组6号大鼠(总编号78)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G7组6号大鼠(总编号78)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1含神经生长因子的水凝胶制备方法分别取丙三醇5-20g和丙二醇5-20g，加入30-80ml注射用水搅拌均匀，加入尼泊金甲酯0.15g、EDTA-2Na0.05g、氮酮1g使之溶解，称取卡波姆980(Carbopol980，辅料进字F20130033，路博润先进材料公司)0.4-1.6g加入其中过夜溶胀得混合溶液，然后将0.5-1.2ml50％(w/w)NaOH水溶液缓慢滴入所述混合溶液中，搅拌混合均匀成粘稠状凝胶、调节pH＝6.5-7.5，在0.1MPa，121℃条件下高温灭菌20min，冷却至4℃。再向该凝胶中加入5-20ml的10％聚维酮K30溶液(PVPK30，辅料进字F20120023，巴斯夫(中国)有限公司)，使所述10％聚维酮K30溶液中含有的聚维酮K30与卡波姆980的含量之比为1:2-2:1，再以注射用水补充至总重量为95g。即得水凝胶基质95g。于4℃下向该水凝胶基质中加入5ml神经生长因子溶液(含注射用鼠神经生长因子原液、人血白蛋白及甘露醇)，缓慢搅拌均匀，避免气泡产生，即得含神经生长因子的水凝胶制剂100g。将含神经生长因子的水凝胶制剂12000rpm离心5分钟，再分装于无菌铝管中，置于4℃下保存。所述神经生长因子溶液的制备方法，是将处方量的神经生长因子原液(注射用鼠神经生长因子原液，批号L015，未名生物医药有限公司)、人血白蛋白、甘露醇加入注射用水中充分混匀，使其浓度分别为神经生长因子0.2-2.4mg/ml、人血白蛋白100mg/ml、甘露醇100mg/ml，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤除菌，至于4℃下备用。实施例2水凝胶基质的均匀设计实验本实施例中水凝胶基质的制备方法同实施例1。以水凝胶总重量为100g计算，10％聚维酮K30溶液加入量固定为10ml，依据实施例1比例固定其它成分的投药量，只调整卡波姆980、丙三醇、丙二醇的投药量，最后以注射用水补充至水凝胶基质总重量为95g。固定神经生长因子溶液浓度为0.2mg/ml，加入量为5ml。根据预实验结果，选择卡波姆980(X1)、丙三醇(X2)、丙二醇(X3)的投药量作为可变因素进行均匀设计。设定卡波姆980投药量为0.4-1.6g(即0.4％-1.6％(w/w))，丙三醇投药量为5-20g(即5％-20％(w/w))，丙二醇投药量为5-20g(即5％-20％(w/w))。查均匀设计表，U5(53)进行3因素试验的刻化均匀度偏差(D)为0.4570，U6*(64)进行3因素试验的D为0.2656，U7(74)进行3因素试验的D为0.3721，U7*(74)进行3因素试验的D为0.2132，U8*(85)进行3因素试验的D为0.2000，综合考虑试验次数和均匀度，选择U7*(74)进行3因素试验，每个因素各设置7个水平，试验设计因素和水平如表1，评分标准如表2，卡波姆980、丙三醇、丙二醇优化配比结果如表3。表1水凝胶基质的均匀设计因素和水平表均匀设计试验考察指标包括性状均匀性(Y1)，润滑性(Y2)，黏度(Y3)，保湿率(Y4)，其中选择3位具有相关经验的技术人员观察水凝胶的性状均匀性如均匀性、细腻度、澄清度等，同时进行涂抹实验考察水凝胶的润滑性和黏度，分别进行评分后取均值，评分标准如表2。表2均匀设计试验不同指标评分标准表保湿性试验方法：准确称量凝胶基质各5g(精确到0.0001g)涂敷在贴上3M胶布的7.5cm×7.5cm玻璃板上，于25℃、相对湿度为80％的药品稳定性试验箱内放置12h后称重，计算保湿率(保湿率％＝(凝胶原重量-凝胶12h后重量)/凝胶原重量*100％)，每种凝胶进行3次试验，取平均值。均匀设计试验考察指标如表3。表3均匀设计试验不同指标试验结果表均匀设计的7个配方耐离心性质、耐冷耐热性质均能通过。进一步以Origin9.0软件对表3中的性状均匀性、润滑性、黏度和保湿率结果进行分析，结果表明：水凝胶性状均匀性(Y1)与卡波姆980(X1)间的直线方程具有最高的拟合度，Y1＝11.678-4.821X1，R2＝0.829，F＝30.124，P＝0.003，方程有极显著意义，说明水凝胶性状均匀性(Y1)与卡波姆980(X1)在0.4％-1.6％(w/w)范围内的用量成反比，而与丙三醇(X2)、丙二醇(X3)用量关系不大。润滑性(Y2)与丙三醇(X2)、丙二醇(X3)间的直线方程具有最高的拟合度，Y2＝0.286+0.300X1+0.100X2，R2＝0.717，F＝8.580，P＝0.035，方程有显著意义，说明润滑性(Y2)与丙三醇(X2)、丙二醇(X3)在5％-20％(w/w)范围内的用量均呈正比，而与卡波姆980用量关系不大。黏度(Y3)与卡波姆980(X1)间的二次方程具有最高的拟合度，Y3＝27.679X1-13.393X12-6.214，R2＝0.762，F＝76.657，P＜0.001，方程有极显著意义，说明黏度(Y3)与卡波姆980(X1)在0.4％-1.6％(w/w)范围内的用量呈先变好后变差的趋势，而与丙三醇(X2)、丙二醇(X3)用量关系不大。保湿率(Y4)与丙三醇(X2)、丙二醇(X3)间的直线方程具有最高的拟合度，Y2＝0.148+0.017X1+0.010X2，R2＝0.787，F＝12.087，P＝0.020，方程有极显著意义，说明保湿率(Y4)与丙三醇(X2)、丙二醇(X3)在5％-20％(w/w)范围内的用量均呈正比，而与卡波姆980用量关系不大。综合分析性状均匀性(Y1)，润滑性(Y2)，黏度(Y3)，保湿率(Y4)的均匀设计结果和水凝胶制备工艺的工业化可操作性，确定水凝胶基质优选处方为卡波姆980(X1)1％(w/w)、丙三醇(X2)20％(w/w)、丙二醇(X3)20％(w/w)。实施例3聚维酮K30加入量优化的体外透皮实验本实施例中水凝胶基质的制备方法同实施例1。以水凝胶总重量为100g计算，卡波姆980投药量固定为1g，丙三醇、丙二醇投药量均固定为20g，固定其它成分的投药量，调整10％聚维酮K30溶液投药量分别为5ml、10ml、20ml，以注射用水补充至水凝胶基质总重量为95g。固定神经生长因子溶液浓度为0.2mg/ml，加入量为5ml。使聚维酮K30加入量与卡波姆比例分别为1:2、1:1、2:1，并以注射用水代替上述10％聚维酮K30溶液作为空白对照，分别制备不同配方的含神经生长因子的水凝胶，进行体外透皮实验检测神经生长因子的释放。体外透皮实验方法：采用药物透皮扩散实验仪(JRYJ-6A型，上海黄海药检仪器有限公司)，将预处理好的兔皮皮肤角质层向下固定于供给池和接受池之间，在供给池中加入1.0g凝胶剂，接受池中加入6.6ml生理盐水作为接收介质，内含磁力搅拌子，以300转/分钟的速度搅拌，扩散面积为2.54cm2，外置恒温水浴(32.0±1.0℃)中。预处理好的兔皮皮肤处理方法：取体重约3kg的健康家兔，处死剥离皮肤，取腹部皮肤，用10％的硫化钠脱毛，去除皮下脂肪，用纯化水反复冲洗，直至无混浊为止，浸泡于生理盐水中，冰箱中冷冻保存，备用。每次实验前，常温解冻，仔细检查兔皮的完整性，不得有任何破损。体外透皮实验进行12h后从接收池斜口全部将接收介质提取出，以ELISA法(CYT304神经生长因子ELISA检测试剂盒，默克密理博(中国)有限公司，LOT2513960)检测接收介质中神经生长因子浓度，计算12h神经生长因子透皮释放量(％，接收介质中的神经生长因子含量与凝胶中的总神经生长因子含量之百分比)，每组样品各进行3次实验，以均数±标准差对结果进行描述，进行t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。体外透皮实验检测聚维酮K30与卡波姆980之比对12h神经生长因子透皮释放量的影响，结果如表4。表4聚维酮K30与卡波姆980之比对12h神经生长因子透皮释放量的影响表聚维酮K30与卡波姆980之比空白对照1:21:12:112h神经生长因子透皮释放量36.5±8.653.6±7.3*56.2±7.9*41.8±9.5注：*与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。从表4可知，加入聚维酮K30的含神经生长因子水凝胶释药速率大幅提高，且加入不同比例的各组均明显高于未加入聚维酮K30的空白对照组。其中，当聚维酮K30与卡波姆980之比为1:1时，12h神经生长因子透皮释放量最大，显著高于空白对照组(P＜0.05)，达到空白对照组的1.5倍以上；但当聚维酮K30与卡波姆980之比增加为2:1时，12h神经生长因子透皮释放量反而出现下降，与空白对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；说明优选的聚维酮K30与卡波姆980之比为1:1。因此，在含神经生长因子的水凝胶凝胶基质中加入聚维酮K30与卡波姆980进行配比取得了意想不到的技术效果，大幅度提高了水凝胶中神经生长因子透皮释放量。其可能的原因在于聚维酮K30具有吸水膨胀性，能作为凝胶孔状结构调节剂，其与卡波姆980配伍使用能使生成的水凝胶网状结构相对疏松，孔道增大，从而增加水凝胶中神经生长因子的释放。实施例4本发明含神经生长因子的水凝胶的制备本发明含神经生长因子的水凝胶的制备处方见表5，其中实施例4为空白水凝胶，实施例5-8为含有10μg/g-120μg/g神经生长因子的水凝胶。表5实施例4-8处方用量表制备方法同实施例1。实施例5本发明含神经生长因子的水凝胶的制备处方见表5；制备方法同实施例1。实施例6本发明含神经生长因子的水凝胶的制备处方见表5；制备方法同实施例1。实施例7本发明含神经生长因子的水凝胶的制备处方见表5；制备方法同实施例1。实施例8本发明含神经生长因子的水凝胶的制备处方见表5；制备方法同实施例1。对比例9对比例含神经生长因子的水凝胶的制备依据中国专利CN200310120873.8中神经生长因子凝胶剂的处方进行配置，处方如下：卡波姆9400.6-0.8g；三乙醇胺3.5-6g；氮酮2-4g；丙二醇9-12g；尼泊金乙酯0.6-1.0g；神经生长因子1mg。将卡波姆940分散于适量的热注射用水中，45-58℃，放置24h自溶解，用三乙醇胺调pH值6.5-7.5，将用少量双蒸水溶解的神经生长因子、处方量的尼泊金乙酯、丙二醇、氮酮加入凝胶中，混合并加入余量水(凝胶总质量为100g)，得神经生长因子凝胶剂。实施例10含神经生长因子的水凝胶活性测定含神经生长因子的水凝胶活性测定参照2015版中国药典《鼠神经生长因子生物学活性测定法，第二法：TF-1细胞/MTS比色法》进行。具体实施步骤如下：本实施例中所述基础培养液为90％RMPI1640+10％胎牛血清，所述完全培养液为90％RMPI1640+10％胎牛血清+25ng/ml神经生长因子，RMPI1640(11875-085，美国Gibco公司)、胎牛血清(26400-044，美国Gibco公司)均为市售试剂，神经生长因子为未名生物医药有限公司生产的商品化“恩经复”注射用鼠神经生长因子(含量不低于18μg/支，国药准字S20060052)。以基础培养基将神经生长因子活性国际标准品(96/366，NISBC，10000U/支)梯度稀释至100U/ml(每步稀释不得大于10倍)，即得标准品溶液。取含神经生长因子的水凝胶适量，以基础培养基溶解，再以基础培养基梯度稀释至100U/ml(每步稀释不得大于10倍)，即得供试品溶液。TF-1细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105～7.0×105个细胞，传代后24-36h用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量TF-1细胞培养物，离心收集TF-1细胞，用RPMI1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成每1ml含5.0×104个细胞的细胞悬液，置于37℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液100μl的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养72h。每孔加入MTS溶液20μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养3h。以上操作在无菌条件下进行。将96孔细胞培养板放入酶标仪，以550nm为参比波长，在波长490nm处测定吸光度，记录测定结果，试验数据采用Pro5Software数据分析软件进行处理，并编入按下式计算结果：式中：Pr为标准品生物学活性，U/ml；Ds为检品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为检品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效量的稀释倍数。含神经生长因子的水凝胶检品比活性(U/g)＝检品生物学活性/凝胶质量在凝胶制备完成后，对实施例4-8和对比例9制备的含神经生长因子的水凝胶活性进行测定，结果如表6。表6实施例4-8和对比例9制备的含神经生长因子的水凝胶生物学活性水凝胶实施例4实施例5实施例6实施例7实施例8对比例9生物学活性(U/g)010929211456111212304510067从表6可知，实施例4制备的空白凝胶对活性检测无干扰，实施例5-8和对比例9含神经生长因子的水凝胶活性与加入的神经生长因子含量成正比。实施例11含神经生长因子的水凝胶性质评价对实施例4-8和对比例9制备的含神经生长因子的水凝胶性质评价，按照实施例2中方法进行凝胶性状评价，结果见表7。表7实施例4-8和对比例9制备的含神经生长因子的水凝胶性质评价表由表7可知，实施例4-8制备的含神经生长因子的水凝胶性质基本一致，不同含量的神经生长因子对于凝胶性状未见影响，实施例4-8的性状均匀性得分与对比例9相差不大，但实施例4-8的润滑性、黏度得分均明显高于对比例9。且实施例4-8制备的含神经生长因子的水凝胶的12h保湿率均明显高于对比例9，均在对比例9的2.5倍以上。说明本发明的含神经生长因子的水凝胶性状均匀、润滑性和黏度适宜，且水凝胶保湿效果好，能满足皮肤溃疡等治疗的湿性愈合要求，促进皮肤创伤的修复和愈合。实施例12含神经生长因子的水凝胶稳定性评价将实施例4-8和对比例9制备的含神经生长因子的水凝胶灌装于内涂层封口铝管中，密封置于4℃下，分别于第0个月、1个月、3个月、6个月、12个月检测凝胶的外观、装量、pH值、生物学活性和无菌检查等性质评价，其中生物学活性测定参照实施例9，其它项目均按照《中国药典》2015版进行检测，结果如表8-13。表8实施例4制备的含神经生长因子的水凝胶稳定性评价表表9实施例5制备的含神经生长因子的水凝胶稳定性评价表表10实施例6制备的含神经生长因子的水凝胶稳定性评价表表11实施例7制备的含神经生长因子的水凝胶稳定性评价表表12实施例8制备的含神经生长因子的水凝胶稳定性评价表表13对比例9制备的含神经生长因子的水凝胶稳定性评价表由表8-13可知，本发明含神经生长因子的水凝胶(实施例4-8)12个月内各项指标均满足规定，其中实施例5-8所制备的神经生长因子水凝胶的生物学活性保持稳定。而对比例9含神经生长因子的水凝胶其它各项指标能满足规定，但水凝胶的生物学活性有明显的下降。说明本发明含神经生长因子的水凝胶的稳定性极高，3-12个月的生物学活性均显著高于对比例，在临床应用中具有明显的优势，利于该含神经生长因子的水凝胶的工业化生产和应用。实施例13本发明含神经生长因子的水凝胶神经生长因子透皮释放性能测定对实施例4-8和对比例9制备的含神经生长因子的神经生长因子透皮释放性能进行测定，方法如实施例3，结果如表14。表14实施例4-8和对比例9制备的含神经生长因子的水凝胶12h神经生长因子透皮释放量表水凝胶实施例4实施例4实施例5实施例6实施例7对比例9透皮释放量％054.7±8.1*56.1±10.1*56.3±9.2*56.8±7.5*35.9±7.8注：*与对比例9比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。从表14可知，实施例4制备的空白凝胶对神经生长因子透皮释放实验无干扰，实施例5-8制备的含神经生长因子的水凝胶12h神经生长因子透皮释放量(％)基本一致，12h神经生长因子透皮释放量显著高于对比例9(P<0.05)。说明本发明含神经生长因子的水凝胶能显著改善神经生长因子透皮释放性能，从而提高神经生长因子药物浓度，进而改善临床治疗效果，并降低给药频率，具有极高的临床价值。实施例14本发明含神经生长因子的水凝胶对大鼠皮肤压力性溃疡的治疗效果含神经生长因子的水凝胶对大鼠皮肤压力性溃疡的治疗实验方法，步骤如下：将购买的SPF级SD雄性大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号2015000506695)适应性喂养3天后，实验当日禁食，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，对大鼠背部对大鼠背部用脱毛膏脱毛处理，24h后，拉起大鼠背侧中间部位皮肤，将两片圆片形磁铁(直径20mm，厚4mm，平均磁力2500高斯左右)对夹在皮肤上，两片磁铁圆心间隔大约3cm，16h后取下磁铁，进行1个循环造模。缺血再灌注过程中大鼠自由进食、饮水，单只饲养于不锈钢笼盖的鼠笼中。按溃疡面积、溃疡评分和动物体重将动物随机分为7组(依据溃疡面积均匀性每组10只×2溃疡创面)：G1:生理盐水；G2:空白凝胶(实施例4所制备空白凝胶)；G3：10μg/g含神经生长因子水凝胶(对比例9所制备凝胶)；G4:10μg/g含神经生长因子水凝胶(实施例5所制备凝胶)；G5:20μg/g含神经生长因子水凝胶(实施例6所制备凝胶)；G6:60μg/g含神经生长因子水凝胶(实施例7所制备凝胶)；G7:120μg/g含神经生长因子水凝胶(实施例8所制备凝胶)。根据分组时压疮面积按照100mg/cm2·d涂布受试物，每次涂布固定量，每天1次。实验期间观察凝胶涂抹性和大鼠皮肤毒性、刺激性反应，每一周进行1次溃疡面积(cm2)观察，持续15天后进行皮肤病理切片并进行结果分析(图1)。采用SPSS19.0软件进行统计学分析。溃疡面积以均数±标准差(x±s)对进行描述，进行t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。实验期间G2、G4-G7的涂抹性较佳，溃疡面组织渗透液被吸收，效果均优于G3；所有大鼠均未出现皮肤毒性和刺激性反应；G1-G7各组大鼠压力性溃疡面积比较如表15；G1-G7各组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片如图1-7。图1是G1组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G1组1号大鼠(总编号1)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G1组1号大鼠(总编号1)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。从图1中可以看出，G1组大鼠上皮出现角质化、结痂、炎症细胞浸润，真皮内的结缔组织有轻微到中度纤维玻璃化。图2是G2组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G2组1号大鼠(总编号13)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G2组1号大鼠(总编号13)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。从图2中可以看出，G2组大鼠上皮出现角质化、结痂、炎症细胞浸润，真皮内的结缔组织有轻微到中度纤维玻璃化。图3是G3组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G3组2号大鼠(总编号26)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G3组2号大鼠(总编号26)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。从图3中可以看出，G3组大鼠上皮出现角质化、结痂、炎症细胞浸润，真皮内的结缔组织有轻微到中度纤维玻璃化。图4是G4组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G4组5号大鼠(总编号41)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G4组5号大鼠(总编号41)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。从图4中可以看出，G4组大鼠上皮出现角质化、结痂、炎症细胞浸润，真皮内的结缔组织有轻微到中度纤维玻璃化。图5是G5组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G5组4号大鼠(总编号52)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G5组4号大鼠(总编号52)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。从图5中可以看出，G5组大鼠上皮出现角质化、结痂、炎症细胞浸润，真皮内的结缔组织有明显纤维玻璃化。图6是G6组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G6组2号大鼠(总编号62)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G6组2号大鼠(总编号62)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。从图6中可以看出，G6组大鼠上皮出现角质化、结痂、炎症细胞浸润，真皮内的结缔组织有明显纤维玻璃化。图7是G7组大鼠给药15天时压力性溃疡创面皮肤病理切片图。其中(A)为G7组6号大鼠(总编号78)创面1放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示，(B)为G7组6号大鼠(总编号78)创面2放大倍数2×和放大倍数10×的结果显示。从图7中可以看出，G7组大鼠上皮出现角质化、结痂、炎症细胞浸润，真皮内的结缔组织有明显纤维玻璃化。表15G1-G7各组压力性溃疡面积比较表注：①与G1:生理盐水相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；②与G2:空白凝胶(实施例4所制备凝胶)相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；③与G3：10μg/g含神经生长因子水凝胶(对比例9所制备凝胶)相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。由表15可知，在15天时，实施例4-8(G4-G7)和对比例9(G3)组的溃疡面积均明显低于生理盐水组(G1)；其中实施例5-8(G5-G7)、对比例9(G3)组的溃疡面积均明显低于实施例4(G2)；且实施例5-8(G5-G7)溃疡面积均明显低于对比例9(G3)；差异均具有统计学意义(P<0.05)。本实验目的是检测大鼠正常皮肤在承受两块平均磁力约2500高斯的磁铁挤压后，形成的压力性溃疡创面经过15天含神经生长因子的水凝胶治疗后的反应，观察溃疡面的变化情况，以判断含神经生长因子的水凝胶的治疗效果。由图1的皮肤病理切片结果可知：G1-G7各组皮下组织中的变化基本类同，各组的上皮角质化、结痂、炎症细胞浸润无显著差异，其中G4、G5、G6组的上皮可见增生、增厚；由于压力的影响，各组真皮内的结缔组织或有纤维玻璃化的趋势，其中G1、G2、G3和G4组有轻微到中度的呈现，而G5、G6及G7组有较明显变化。这些皮肤病理切片改变主要与新生成的微血管成正比例，即血管数越多玻璃化面积越大，溃疡愈合进展愈好。实施例4(G2)所制备的空白凝胶对大鼠皮肤压力性溃疡具有较好的治疗效果，说明本发明制备的水凝胶空白基质能满足伤口湿性愈合的要求，能加速溃疡的愈合。实施例5-8(G5-G7)、对比例9(G3)组的溃疡面积均显著低于实施例4，说明神经生长因子对对大鼠皮肤压力性溃疡疗效显著，含神经生长因子的水凝胶在治疗大鼠皮肤压力性溃疡中具有重要的潜力。而实施例5-8(G5-G7)溃疡面积均显著低于对比例9，说明本发明所制备的含神经生长因子的水凝胶的治疗效果要显著优于对比例9(G3)，其可能的原因在于：(1)对比例9(G3)制备的凝胶基质使用的是卡波姆940，与卡波姆980制备的水凝胶相比，凝胶的润滑性和黏度均较差，可能影响溃疡愈合；(2)对比例9(G3)制备的凝胶剂保湿性能未得到验证，不能确保伤口、溃疡处等作用部位的湿性愈合要求；(3)对比例9(G3)制备的凝胶剂稳定性相对较差，可能导致凝胶中神经生长因子的生物学活性出现不稳定和下降；4)对比例9(G3)制备的凝胶剂神经生长因子透皮释放量较低，与本发明所制备的含神经生长因子的水凝胶相差明显，导致神经生长因子滞留在凝胶内，不能在溃疡面发挥疗效。可见，本发明含神经生长因子的水凝胶在压力性溃疡的治疗中具有很好的技术效果，水凝胶制备简单、质地均匀、易于涂抹、无皮肤刺激性，保湿和组织渗透液吸收性能好，且突破了水凝胶外用制剂中神经生长因子透皮释放和活性维持等重大技术难题，具有高度的产业化潜力。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页1 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