优化的溶瘤病毒及其用途的制作方法

本申请要求于2016年9月27日提交的美国临时专利申请序列号62/400,310和于2016年11月28日提交的美国临时专利申请序列号62/426,724的优先权。将这些申请的公开内容以其整体通过引用并入。

背景技术：

本申请通过引用并入作为sato2000002_st25.txt递交的序列表，该序列表于2016年9月26日创建并且具有17,720字节的文件大小。

本公开涉及用于抑制或减少癌性细胞增殖和恶性肿瘤进展的方法。还公开了用于在该方法中使用的组合物。最后，本文中还描述了用于制备在治疗癌性肿瘤中使用的多种类型的经生物选择和合成的病毒的方法。

癌症是细胞的异常生长，其可产生可能变为恶性肿瘤或赘生物的组织块。这些形成物可侵袭和破坏周围组织，并且可能扩散至身体的其他部分而形成转移。

癌细胞通常易于受到许多科的病毒影响而感染和致死。这可能是因为：(i)由于混乱的组织结构、失去细胞间的接触和渗漏的新血管系统，恶性细胞更加充分地暴露于病毒；(ii)作为病毒进入细胞之受体的许多细胞表面蛋白的频繁过表达；以及(iii)由于频繁失去抗病毒固有免疫机制、受损的细胞死亡途径以及预先激活的核酸和蛋白质合成，癌细胞内具有更加有利于病毒复制的条件。

开发另外的病毒和使用这样的病毒的方法将是有利的，这包括同时施加数种不同的溶瘤病毒和这些病毒的不同组合，以在有此需要的患者中提供个体化治疗并防止由于癌性细胞对一些病毒的抗性和发生抗病毒适应性免疫力所致的疾病复发与不完全治疗。

简述

在本文的多个实施方案中公开了通过施用一组溶瘤病毒来选择性杀伤癌性细胞和系统性消除肿瘤转移的方法。不同组合的溶瘤病毒可同时(即在单次施用中多种病毒)或顺序地(即每次施用一种病毒，但在随时间的多次施用中给予多种病毒)施用至患者。溶瘤病毒的组合使用可以改善治疗结果。还描述了经生物选择和合成的病毒以及用于产生这样的病毒的方法。还公开了用于确定患者对溶瘤病毒敏感性的方法。

在多个实施方案中公开了治疗癌症患者的方法，其包括：向患者施用含有有效量的至少第一种溶瘤病毒的第一组合物持续第一时间段；和向所述患者施用含有有效量的至少第二种溶瘤病毒的第二组合物持续第二时间段，该第二种溶瘤病毒与第一种溶瘤病毒是不同的。

第二组合物可以在施用第一组合物之后24小时至24周施用。在更具体的实施方案中，第二组合物在施用第一组合物之后一周至六周施用。

第一组合物可以在第一时间段期间多次施用。第二组合物可以在第一时间段期间多次施用。

含有没有被抗病毒抗体交叉中和的不同病毒的第一和第二组合物可以经口、经鼻、静脉内、动脉内、皮内、皮下、肌内、腹膜内、胸膜内、尿道内、阴道内、瘤内、颅内、椎管内施用，或者通过在体外用病毒预先感染的细胞载体(分离自患者)的系统性施用来进行施用。

第一和第二(或第三，等等)溶瘤病毒可以分别以约10⁴(10^4)tcid50/ml至10¹¹(10^11)tcid50/ml的剂量在其各自组合物中存在。

通常来说，在这些治疗方法中使用的第一种和第二种(或第三种等)溶瘤病毒进入细胞所需的宿主细胞表面受体不同，或者在影响有效复制或癌细胞杀伤的其他癌细胞特异性变化或肿瘤环境指定变化方面存在差别。进入细胞所需的宿主细胞表面受体包括但不限于pvr(cd155)、整联蛋白α2β1、整联蛋白αvβ3、整联蛋白αvβ6、icam-1、cd55、cxadr、cd46、jam-1、pvrl1、pvrl4、slam(cd150)、pslg1(cd162)、scarb2、dc-sign、l-sign、vldvr、nramp2、硫酸肝素(heparinsulphate)或唾液酸。影响有效复制或癌细胞杀伤的癌细胞特异性变化或肿瘤环境指定变化包括但不限于特异性致癌突变(在k-ras、h-ras、n-ras、egfr、p53、her2基因等中)；在细胞增殖或细胞死亡机制方面的特异性改变；干扰素诱导途径的组分方面的缺陷；在干扰素响应途径的组分方面的缺陷；在膜结合和分泌蛋白酶、蛋白酶抑制剂或细胞外基质的组分的活性方面的变化；肿瘤内的基质和新生血管网络的发展；以及利用巨噬细胞、白细胞、树突状细胞等的肿瘤浸润。

在特别的实施方案中，第一和第二组合物各自含有多种溶瘤病毒。第一种溶瘤病毒和第二种溶瘤病毒可以独立地选自，但不限于，人肠道病毒(enterovirus)(如艾柯病毒(echovirus)，柯萨奇病毒(coxsackievirus)，脊髓灰质炎病毒(poliovirus)sabin毒株，或鼻病毒(rhinovirus))；或呼肠孤病毒(reovirus)(如1型、2型和3型哺乳动物正呼肠孤病毒(orthoreovirus)等)；副黏病毒(paramyxovirus)(如人麻疹(measle)或腮腺炎(mump)病毒、犬瘟热病毒(caninedistempervirus)、小鼠仙台(sendai)病毒或禽新城疫病毒(newcastlediseasevirus))；弹状病毒(rhabdovirus)(如水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus)、卡拉加斯(carajas)病毒、马拉巴(maraba)病毒或皮里(piry)病毒)；披膜病毒(togavirus)；疱疹科病毒(herpesfamilyvirus)；腺病毒(adenovirus)；痘病毒(poxvirus)；以及含有来源于特定病毒科之内或之外的其他病毒的天然或经修饰组分的杂合病毒(hybridvirus)。本文中还设想了同时施用的这些病毒的组合。在多个实施方案中，第一和第二组合物可以具有总计两种或三种或四种不同的病毒。如需要，另外的组合物也可以在不同的间隔时间顺序地施用至患者。

还公开了产生优化的溶瘤病毒的方法，其包括：(i)在合成的核糖核苷或核糖核苷酸类似物的存在下，在第一细胞培养物上培养第一种溶瘤病毒以产生诱变病毒；和(ii)利用系列稀释在第二细胞培养物上培养该诱变病毒以鉴定优化的溶瘤病毒。

合成的核糖核苷或核糖核苷酸类似物可以是病毒唑；5-氮杂胞苷；5-氟尿嘧啶；5-氮杂-5,6-二氢-2-脱氧胞苷；n4-氨基胞苷；n1-甲基-n4-氨基胞苷；3,n4-乙烯胞苷；3-甲基胞苷；5-羟基胞苷；n4-二甲基胞苷；5-(2-羟乙基)-胞苷；5-氯胞苷；5-溴胞苷；n4-甲基-n4-氨基胞苷；5-氨基胞苷；5-亚硝基胞苷；5-(羟烷基)-胞苷；5-(硫烷基)-胞苷和胞苷乙二醇；5-羟基尿苷；3-羟乙基尿苷；3-甲基尿苷；o2-甲基尿苷；o2-乙基尿苷；5-氨基尿苷；o4-甲基尿苷；o4-乙基尿苷；o4-异丁基尿苷；o4-烷基尿苷；5-亚硝基尿苷；5-(羟烷基)-尿苷；5-(硫烷基)-尿苷；1,n6-乙烯腺苷；3-甲基腺苷；n6-甲基腺苷；8-羟基鸟苷；o6-甲基鸟苷；o6-乙基鸟苷；o6-异丙基鸟苷；3,n2-乙烯鸟苷；o6-烷基鸟苷；8-氧代-鸟苷；2,n3-乙烯鸟苷；或8-氨基鸟苷。合成的核糖核苷或核糖核苷酸类似物可以以约0.1mm至约0.5mm的量与第一细胞培养物一起存在。

在特定的实施方案中，第二细胞培养物与第一细胞培养物是不同的，并且含有作为优化的溶瘤病毒的所需靶标的细胞。这确认了优化的溶瘤病毒在要治疗的癌性细胞内良好复制。

可以在约12小时至约36小时的第一时间段之后从第一细胞培养物收集诱变病毒。可以以约0.05pfu/细胞至约0.50pfu/细胞的量将第一种溶瘤病毒添加至第一细胞培养物。

在一些实施方案中，第一种溶瘤病毒还在抗体的存在下在第一细胞培养物上培养，使得优化的溶瘤病毒对于该抗体具有提高的抗性。

步骤(i)和(ii)通常顺序地重复，其中对于随后的每次重复，将步骤(ii)的优化的溶瘤病毒用作步骤(i)的第一种溶瘤病毒。每次额外的重复产生来源于前一轮的最适病毒的额外诱变病毒，以及对于所需性状/性能的额外选择。这既可以用于选择能够在特定靶细胞类型中复制的病毒，也可以用于选择抗体对其具有较小作用的病毒。

还公开了由参考病毒产生合成的靶向病毒的方法，其包括：对于参考病毒中编码给定氨基酸的每个密码子，鉴定编码该给定氨基酸的所有密码子，并且在合成的靶向病毒中使用这样的用于该给定氨基酸的密码子：其(i)相比于参考病毒orfeome(所表达的全部蛋白质编码开放阅读框(orf)的集合)，在癌细胞的orfeome中具有最类似的使用频率和/或(ii)在其频率/解码速率方面是最佳的，以确保病毒mrna在癌细胞中的局部翻译动力学(考虑存在于未转化细胞和恶性细胞中的trna库)与未转化细胞中的病毒翻译动力学是相似的。这利用了以下事实：(i)trna的丰度通常与给定细胞/组织中的密码子使用频率成正比；(ii)通常，由于对应的频繁同源trna的更易可得性(在信息的解码期间)，频繁使用的密码子比不经常使用的密码子更快速地被翻译(反之亦然)；(iii)与trna基因群的变化一致，在细胞类型/组织之间的最佳/频繁和非最佳/稀有密码子也有差异；(iv)在增殖性(即癌性)细胞中被诱导并以高水平表达的所选trna(这些trna被认为驱动癌细胞进展)典型地在分化(即，非癌性)细胞中被抑制并且以低水平表达；(v)同义密码子使用不仅影响mrna翻译率/蛋白质表达水平，而且影响细胞中的蛋白质折叠；以及(vi)密码子使用谱图用作用于细胞中的蛋白质折叠的动力学指引(kineticguide)。因此，来自合成病毒的蛋白质的表达在正常细胞中减弱，但在癌性细胞中增强，同时，保持了癌细胞中病毒蛋白的正确折叠，而同时正常细胞中的折叠受到影响。

在特别的实施方案中，参考病毒是溶瘤病毒。合成的靶向病毒可以与参考病毒具有小于85％的核苷酸同一性，或者可具有小于80％的核苷酸同一性或小于75％的核苷酸同一性。然而，通常，合成的靶向病毒与参考病毒具有至少67％的核苷酸同一性。

还公开了用于鉴定患者对溶瘤病毒的敏感性的方法，其包括：用第一种溶瘤病毒感染从患者获得的肿瘤细胞；培养被感染的肿瘤细胞以确定第一种溶瘤病毒的浓度；以及如果该浓度大于阈值，则将患者鉴定为对第一种溶瘤病毒是敏感的。

阈值可以根据被测试的病毒而变化。在一些特别实施方案中，阈值可以为10⁶(10^6)tcid50/ml。可以通过手术或活检从患者收集肿瘤细胞。

在被感染之前，可以将肿瘤细胞悬浮在细胞培养基中。可以通过在含有约5％co2的气氛中在约35℃至约45℃的温度下孵育培养被感染的肿瘤细胞，持续约24小时至约72小时的时间。

溶瘤病毒可以是人肠道病毒；呼肠孤病毒；副黏病毒；弹状病毒；披膜病毒；疱疹病毒；细小病毒；腺病毒；痘病毒；或者含有来源于特定病毒科之内或之外的其他病毒的天然或经修饰组分的杂合病毒。

通过本文公开的这些方法和组合物以及病毒治疗的癌性肿瘤可以包括乳腺、宫颈、结肠、肝、肺、卵巢、胰腺、前列腺、肾脏、肾上腺、甲状腺、脑、软组织、间皮、血液或骨癌肿瘤。

本文中描述的溶瘤病毒组合物可以与化学治疗、免疫治疗、放射治疗、药物治疗或细胞移植联合施用。

本公开内容的这些和其他非限制性特性在下文更具体地公开。

附图简述

本专利或申请文件包含至少一幅彩色的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在经请求和支付必要费用后由官方提供。

以下是附图的简述，其出于对本文中公开的示例性实施方案进行示例性说明的目的，而非出于对其进行限制的目的而给出。

图1a-1c是一组表明在具有c33a、aspc1和mcf7人癌细胞系的异种移植物的裸小鼠中在50天时间内的肿瘤生长的图。

图1a示出了单独(正方形)的c33a细胞系或用柯萨奇病毒b3(cox-b3，圆形)或柯萨奇病毒a7(cox-a7，三角形)感染的c33a细胞系随时间(天)的肿瘤体积(mm³)。y轴以500为间隔从0延伸至3000。x轴以10为间隔从0延伸至50。在第50天，c33a具有最大的肿瘤体积，接着是cox-b3，然后是cox-a7。

图1b示出了单独(正方形)的aspc1细胞系或用柯萨奇病毒b4(cox-b4，圆形)或柯萨奇病毒a7(cox-a7，三角形)感染的aspc1细胞系随时间(天)的肿瘤体积(mm³)。y轴以500为间隔从0延伸至3000。x轴以10为间隔从0延伸至50。在第50天，aspc1具有最大的肿瘤体积，接着是cox-a7，然后是cox-b4。

图1c示出了单独(正方形)的mcf7细胞系或用柯萨奇病毒b6(cox-b3，圆形)或艾柯病毒1(echo1，三角形)感染的mcf7细胞系随时间(天)的肿瘤体积(mm³)。y轴以500为间隔从0延伸至3000。x轴以10为间隔从0延伸至50。在第50天，mcf7具有最大的肿瘤体积，接着是cox-b6，然后是echo1。

图2是表明向皮下注射了a431表皮样癌细胞的小鼠施用多种病毒组合的效果的图。y轴以500为间隔从0延伸至2500。x轴以10为间隔从0延伸至60。线分别表示单独的a431(棱形)；柯萨奇病毒b6(cox-b6，红色正方形)；柯萨奇病毒b5(cox-b5，绿色三角形)；艾柯病毒12(echo12，紫色正方形)；cox-b5+cox-b6(蓝色圆形)；以及echo12+cox-b5+cox-b6(橙色圆形)。作为参考，所有三种病毒的组合echo12+cox-b5+cox-b6(橙色圆形)总是比两种病毒cox-b5+cox-b6(蓝色圆形)具有更低的肿瘤体积。cox-b6值(红色正方形)总是比echo12值(紫色正方形)具有更高的肿瘤体积。

图3是密码子使用谱图的一个实例，即密码子频率(y轴)相对于密码子位置(x轴)的图，其针对(a)天然脊髓灰质炎病毒序列(1型sabin毒株)(棱形)；(b)人癌细胞中的天然1型sabin毒株序列(从癌细胞中观察到的trna群推断的密码子使用)(正方形)以及(c)优化的序列，其编码与天然序列相同的多聚蛋白，但针对在癌细胞中观察到的trna文库进行优化(三角形)。

图4是针对以下的更大量的密码子使用谱图：(a)人细胞中的天然1型sabin毒株序列(棱形)；(b)癌细胞中的天然1型sabin毒株序列(正方形)；以及(c)优化的序列(三角形)。在此图中，示出了密码子150-210。

图5是比较了在静止(rd细胞)和指数分裂293t细胞中的未经修饰的脊髓灰质炎病毒1相对于密码子优化的脊髓灰质炎病毒株1的柱状图。合成/密码子优化的病毒显示在分裂细胞中的优先(高约3倍)复制。y轴是以对照细胞的百分比的病毒效价，并且以50的增量从0延伸至350。

图6是一组四幅图，其显示了在包括免疫缺陷(裸)小鼠异种移植模型的临床前实验中的体内肿瘤细胞生长的病毒效力。在上排中，皮下注射宫颈癌(c33a)细胞，并且静脉内注射艾柯病毒1。左侧照片是病毒注射前，右侧照片是病毒注射后16天。在下排中，皮下注射结肠癌(rko)细胞，并且然后静脉内注射脊髓灰质炎病毒株1。左侧照片是病毒注射前，右侧照片是病毒注射后18天。

图7是一组六幅断层扫描图，其示出了在人中的病毒效力。施用仙台病毒(strs1)以治疗42岁女性的人颗粒细胞卵巢癌(具有向腹膜的转移)。左栏是一组在病毒治疗之前的三幅断层扫描图。每周皮内注射仙台病毒导致在3个月时间内肿瘤体积的显著减小。右栏是一组病毒治疗后的三幅断层扫描图。对肿瘤块(包括多种转移性结节)画圈。

图8是一组示出了在人中的病毒效力的两幅磁共振成像(mri)图。施用数个疗程的呼肠孤病毒1，肌内地10⁹ie；艾柯病毒1，肌内地10⁹ie；柯萨奇病毒b5，肌内地10⁹ie；柯萨奇病毒a7，肌内地10⁸ie；以及脊髓灰质炎病毒株1，肌内地10⁸ie，以治疗49岁女性患者的脑弥漫性星形细胞瘤(具有左额叶的大面积轴内肿瘤)。该患者经历左额叶次全切除术，但肿瘤不可能完全切除，因为肿瘤生长太靠近脑的要害部位。在一个疗程的放射治疗和数个疗程的化学治疗后，肿瘤尺寸增大。每周肌内注射溶瘤病毒导致在4个月时间内肿瘤体积显著减小。左侧图像是切除后且病毒治疗前的mri。右侧图像是施用病毒治疗后的mri。对肿瘤结节画圈。

详述

通过参考本文中包括的期望实施方案和实施例的以下详述，可以更容易地理解本公开内容。在以下说明书和所附的权利要求书中，将提及大量术语，这些术语将被定义为具有以下含义。

尽管为了清楚而在以下描述中使用了具体的术语，但是这些术语意图仅提及选择用于附图中举例说明的实施方案的特定结构，而不意图限定或限制本公开内容的范围。在以下的附图和随附描述中，应理解，相同的数字标志是指功能相似的部件。此外，应理解附图不是按比例的。

除非上下文另有明确指明，无数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种所述名词。

如在说明书中和权利要求书中使用的，术语"包括"可以包括"由…组成"和"基本上由…组成"的实施方案。如本文中使用的，术语“包括”、“包含”、“具有”、“具备”、“可以”、“含有”及其变形意图是要求存在所指定成分/步骤并且允许存在其他成分/步骤的开放式过渡短语、术语或词语。然而，这样的描述应被解释为还将组合物或方法描述为"由所列举的成分/步骤组成"和"基本上由所列举的成分/步骤组成"，其允许仅存在所指定的成分/步骤，连同可能由其引起的任何杂质，并且排除其他成分/步骤。

本申请说明书和权利要求书中的数值应被理解为包括当减少至相同数目的有效数字时相同的数值，以及与所述值的差值小于本申请中所描述类型的用于确定该值的常规测量技术的实验误差的数值。

本文中公开的所有范围包含所列举端点并且是可独立组合的(例如，范围“2克至10克”包括端点2克和10克，以及所有的中间值)。

术语“约”可以用来包括在不改变数值的基本功能的情况下可以变化的任何数值。当与范围一起使用时，“约”也公开了由两个端点的绝对值限定的范围，例如“约2至约4”也公开了范围“2至4”。术语“约”可以指所指定数目的正负10％。

术语“肿瘤”在本文中用来指已形成肿块的赘生物和尚未形成肿块的赘生物二者。肿瘤可以是恶性的，或者潜在恶性的或继发瘤。

术语“溶瘤病毒”是指具有溶瘤性能的病毒。溶瘤病毒可以是天然的、通过选择改进的或者合成产生的。

术语“cv1”是指来源于非洲绿猴肾的细胞系(atccno.ccl-70)。cv-1细胞表现出成纤维细胞样形态，附着地生长至玻璃或塑料表面，并且对于逆转录酶呈阴性。

术语“tcid50”是指50％组织培养感染剂量，其是感染性病毒效价的量度。这种终点稀释测定对杀伤50％的感染宿主或者在50％接种组织培养细胞中产生细胞病理效应所需的病毒量进行量化。

术语“pfu”是指病毒样品中的菌斑形成单位，其是病毒数量的一个量度。这种测定基于在培养皿或多孔板中进行的微生物学方法。具体地，用处于不同稀释度的病毒感染宿主细胞的汇合单层并用半固体培养基覆盖以防止病毒感染任意地扩散。病毒斑在病毒感染固定细胞单层内的细胞时形成。经病毒感染的细胞将溶解并且将感染扩散至相邻细胞，在那里重复感染至溶解循环。经感染的细胞区域将形成斑(由未感染细胞包围的感染区域)，其可以肉眼或者利用光学显微镜看见。通常手动地对菌斑计数并且将结果与用来制备板的稀释因子组合来计算每样品单位体积的菌斑形成单位的数目(pfu/细胞)。pfu/细胞结果表示样品内感染性粒子的数目并且是基于这样的假设，即形成的每个斑代表一个感染性病毒粒子。

术语“同一性”是指一对序列(核苷酸或氨基酸)在相同位置具有相同残基的程度。同一性通过用相同残基的数目除以残基的总数目(不计间隙)并且将结果乘以100以获得百分比进行测量。因此，序列完全相同的两个拷贝具有100％的同一性，但具有缺失、插入或替换的序列会具有较低程度的同一性。本领域技术人员将认识到，可获得诸多计算机程序(如采用算法如blast的那些程序)来确定序列同一性。blast核苷酸检索利用nblast程序进行，并且blast蛋白质搜索利用blastp程序进行，使用相应程序的缺省参数。

本公开内容涉及用于通过组合使用一组溶瘤病毒来提高阳性治疗响应概率和克服抗病毒免疫力发展的问题的方法，所述溶瘤病毒在抗原结构和影响病毒进入和复制的宿主细胞特异性功能方面需求不同。

在这方面，溶瘤病毒通过包括在其溶解感染期间直接杀伤癌细胞和诱导系统性抗肿瘤免疫力的双重机制来发挥作用，所述系统性抗肿瘤免疫力即使在消除病毒后也提供持久的治疗效果。与由于癌症引发性干细胞的抗性而对于肿瘤复发生长具有有限效力的化疗药物不同，许多溶瘤病毒能够感染并杀伤癌症干细胞，从而限制复发的概率。还要指出的是，尽管正常细胞展现出病毒干涉作用(用第一病毒感染的细胞对于第二病毒的感染展现出降低的易感性)，但癌细胞可能不会。由于不同的作用机制，溶瘤病毒可以对常规化疗方法进行补充，尤其是在对其他药物具有治疗相关抗性的情况下。

可以使用许多不同的病毒科来开发安全且有效的溶瘤病毒株。其中包括(1)在人中不具有或具有非常有限的致病性的天然存在的动物病毒，(2)通常用作活的预防性疫苗的人病毒的减毒株，(3)不具有或具有有限致病性的人病毒的一些分离株，以及(4)经改造或经生物选择的病毒，其由于(a)在正常细胞中病毒杀伤所需的某些病毒功能的消除或者(b)对于进入或特异性杀伤癌性细胞提供额外的模式，而具有提高的肿瘤选择性。

包括许多不同类型的溶瘤病毒的临床研究表明，溶瘤病毒治疗总体上安全并且与最小的不良作用有关，所述不良作用包括持续多至24小时的轻微流感样症状、发热、寒颤、疲劳、头痛、恶心、低血压、心动过速、高血压、厌食和肌肉痛。然而，病毒溶瘤的治疗效力不可预测。尽管在一些患者中具有一些显著治疗效果，但随机临床试验通常显示出相当不显著的响应。许多问题仍然需要解决，才能使溶瘤病毒成为具有竞争力且有效的癌症疗法。其中包括需要可靠的溶瘤病毒递送方案、改进的肿瘤内病毒扩散、克服肿瘤微环境的免疫抑制效应、与肿瘤的快速溶解有关的危险管理和过度活跃的固有免疫反应等。

溶瘤病毒治疗的一个主要障碍是患者之间的癌细胞的显著个体变异性，其需要个体化方法。几乎每一例癌症在遗传缺陷的组合方面都是独特的。对特定溶瘤病毒株的治疗响应取决于患者肿瘤的大量个体化参数。特别地，癌细胞在识别某些病毒方面可能存在缺陷，但保留了感测和包含其他类型病毒的能力。癌细胞在某些与细胞死亡、细胞周期控制和代谢转化有关的特征方面可能不同，这些特征对于一些病毒重要，而对于其他病毒是废弃的。此外，由于癌细胞是遗传上不稳定的，所以在溶瘤病毒治疗过程中，病毒感染和复制所需的某些宿主细胞因子可能丢失，从而使得由于癌细胞的治疗抗性群体发生增殖而产生复发。因此，个体肿瘤对特定病毒的响应难以预测。

溶瘤病毒治疗的另一个障碍是不可避免地发展出针对治疗性病毒株的适应性免疫力。中和抗体在病毒进入敏感癌细胞的过程中破坏该病毒，从而降低感染的几率。尽管在治疗过程期间感染的效率降低，在治疗的某些阶段，较高剂量的病毒可以克服这种抗性。然而，由于(1)对病毒有抗性之细胞的选择或(2)中和抗体的诱导，长期使用单一溶瘤病毒特别容易复发。虽然正在测试多种细胞毒性和免疫抑制药物联合治疗方案以改善结果，但仍然存在复杂治疗冲突的挑战，其与相互冲突的作用机制有关。

本公开内容涉及使用具有溶瘤活性的非致病性人病毒来治疗癌症患者的方法，以及多组不同溶瘤病毒的组合。组合在一起使用的病毒应该有不同的抗原结构，以使它们不会与抗体交叉中和。这些病毒可以对宿主细胞特异性因子展现出重叠的需求，但不应该是相同的。这些需求可以包括但不限于病毒用于进入受体的宿主细胞表面受体、抗病毒固有免疫系统的组分等。这些病毒可以以两种、三种或更多种不同病毒的组合，顺序或同时地使用。公开了用于顺序和同时施加的溶瘤病毒组合的实例。

还公开了用于制备或选择新型溶瘤病毒的方法，所述新型溶瘤病毒是更加优化的(相对于它们的天然对应物来说)，以增加本文所述的使用病毒用于治疗癌症的治疗组的抗原性和功能多样性。这样的合成病毒可以利用密码子优化策略制备，所述优化策略在经选择的癌细胞/组织中诱导繁殖(并导致对它们的杀伤增强)，同时在正常细胞/组织中具有减弱的表达。

大体上，本公开内容涉及使用溶瘤病毒用于治疗癌症患者的方法。通常，将含有有效量的至少第一种溶瘤病毒的第一组合物施用至患者持续第一时间段。然后，将含有有效量的至少第二种溶瘤病毒的第二组合物施用至患者持续第二时间段。这些组合物顺序地施用。换句话说，施用第一组合物，然后停止第一组合物的施用并且施用第二组合物。换言之，顺序地将一组溶瘤病毒组合物施用至患者，即一次一种组合物，但连续多种组合物。

在这方面，不同的病毒血清型毒株依赖不同的宿主细胞表面蛋白受体进入细胞。例如，艾柯病毒1依赖于整联蛋白α2β1(α-2-β-1)；艾柯病毒7、12和21依赖于cd55(也称为daf)；柯萨奇病毒a7和a9依赖于整联蛋白αvβ3、整联蛋白αvβ6、icam-1和cd55；柯萨奇病毒b1-b6依赖于cxadr(也称为柯萨奇病毒和腺病毒受体或car)；柯萨奇病毒b1、b3和b5依赖于cd55；麻疹病毒的埃德蒙顿(edmonston)株依赖于cd46；犬瘟热病毒依赖于连接素4；并且正呼肠孤病毒依赖于jam-1。设想了癌细胞抵抗病毒感染的一种方法在于通过改变受体的表达和细胞表面的暴露。还可存在其他因素影响病毒感染特定细胞类型的效力。因此，顺序使用病毒应允许更长期的病毒治疗过程，避免由于发展了针对特定病毒的中和抗体或者由于对特定病毒有抗性的癌细胞的筛选所导致的单一溶瘤病毒株的效力降低(例如，通过改变特定病毒所需的宿主细胞表面受体的表达)。

因此，第一种和第二种溶瘤病毒应该彼此不同，例如进入细胞所需的宿主细胞表面受体不同。更具体地，溶瘤病毒进入细胞所需的宿主细胞表面受体可以选自pvr(cd155)、整联蛋白α2β1(α-2-β-1)、整联蛋白αvβ3(α-v-β-3)、整联蛋白αvβ6(α-v-β-6)、icam-1、cd55(akadaf)、cxadr(akacar)、cd46、jam-1、pvrl1、pvrl4、slam(cd150)、l-sign、vldvr、nramp2、唾液酸、pgsl-1(akacd162)、scarb2(清道夫受体b类，成员2)、膜联蛋白ii、dc-sign(树突状细胞特异性icam3-抓取非整联蛋白)、hpvr(人脊髓灰质炎病毒受体)、cd34+、ldlr(低密度脂蛋白受体)、jam(连接黏附分子)或硫酸乙酰肝素(heparansulfate)。第一种和第二种溶瘤病毒也可以通过靶向特定类型癌细胞中的不同特定缺陷而彼此不相同，如原致癌基因内的突变或者不同肿瘤抑制基因或在程序化细胞死亡途径方面的不同变化、负责病原体感测的抗病毒固有免疫机制的多个组分内的改变以及响应于干扰素的抗病毒抗性的发展等。癌细胞中的这些缺陷可能给某些病毒带来选择性复制和细胞杀伤的优势，而对另一些病毒则是废弃的。

不同溶瘤病毒的顺序施加提高了患者的阳性治疗反应的发生率。然而，由于组中的一些病毒株可能对患者的恶性细胞不具有活性，所以顺序施加可能导致浪费时间施加那些无效的病毒株。作为替选，可以考虑同时使用数种溶瘤病毒株。换句话说，第一组合物和/或第二组合物可以包含多种不同的溶瘤病毒。二至四种不同的溶瘤病毒株可以存在于该组的每个溶瘤组合物中。每个组合物中的病毒株应该基于它们对不同类型的恶性细胞的互补谱进行选择。该方法对于患者具有以下优点和益处：(i)更大机会阳性匹配能够破坏患者肿瘤的活性溶瘤病毒；(ii)对特定病毒有抗性的肿瘤细胞进行筛选的几率更低，该特定病毒使用特定机制来进入细胞和复制；和(iii)由于患者对溶瘤病毒的个体敏感性，并发症的几率较低。溶瘤组合物中的病毒应诱导产生保护患者免受潜在病毒病原体侵害的干扰素。癌细胞通常对干扰素的敏感性较低，这引起溶瘤病毒对恶性细胞作用特异性。病毒混合物的使用还将允许使用(a)条件性致病性病毒或(b)经定制选择的尚未经过广泛的安全试验的溶瘤病毒的变体。后者对于溶瘤病毒治疗的个体化方法特别重要。条件性(或潜在的)致病性病毒来源于快速进化的非致病性株，其形成异源的准物种(quasi-specie)，其中的一些变化可能获得致病特性，尤其是在免疫缺陷个体中。

含有溶瘤病毒的组合物可以在一段时间间隔之后顺序地使用/施用。在特别的实施方案中，使用给定组合物的间隔为约24小时至约24周。在其他实施方案中，该间隔为约一周至约六周。换言之，第二组合物在施用第一组合物此时间段之后施用。要注意的是，这些组合物可以在此时间段期间多次施用，并且在患者身体的多个位置施用。

在本文中公开的方法和组合物中使用的溶瘤病毒可以为以下科：微小核糖核酸病毒科，呼肠孤病毒科，副黏病毒科，披膜病毒科，弹状病毒科，腺病毒科，疱疹病毒科，细小病毒科，痘病毒科。在特别的实施方案中，溶瘤病毒可以独立地选自人艾柯病毒；柯萨奇病毒；脊髓灰质炎病毒sabin毒株；人呼肠孤病毒1、2或3型；麻疹病毒；腮腺炎病毒；新城病病毒；仙台病毒；牛痘病毒；犬瘟热病毒；马拉巴(maraba)病毒；或水疱性口炎病毒(vsv)。

考虑使用的具体病毒包括艾柯病毒1-7、9、11-27、29-33；柯萨奇病毒a1-a22和a24；柯萨奇病毒b1-b6；脊髓灰质炎病毒1-3型sabin毒株；麻疹病毒疫苗株埃德蒙顿、moraten、萨格勒布(zagreb)、aik-c、rubeovax、施瓦茨(schwarz)、cam-70、长春(changchun)-47、列宁格勒(leningrad)-4和上海(shanghai)-191；腮腺炎病毒疫苗株jeryl-lynn、rit4385、列宁格勒(leningrad)-3、列宁格勒-萨格勒布(leningrad-zagreb)、urabeam9和s79；新城病病毒株lasota、b1、v4、vg-ga、ulster2c、fuller、r2b、穆格代斯沃尔(mukteswar)和科马罗夫(komarov)；仙台病毒株cantell、伏见(fushimi)、z和滨松(hamamatsu)；牛痘病毒株lister、dryvax、em63、acam2000、安卡拉(ankara)和lc16m8。

各病毒在溶瘤组合物中的剂量为约1×10⁴(10^4)tcid50/毫升(ml)至约1×10¹¹(10^11)tcid50/毫升。

作为一个实例，可以顺序施用以下溶瘤病毒组：

·呼肠孤病毒1型(使用唾液酸用于细胞进入)；

·柯萨奇病毒b5(需要cd55)；

·艾柯病毒1型(需要整联蛋白α2β1用于细胞进入)；

·柯萨奇病毒a7(需要整联蛋白αvβ3和αvβ6，icam-1和cd55)；

·麻疹病毒、埃德蒙顿(需要cd46)；

·柯萨奇病毒b6(需要cxadr和cd55)；

·sabin脊髓灰质炎病毒1型疫苗株(使用cd155作为受体)。

肠道病毒的自然感染经由胃肠道通过感染淋巴细胞发生。然而，如果个体先前曾暴露于病毒，肠道路线可能会被阻断(即肠道抗性)。取决于恶性疾病和所使用的特定病毒株，设想了可以经由瘤内、经口、经鼻、静脉内、动脉内、皮下、真皮内、肌内、腹膜内、胸膜内、阴道内、尿道内、椎管内和颅内途径施用溶瘤组合物/病毒。这些组合物/病毒也可以通过系统施用在体外预先感染该组合物/病毒的细胞载体来施用。

还将有利的是培养和获得另外的强力溶瘤病毒株，这些病毒株能够溶解更广谱的癌细胞，或者不与响应于之前施用的溶瘤病毒所诱导的抗体交叉中和。本文中描述了两种这样的方法。

首先，可以利用合成的核糖核苷酸或核糖核苷类似物来在病毒中诱导诱变，所述合成的核糖核苷酸或核糖核苷类似物可以通过病毒rna聚合酶整合到病毒rna基因组中，导致复制期间的异常核苷酸碱基配对，从而产生诱变的病毒(突变rna物种)。一种这样的核糖核苷类似物是病毒唑，不过其他合成的核糖核苷酸和选自鸟苷、尿苷、胞苷和腺苷类似物的核糖核苷类似物也可以用于此目的。可以使用的其他类似物包括但不限于开发用于病毒的致死性诱变的抗病毒药物，如5-氮杂胞苷；5-氟尿嘧啶；5-氮杂-5,6-二氢-2-脱氧胞苷；n4-氨基胞苷；n1-甲基-n4-氨基胞苷；3,n4-乙烯胞苷；3-甲基胞苷；5-羟基胞苷；n4-二甲基胞苷；5-(2-羟乙基)-胞苷；5-氯胞苷；5-溴胞苷；n4-甲基-n4-氨基胞苷；5-氨基胞苷；5-亚硝基胞苷；5-(羟烷基)-胞苷；5-(硫烷基)-胞苷和胞苷乙二醇；5-羟基尿苷；3-羟乙基尿苷；3-甲基尿苷；o2-甲基尿苷；o2-乙基尿苷；5-氨基尿苷；o4-甲基尿苷；o4-乙基尿苷；o4-异丁基尿苷；o4-烷基尿苷；5-亚硝基尿苷；5-(羟烷基)-尿苷；5-(硫烷基)-尿苷；1,n6-乙烯腺苷；3-甲基腺苷；n6-甲基腺苷；8-羟基鸟苷；o6-甲基鸟苷；o6-乙基鸟苷；o6-异丙基鸟苷；3,n2-乙烯鸟苷；o6-烷基鸟苷；8-氧代-鸟苷；2,n3-乙烯鸟苷；和8-氨基鸟苷及其他衍生物。这样的类似物不能用作通过细胞rna聚合酶进行rna合成的底物，但是可被许多病毒的更混杂的rna复制酶利用。这些类似物在细胞培养物中的存在显著地提高了rna病毒的突变率，从而促进和加速生物选择的过程。

大体上，在该第一种方法中，在合成的核糖核苷类似物的存在下，将溶瘤病毒在第一细胞培养物中繁殖。以约0.05pfu/细胞至约0.50pfu/细胞的量添加溶瘤病毒。合成的核糖核苷类似物以约0.02mm至约0.5mm的量存在。在约12小时至约36小时的第一时间段之后，收集诱变的病毒。然后利用系列稀释将诱变的病毒在第二细胞培养物中繁殖。收获表现出细胞病理效应的最后稀释的病毒。如果需要，可以进行另外轮次的诱变和系列稀释，其中使系列稀释选择的诱变病毒变为在第一细胞培养物上使用的溶瘤病毒并且在下一轮诱变中暴露于该合成的核糖核苷类似物。构想了将第一细胞培养物用于诱变，并且将第二细胞培养物用于病毒选择。理想地，第二细胞培养物含有作为最后经生物选择/优化的溶瘤病毒的期望靶标的细胞。作为结果，所获得的溶瘤病毒可以在第二细胞培养物中复制。这是例如对病毒改进的一种方式，使得其可以更容易地感染其之前难以感染的细胞类型。

第二种方法类似于第一种方法，但还在抗体存在下，在第一细胞培养物上培养溶瘤病毒。在第二种方法中，第一和第二细胞培养物可以是相同的细胞类型，同时连续几轮的诱变/抗体暴露和连续稀释意图选择对抗体具有更高抗性的病毒。

本公开内容还公开了用于通过化学合成整个病毒基因组来产生新的合成病毒的新方法，该病毒基因组具有改变的同义密码子使用，旨在特异性地在癌细胞中增强病毒增殖和病毒蛋白的正确折叠，并且减弱其在正常细胞中的增殖(和病毒蛋白的折叠)。

在这方面，病毒基因组(包含在病毒的dna或rna中)包含对于病毒表达和复制所必需的所有信息。病毒基因组具有有限数量的编码对于病毒复制和病毒子组装来说必需的蛋白的基因。许多病毒基因组还含有编码抑制细胞防御机制的蛋白的基因。许多病毒基因组中的个体基因的顺序和位置(开始和结束)是公知的。

当宿主细胞被病毒感染时，细胞的蛋白合成机构合成由病毒基因组编码的病毒蛋白。病毒mrna的解码或翻译通过核糖体进行，其中氨基酰基-trna添加氨基酸以在蛋白合成期间生长蛋白质链。当病毒蛋白成熟、变为功能性的并且达到足够的浓度时，病毒子组装而形成新的病毒。该新的病毒从宿主细胞运出并且可用于感染新的细胞。

遗传密码描述了mrna中给定的核苷酸三联体的序列(即密码子)和通过该密码子确定的氨基酸之间的对应关系。遗传码是简并的，其中最多六种同义密码子编码一个给定氨基酸。然而，每种密码子对于给定氨基酸的使用并不是均匀的，并且密码子的频率称为密码子偏性(bias)。

同义密码子(编码相同的氨基酸)最初被假定具有完全相同的功能。然而，同义密码子在基因/基因组中不是以相等的频率存在的发现表明，密码子选择可能具有超出氨基酸编码的功能含义。非均匀密码子使用的模式在生物体之间以及在表达不同组的基因的不同细胞/组织之间不同。生物体/基因和组织特异性密码子选择与trna群体中的生物体和组织/细胞特异性差异有关。已知trna的丰度与密码子使用的频率成正比，并且因此在给定的生物体和/或细胞/组织中，频繁使用的密码子通常比不经常使用的密码子更快速地被翻译，反之亦然。解码的速率取决于翻译期间在核糖体周围的trna的浓度。同义密码子的出现及其相应trna的丰度是mrna翻译中的差异效率的主要原因之一。

还已经发现，同义密码子使用影响mrna稳定性和最重要的蛋白质折叠。同义密码子可以通过调节翻译动力学来调控蛋白质折叠。在体内，随着新生的肽链从核糖体出口通道出现，共翻译地开始蛋白质折叠。由于对于给定密码子的trna丰度方面的差异，局部翻译率的变化可以通过允许有序、顺序构造从核糖体中产生的新生多肽链来促进蛋白质折叠。稀有密码子和频繁密码子沿mrna的放置/分布可以积极引导细胞内的蛋白质折叠。因此，同义密码子的使用在细胞中不仅调节翻译延伸，而且调节共翻译折叠和蛋白质质量。因此，可以通过改变病毒dna/rna序列以控制哪些同义密码子用于特定的氨基酸来调节蛋白质表达水平和蛋白质结构特性二者。换句话说，核糖体在mrna上的运动并不均匀，并且据信这样的“翻译不均匀”影响蛋白质折叠。

最近已经发现了对于多细胞生物体特异的两个特征：(i)在密码子使用和trna丰度方面存在细胞间和组织特异性变化；和(ii)在与细胞增殖和分化相协调的trna供需方面存在用来调节翻译的双重程序。发现在增殖性癌细胞中所诱导的trna通常在分化/停滞中的细胞中被抑制。相反，经常发现在分化细胞中所诱导的trna在增殖性细胞中被抑制，由此提供了trna供给相对于其需求的必要微调，使之与分化相关基因的特征化密码子使用偏好相适应。因此，许多病毒在癌细胞中的蛋白质表达将被改变或减少，因为trna丰度方面的差异将改变翻译动力学，这也可能影响病毒蛋白的折叠。

合成的靶向病毒或系统性靶向补救措施(systemictargetedremedy，str)考虑了上述两种观察结果。基于这些观察结果，通过恰当选择同义密码子，在给定细胞类型中通过给定的病毒，可以改变病毒蛋白表达水平和病毒蛋白质折叠，目的是产生可以在癌细胞中更好表达但在非恶性/正常细胞中无法很好表达的合成病毒。调整病毒orfeome的同义密码子以使所得的翻译动力学在癌细胞中精细调控并且更佳地匹配以确保病毒蛋白在癌细胞中的增强表达和正确折叠，考虑到正常细胞与癌细胞中的trna库方面的差异。这考虑到癌细胞型内的trna的丰度，通过沿着用于各个个体病毒基因的病毒基因组适当选择稀有和频繁的同义密码子二者来完成。因此，病毒可以在癌细胞内更有效地繁殖并且杀伤癌细胞。还可以预期，由于这种针对给定癌细胞类型内的环境所进行的优化，病毒蛋白的表达及其折叠也将在正常细胞中减弱，因为trna的相对分布不同并且因此翻译的动力学将不同。在正常细胞中，除了减少的病毒蛋白表达之外，相反可以发生病毒蛋白错误折叠和/或增强的降解。

这些合成的靶向病毒或str可以通过反向遗传方法产生，所述方法以导致病毒蛋白在正常细胞中的减弱表达及其在癌细胞中的增强表达的方式调节“参考”病毒中的密码子。因此，同义密码子的使用确保病毒蛋白在癌细胞中的正确折叠，这对于获得成熟且完全功能性蛋白质状态来说很重要。该方法还允许某些/特定病毒基因的靶向优化，其旨在进一步调控和减弱病毒繁殖和/或调控病毒蛋白折叠，因此通过仅特定基因或一组基因的靶向调控来改变病毒活性。如以上解释的，如有必要，仅所选的病毒蛋白(例如负责细胞裂解)的靶向去优化/减弱可以具体地进行，目的是例如延长病毒复制，特别是在癌细胞中。此外，密码子优化方法可以考虑在trna使用/同义密码子频率方面的癌组织特异性差异，使得合成的靶向病毒可以特异地靶向特定形式的恶性疾病。

简言之，以下表a鉴定了天然1型sabin毒株fda脊髓灰质炎病毒的orfeome的密码子使用频率，并且显示(i)由各个密码子编码的氨基酸，(ii)给定氨基酸的同义密码子和(iii)每一千个密码子的相对密码子频率。密码子使用利用计数密码子程序http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html制成表。据信这种密码子使用对于在正常分化的非恶性细胞/组织中的病毒复制是最佳的。注意的是，sabin毒株在中枢神经系统中显著减弱，但被认为(并且显示)在其他细胞/组织例如内脏中以野生型水平进行复制。这些毒株在培养的成神经细胞瘤细胞中也无法良好生长。

表a：脊髓灰质炎病毒1型sabin毒株fda密码子使用

接下来，下表b显示了从这些细胞的trna池推断的快速增殖的癌细胞(结肠/膀胱癌细胞)中的密码子使用。在本领域可以使用高通量方法来生产这样的trna分布谱图。这仅提供用于举例说明本公开内容的目的。

表b：快速增殖的癌细胞密码子使用频率

接下来，在表a的参考病毒orfeome(“自然”优化用于在“正常/给定”人细胞中的表达)和表b中所显示的癌细胞的orfeome之间的相对密码子使用/trna分布频率，可以用于优化/去优化由一种细胞类型到另一种细胞类型的给定核苷酸序列。优化可以通过引入同义密码子来完成，这些密码子在天然和靶标细胞中具有最相似的使用频率。稀有和频繁的密码子二者都被改变，以获得在靶细胞中的mrna翻译动力学，其模拟在天然细胞中观察到的动力学。去优化通过引入在天然细胞和靶细胞中具有最不相似的使用频率的同义密码子来完成，以使它们的翻译动力学尽可能地不同。

严格地，作为一个实例，表c提供了“天然”原始密码子使用频率、靶标/癌细胞密码子使用频率以及所得的用于1型sabin毒株fda脊髓灰质炎病毒的10个密码子的序列的优化频率。

表c

现在参考表c，该10个密码子的序列编码期望在癌细胞中表达的脊髓灰质炎病毒多聚蛋白的开头。在名称为“原始密码子使用频率”一栏中，列出了被认为是“自然优化”用于在分化人细胞/组织中表达的天然病毒中的“原始”密码子的频率。在名称为“对于原始密码子的靶细胞密码子使用频率”一栏中，列出了在靶标/快速增殖性癌细胞中的“原始”密码子的频率。如通过比较这两栏可以看出的，一些密码子在其频率方面变化很大。例如，密码子#8和#10的频率显著不同(分别为64.00vs.19.46，和40.00vs.26.24)。参考图3，这些密码子频率方面的差异也是明显的。

第五栏的名称为“所得/优化的频率”，并且示出了该10个密码子的序列中的被优化以表达相同病毒蛋白但仅在靶标/癌细胞中的密码子的频率。对于优化序列中各个位置的“优化的”密码子如下确定。首先，对于各个密码子对，确定它们频率之间的差别(靶标密码子减去原始密码子)并且选择靶标密码子使用表中具有与天然序列最接近的频率的同义密码子。其次，如果靶细胞中的多个同义密码子的频率相同，使得不能基于频率(单独地)进行选择，则应该选择具有使第三个碱基处的摆动最小的三联体组成的同义密码子。第三，如果靶标同义密码子已经具有与天然宿主频率最接近的频率，则其保持不变(注意，有时此频率可能仍然与天然/原始宿主十分不同)。

例如，依照上述规则，编码天然序列中位置10处的val的gtg密码子已被优化密码子序列中的gtt替代。val由四个同义密码子编码，并且gtt密码子使用频率(27.00)是与在病毒orfeome中观察到的原始密码子使用频率(26.24)最接近的匹配(靶标癌细胞中)。

在密码子#9aaa(编码lys)的情况中，两个lys同义密码子的频率看起来在靶标癌细胞中是相同的(50.00)。因此，在这种情况下，进行aag密码子的选择以使该密码子三联体的第三个碱基处的摆动最小化(如上所述)。因此，aaa被aag替代。解码过程的特异性在于使得通常在密码子的前两个核苷酸和反密码子中的那些之间观察到完美的watson–crick碱基对，但在第三个(所谓的“摆动”)位置处可以是变化的碱基配对。摆动出现是因为trna反密码子环的构象允许在该反密码子的第一碱基处具有灵活性。在第三密码子碱基处的完美watson–crick碱基配对确保解码过程的高严格度并且使错编码错误最小化。还要注意的是，尽管癌细胞中的aaa和aag密码子的频率与天然病毒orfeome的频率不匹配，但没有可能的其他选择，因为lys仅由这两个同义密码子编码。

作为这种优化的结果，如在表c中可见的，编码这种病毒多聚蛋白的“天然/参考”序列的10个密码子中的九个，在优化以编码要在癌细胞中表达的病毒蛋白的序列中发生变化(注意，这种比较严格地作为示例提呈)。参见图3，用于“优化的”线(三角形)的形状理想地尽可能接近于“原始”(棱形)的形状。图4是显示在更大规模上进行的这种相同优化的结果的更大量的谱图。这里，示出了天然和优化序列的密码子150-210。同样，理想地用于“优化的”(三角形)的线尽可能接近于“原始”(棱形)的线。

以相同的方式，合成的靶向病毒的整个orfeome可以来源于“参考”病毒。要注意的是，仅病毒的蛋白编码(开放阅读框)区需要被优化。其他区域，例如5’和‘3非翻译(utr)区，如5’-内部核糖体进入位点(ires)元件，通常不需要根据这种方法进行优化。然而，要注意的是，orfeome内部的某些蛋白编码区可能也不需要进行优化。这些区域可以包括对于病毒复制和功能重要的关键rna结构和/或序列元件。这些区域应该保持完整，除非可以引入恢复这些区域的结构或关键组成的补偿性同义突变。

在特别的实施方案中，逆向工程改造的str与其天然类似物具有小于85％的同一性(在核苷酸水平)。在特别的实施方案中，str可以与其天然类似物具有小于80％的核苷酸同一性或小于75％的核苷酸同一性。然而，通常，str或合成的靶向病毒与参考病毒具有至少67％的核苷酸同一性。

在这样的与天然类似物具有低水平同一性的情况下，合成的str可被认为是新的病毒属并且推测是安全的且不能与天然病毒重组。

本公开内容在以下非限制性工作实施例中进一步举例说明，应当理解，这些实施例意图仅是举例说明性的并且该公开内容不意图局限于本文所述及的材料、条件、过程参数等。

实施例

以下描述了一组十二(12)个具有溶瘤性能、系统性自主靶向性溶瘤补救措施(systemicautonomoustargetedoncolyticremedies，sator)或系统性靶向补救措施(str)的非致病性人病毒，其分离以及用途。还给出了将合成的溶瘤病毒作为治疗癌症的药物的组合物及用途，其中所述合成的溶瘤病毒利用经改造的核苷酸组合物/同义密码子使用而从头产生。

病毒株的分离

一组非致病性溶瘤病毒通过从健康的二至三岁儿童的粪便分离形成。病毒株如下分离：i)收集粪便的样品，并在4℃储存多达48小时；ii)将粪便在hbss(汉克斯平衡盐溶液(hanksbalancedsaltsolution))中匀化以制备30％悬液；和iii)将该悬液通过以5000g离心30分钟澄清并通过0.22μ过滤器且储存在-70℃。

制备三种细胞培养物的单层用于病毒分离。它们是：非洲绿猴肾细胞系cv1(atccccl-70)；人癌细胞系hep-2(atccccl-23)；和人横纹肌肉瘤细胞系rd(atccccl-136)。

将具有新鲜的细胞系单层的100ml烧瓶与1ml接种物在37℃孵育1小时，然后用hbss洗涤三次并在具有1％fbs的dmem中孵育3天。然后将烧瓶在-70℃放置，接着解冻，并且将含有病毒的培养基用于新鲜细胞培养物的接种，同上。重复盲传代直至至少在一种类型的细胞培养物中观察到细胞病理效应。收集病毒并储存在-70℃。对于病毒的常规繁殖，选择cv1(猴肾)细胞系，因为其支持所有分离病毒株的复制。病毒效价也在cv1细胞中确定。它们在6-9logtcd50/ml的范围内。

病毒株的血清分型通过用类型特异性血清的中和进行。获得以下毒株：str4e1(对应于艾柯病毒1)；str6e7(对应于艾柯病毒7)；str7e12(对应于艾柯病毒12)；str8ca7(对应于柯萨奇病毒a7)；str9ca9(对应于柯萨奇病毒a9)；str10cb1(对应于柯萨奇病毒b1)；str11cb2(对应于柯萨奇病毒b2)；str12cb3(对应于柯萨奇病毒b3)；str13cb4(对应于柯萨奇病毒b4)；str14cb5(对应于柯萨奇病毒b5)；和str15cb6(对应于柯萨奇病毒b6)；str17e21(对应于艾柯病毒21)。

分离的病毒株属于微小核糖核酸病毒科(picornaviridae)，病毒属。它们是小的正义、单链rna病毒20-25nm粒子，其由与7200-7300个核苷酸的基因组rna共价连接的四个衣壳蛋白和一个小vpg蛋白组成。

在分离之后，病毒在细胞培养物中经过多次传代，导致病毒具有适应性、较高产率，并且所产生病毒原液的效价增大。

毒株的安全性按照经口或鼻内施加10⁸pfu的病毒在健康志愿者上进行测试。这些试验已显示没有严重的不良反应并且只出现很少的轻微流感样症状，包括中度发热，持续小于24小时(37.0℃-37.5℃)、寒颤、恶心和更少的轻度腹泻病例。病毒的安全性还通过概述临床试验结果的发布报告进行确认，因为它们用于大量针对季节性病毒感染的非特异性防护。

分离的病毒株在肿瘤来源细胞中的繁殖

在从单个菌斑纯化之后，使用一组细胞系测试病毒株在不同肿瘤来源人细胞系中的复制能力。

在具有细胞系的新鲜亚汇合单层的12孔板中进行试验。用100μl体积的0.1tcid50/细胞感染细胞1小时，然后用hbss洗涤并在1ml补充了1％fbs的dmem中孵育。48小时后，将展现不同程度的细胞病理效应的单层进行冷冻-解冻并且通过最终稀释和cv1细胞的感染确定效价。

以下表1和2显示来自以下组的病毒繁殖潜力，以在不同细胞系上获得的病毒效价显示：正常人胚肺成纤维细胞(nhelf)；乳腺癌(bc)；宫颈癌(cc)；表皮样癌(ec)；前列腺癌(pc)；黑素瘤(mel)；非小细胞肺癌(nsclc)；胰腺癌(panc)；和横纹肌肉瘤(rms)。

表1.

表2.

上表1和2中呈现的结果显示，来自该组的各个病毒株在不同肿瘤来源细胞系中表现出重叠但不相同的繁殖特性。特别地，mcf7乳腺癌细胞不支持柯萨奇病毒b4和b6/str15св6的繁殖，但是有效地繁殖艾柯病毒1和7。柯萨奇病毒a9和b3在aspc-1胰腺癌细胞中复制较差，但该细胞对艾柯病毒12和柯萨奇病毒b4是高度敏感的。

实施例1

病毒株在裸小鼠异种移植模型中的溶瘤活性

方法和材料

在无胸腺裸小鼠注射人癌细胞后形成的异种移植肿瘤中，进一步测试这些病毒株的溶瘤活性。向小鼠皮下注射2-10×10⁶个细胞。当肿瘤体积达到约0.1-0.15ml时，向肿瘤每日注射0.05ml的病毒(10⁸tcid50)持续四天，并且每5天测量肿瘤体积，直至第50天。向对照小鼠注射从未感染细胞收集的培养基。图1a-1c是其中曲线显示当未治疗(c33a、aspc1和mcf7)时肿瘤随时间生长(并且在下文进一步讨论)的图。图6在左侧包括显示肿瘤生长的两幅照片。

结果

观察到病毒在细胞系中体外繁殖的能力与体内溶瘤活性之间具有好的相关性。复制较差的病毒(柯萨奇病毒b3在c33a细胞中，柯萨奇病毒a7/str8ca7在aspc1细胞中，柯萨奇病毒b6/str15св6在mcf7细胞中)在来源于相同细胞的异种移植肿瘤中不显示溶瘤活性，而表现出强复制的病毒(柯萨奇病毒a7/str8са7在c33a中，柯萨奇病毒b4在aspc1中以及艾柯病毒1在mcf7细胞中)能够破坏异种移植肿瘤。

图6是一组四幅图，其显示在包括免疫缺陷(裸)小鼠异种移植模型的临床前实验中的体内抗肿瘤细胞生长的病毒效力。在上排中，皮下注射宫颈癌(c33a)细胞，并且静脉内注射艾柯病毒1。左侧照片是病毒注射前，右侧照片是病毒注射后16天。在下排中，皮下注射结肠癌(rko)细胞，然后静脉内注射脊髓灰质炎病毒株1。左侧照片是病毒注射前，右侧照片是病毒注射后18天。如在右侧照片中看到的，病毒注射导致肿瘤显著缩小。

实施例2

测试患者恶性细胞对不同溶瘤病毒株的个体敏感性

该实施例证实人病毒的各个株的溶瘤活性根据癌细胞的性质而变化。因此，为了获得阳性响应，需要选择溶瘤有效的病毒株。这可以直接通过测试由活检或手术获得的活恶性细胞的短期培养物的敏感性曲线来进行。

材料和方法

将肿瘤组织的样品收集到补充有青霉素和链霉素的预冷无菌培养基dmem中。肿瘤片段的厚度小于5mm，以利于从培养基中获取营养物质。样品可以在+4℃储存多至48小时。然后利用无菌刀刃将其破碎成1-2mm的较小片段并且使用平的玻璃研杵推动穿过50-100微米尺寸的尼龙网。然后将悬液通过以800g离心5分钟在培养基中洗涤两次。将悬液用台盼蓝染色并且对细胞计数。将0.2ml等份的1-5×10⁴个细胞放入无菌的1.5ml塑料管中并且与1-5×10⁴tcid50的不同病毒株一起在37℃孵育30分钟。然后在微型离心机中以800g离心3分钟将悬液用1ml补充了2％胎牛血清(fbs)的dmem洗涤三次。将0.2ml的每个样品放入96孔板的两个平行孔中并且在5％co2和还原氧的气氛中在37℃孵育48小时。然后将样品在-70℃冷冻，解冻，通过在4℃以5000g离心10分钟清除碎片，并且通过敏感cv1细胞的系列稀释和感染来确定病毒效价。对特定人病毒表现出敏感性的肿瘤样品产生多至10⁶-10⁷tcid50/ml。

用于测试对病毒的个体敏感性的技术适用于许多不同的病毒株，包括但不限于人艾柯病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒的sabin株血清型1、2和3、人呼肠孤病毒1型、人呼肠孤病毒型、人呼肠孤病毒3型、麻疹病毒的埃德蒙顿株、腮腺炎病毒、新城病病毒株、仙台病毒、牛痘病毒株等。

实施例3

用于同时施用用的溶瘤病毒组合

如图2中所示的，同时使用病毒混合物的效力在带有来源于c33a人宫颈癌细胞系的肿瘤的裸小鼠的异种移植实验中得到证实。向小鼠皮下注射a431表皮样癌细胞。在肿瘤变得明显后，向肿瘤部位每隔一天注射0.1ml的病毒(10⁸tcid50)，持续四天。cox-b5对应于str14св5，cox-b6对应于str15св6并且echo12对应于str7e12。

向小鼠注射在细胞中表现出不同繁殖能力的单种病毒(a431)和两种或三种溶瘤病毒的混合物，每隔一天一次，持续四天。然后监测肿瘤体积，直至第50天。

实施例4

对可以在mcf7细胞中复制的柯萨奇病毒b6进行生物选择

材料和方法

发现mcf7乳腺癌细胞对柯萨奇病毒b6有抗性，其在注射0.1pfu/细胞的该病毒后48小时产生小于10²pfu/ml(参见上表1和2)。在cv1细胞中进行柯萨奇病毒b6病毒的繁殖。对于诱变，确定在cv1细胞中将感染性病毒的收率降低2至3个数量级的病毒唑的浓度。其对应于0.1-0.5mm。在病毒唑存在下，用0.1pfu/细胞的柯萨奇病毒b6感染新鲜的cv1细胞单层。在24小时之后收集病毒，并且用诱变病毒的系列稀释液感染mcf7细胞。在60分钟吸附之后，将细胞用hbss洗涤，然后在补充了2％fbs的dmem中孵育48小时。从样品收集的病毒代表表现出细胞病理效应的最后稀释。然后使其在cv1细胞中繁殖，并且将获得的原液用于第二轮诱变和利用系列稀释液对mcf7细胞的感染。

结果

从mcf7获得并用病毒的最高稀释液进行感染的病毒原液当在cv1细胞中测定时表现出10⁷-10⁸pfu/ml的效价。在噬斑测定中的菌斑在外观和尺寸上是多形态的。取较大的菌斑并且用于病毒原液的制备，该病毒原液当在mcf7细胞中繁殖时显示2-5×10⁸pfu/ml的效价。对原始病毒和所选毒株测序。在经生物选择毒株中的vp1基因内存在四个氨基酸替换：asn-655-->lys；thr-698-->ile；pro-715-->his和lys-825-->glu。

实施例5

对不与抗血清交叉中和的艾柯病毒1进行生物选择

材料和方法

通过用浓缩纯化的艾柯病毒1原液对绵羊进行免疫而获得用于中和的抗血清。将该抗血清用于制备纯化的免疫球蛋白。在0.1mm病毒唑的存在下，在cv1细胞中获得艾柯病毒1的诱变原液。将抗体的稀释液在37℃与诱变的艾柯病毒1原液一起孵育60分钟，并将系列稀释液用于cv1细胞的感染。将来自用抗体的最后稀释液进行感染且展现出细胞病理效应的细胞的样品用于利用病毒唑的第二轮诱变和利用抗体的中和以及滴定。之后进行连续八轮的诱变和选择。

结果

在接下来的连续八轮的诱变和选择期间，病毒对抗血清的中和作用的抗性逐渐提高。当抗体针对艾柯病毒1的作用与异源抗体对于脊髓灰质炎病毒1型产生的作用类似时，认为选择是成功的。

实施例6

合成str的产生

材料和方法

对脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗株(1型sabin毒株；fda批准用于口服脊髓灰质炎疫苗)的基因组进行密码子优化以减弱病毒在正常细胞中的表达并且增强其在快速分裂/癌细胞中的增殖。化学合成经修饰的基因组，将其组装并进一步用于生产活病毒。seqidno:1是用作参考野生型1型sabin毒株的核苷酸序列。seqidno:2是用于密码子优化的合成病毒的核苷酸序列。在两个核苷酸序列之间有80.1％的同一性(5316/6630，使用clustalov1.2.2)。

结果

制备一组具有经修饰基因组的合成的经修饰脊髓灰质炎病毒(strp)。脊髓灰质炎病毒具有单链正义rna基因组，其可以用作mrna(编码多聚蛋白)、用作用于基因组rna复制的模板或用作被包装到病毒粒子中的新生基因组。病毒基因组的表达和病毒的复制严重依赖于位于基因组的5-非翻译区(untraslatedregion，utr)中的所谓内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite，ires)元件的功能。ires将小的核糖体亚基募集至起始密码子附近并且开始病毒多聚蛋白的合成。在分裂后，该多聚蛋白的n末端部分产生结构(衣壳)蛋白，而c末端部分产生大量的非结构蛋白，包括rna依赖性rna聚合酶和大量的病毒特异性蛋白酶。因此，病毒衣壳蛋白的表达连同病毒粒子在培养基中的效价，以及在琼脂菌斑测定中测量菌斑的大小，可以用于比较在不同细胞类型中的病毒复制适合度。

比较天然脊髓灰质炎病毒株1和合成的密码子优化的脊髓灰质炎病毒株1在静止期(rd细胞)和指数分裂的293t细胞中繁殖的能力。rd细胞充当对照。如在图5中看到的，合成/密码子优化的病毒在分裂细胞中显示出优先(约3倍以上)复制。

溶瘤病毒组在单个患者中的临床实施例

实施例7

患者a.s.(33岁女性)被诊断患有t3n1m1低级别卵巢腺癌、腹膜和胸膜癌扩散、恶性腹水和胸膜炎、多发性盆腔、腹部和纵隔转移及多淋巴结病。

该患者用strs1(仙台病毒溶瘤毒株)治疗一年(12次每周一次，然后7次每月一次，皮内注射strs1，10⁸i.u./ml)。在3个月时间内ca-125标志物从2100单位下降至30-50单位，并且没有疾病进展的迹象达11个月，但是随后ca-125水平开始升高并且腹水重新积累。提取腹水用于测试癌细胞对一组可用溶瘤病毒的敏感性。离体测试如下进行：

将200ml的补充了肝素以避免纤维蛋白凝结的腹水以2000g离心10分钟，收集含有癌细胞的球状团聚体的沉淀并对细胞计数。在1ml的液体中有约7×10⁵个细胞。将细胞用hbss洗涤，分成多个1ml的dmem中2×10⁶个细胞的部分并置于1.5ml微量管中。将以下病毒用于测试：脊髓灰质炎病毒1型sabin毒株、艾柯病毒str4e1和str7e12、柯萨奇病毒str8ca7和str14cb5、呼肠孤病毒1型(strr1)、麻疹病毒、埃德蒙顿来源的毒株strm1esc。以0.1tcid50/细胞多重性感染细胞，在37℃孵育60分钟，用hbss洗涤三次，在800g离心3分钟，并且在5％co2中置于37℃的1ml的dmem、2％fbs中。48小时后，在所有样品中观察到细胞完全降解(除了模拟感染的细胞以外)。使用cv1细胞来确定大多数毒株的病毒效价。

在血凝反应中，通过在10μg/ml胰蛋白酶存在下感染mdck细胞来确定仙台病毒株strs1的效价。认为来自腹水的细胞对试验中使用的所有病毒都是高度敏感的，其产生的病毒效价在5×10⁷-5×10⁸tcid50/ml的范围内。细胞还保持对str-s1敏感，产生5×10⁵tcid50/ml，这被认为是高敏感度。然而，从患者提取的腹水含有高效价的能够中和str-s1的抗体(大于1:100,000)，这被认为是复发的原因。

然后向患者静脉内注射1×10⁸pfu的艾柯病毒1株str4e1。在注射后九天，对腹水的分析显示几乎没有癌细胞。在接下来的5周期间ca-125逐渐下降，从3500下降至350单位。然而，在注射后第6周开始，腹水重新积累，并且癌细胞重现为球状团聚体。离体试验已经确定这些细胞保留了对str7e12、str10cb3、strr1和strmesc1的完全敏感性，但对str4e1具有抗性。在用0.1和1tcid50/细胞的艾柯病毒1感染后，既没有可见的细胞病理效应也没有病毒产生。断定复发是由对str4e1抗性癌细胞的选择所引起的。

然后向患者腹膜内注射10ml的三种病毒混合物——str10cb5、str-r1和strmesc1(柯萨奇病毒b5、呼肠孤病毒1型和埃德蒙顿来源麻疹病毒株)各1×10⁸pfu。在接种后四天，对腹水的细胞学试验已显示没有活的癌细胞。在接种后两个月没有检测到癌细胞再出现。

实施例8

患者m.c.(74岁男性)被诊断患有脐尿管腺瘤，切除后2年，肿瘤在乙状结肠附近扩散，结肠梗阻(55mm×35mm；引入s形支架以克服梗阻)并且至回盲区(60mm×30mm)，腹膜癌扩散以及腹水。截至治疗时，患者处于危重病情，其中腹水快速积累，并且液体在阴囊中积累。

将50ml的腹水进行离心并检查。其含有2×10⁶个癌细胞/ml。将细胞洗涤并在添加10％fbs的dmem中以2×10⁵个细胞/ml的密度接种。三天后，细胞形成单层并且通过每周以1:3分裂进行进一步培养。

在细胞中测试一组病毒的繁殖。将细胞(第1代)接种到24孔板中，第二天用1-5pfu/细胞的病毒进行感染，并在3天后收集子代病毒。通过在易感细胞中的系列稀释滴定对病毒进行定量。这些细胞对strs1、strr1、strmesc1、str4e1、str7e12、str14cb5、str15cb6是高度易感的，而对str8ca7具有抗性。

考虑到患者的危重病情，通过腹膜内注射10ml的2×10⁸i.e./ml的仙台病毒株strs1，将溶瘤病毒制剂直接引入到腹水中。

体温升高(注射后18小时)至38.7-39.4℃。其他症状包括疲劳、恶心、腹部区域轻微隐痛。通过扑热息痛(paracetamol)有效地阻断温度升高并且维持在37.2℃直至在接下来的24小时期间变为正常和低常温(subnormal)。在接下来的三天期间还存在排尿增多和腹水减少。阴囊液在前48小时期间消失，并且在注射后第4天腹水变得不可检测。患者的总体病情和活动力快速改善，胃口很好，情绪变得更好。

注射后35天，pet-ct显示肿瘤在回盲区中完全消退并且肿瘤在乙状结肠区中显著缩小，伴随着正对s形支架的区域中具有残留的局部增加的代谢活动。

注射后60天，患者开始抱怨胃和十二指肠之间的部分梗阻导致饭后呕吐。由于上一次腹水积累所引发的黏连过程，在上腹部区中检测到液体积累。腹腔穿刺没有在液体中发现任何癌细胞。通过利尿剂和更积极的方案(例如每天走动)来治疗该病症。

在接下来四个月期间，腹膜黏连过程继续进行，导致伴有排便、消瘦和虚弱问题。为了防止可能的恶性过程复发，向患者静脉内注射2×10⁸pfustrmesc1(埃德蒙顿来源麻疹病毒株)。在注射后24小时发生温度升高(37.2-37.4℃)，持续接下来的18-20小时，然后持续三天低常温(35.5℃)并且伴有疲劳。没有观察到其他临床表现。也不存在患者病情的实质性改善。主要遗留问题是腹膜中的黏连过程。在第一种溶瘤病毒注射后八个月，患者经历了腹部问题之外的心脏病发作。患者的病情继续恶化，并且患者在开始溶瘤治疗后11个月死亡。然而，死后尸检在乙状结肠和回盲肿瘤区域中未发现活的癌细胞，并且在先前肿瘤区域中存在纤维化迹象。

实施例9

患者m.a.(82岁女性)被诊断患有乙状腺瘤，切除后两年，转移至肝脏，25×15mm和20×10mm，恶病质(cachexia)，并且cea–55ng/ml。

没有对患者施用化疗。截止第一次注射时，患者虚弱，卧床。有黄疸的迹象。

向患者皮内注射与获自第4天鸡胚的细胞(10⁷个细胞)混合的1ml的浓缩仙台病毒株strs1(10⁹i.e./ml)。在患者的脊椎区进行二十次皮内注射(每次0.05ml)以增大对病毒的暴露。鸡胚细胞支持strs1病毒的复制，由此延长注射的效果。以14天间隔重复注射，持续三个月。

没有响应于注射的温度升高或任何其他副作用。患者的病情在第一次注射后5至7天开始改善。有肝功能的改善(alt/ast)、黄疸消失、能量提高、体重增加(增加7kg至总计55kg)，患者不卧床，恢复积极生活，并且在乡村住宅里度过夏天三个月，进行菜园常规活动。在第一次注射后四个月，ct扫描显示肝转移显著缩小至几乎检测不到。

在第一次注射后九个月，患者的病情恶化，伴有疲劳、恶心以及降低的红细胞数。没有进行肿瘤部位的特定检查。向患者静脉内注射含有str4e1、str8ca7和str14cb5(艾柯病毒1、柯萨奇病毒a7、柯萨奇病毒b5株)各108pfu的溶瘤病毒混合物。在注射后18小时发生温度反应(37.9℃)，持续18至20小时。在注射后48小时患者的病情开始改善。血液参数(红细胞数和血红蛋白)在注射后两周达到正常水平。注射后六个月，患者稳定，无特别的小问题。cea＝7ng/ml。

实施例10

患者n.s.(36岁女性)被诊断患有低级别鳞状宫颈癌、转移至douglas空间以及腹水。原发性肿瘤在两年前手术移除。在溶瘤病毒治疗之前四个月检测到转移。

向患者脊椎区的20个地方皮内注射1ml的浓缩仙台病毒株strs1(10⁹i.e./ml)。每隔一周重复注射，持续五个月。在第一次注射后观察到温度反应(38.5℃)，持续一天。在随后的注射期间没有观察到温度升高。患者的病情逐步改善。第一个月期间腹水消失。三个月后，ct扫描显示douglas空间中的肿瘤块显著缩小。患者的病情保持稳定达一年。

实施例11

患者m.l.(73岁男性)被诊断患有前列腺腺泡腺癌，转移至骨(椎骨，肋骨，骨盆)。没有移除原发性肿瘤(21mm×21mm×13mm)。psa＝230ng/ml。

在6个月时间内，在20个位置处每两周皮内注射施用混合了10⁷个第4天鸡胚细胞的浓缩仙台病毒株strs1(10⁹i.e./ml)。四个月之后，每周两次地施用注射，持续四个月。没有温度反应。患者骨中的疼痛在头2个月期间逐渐消失。6个月之后，petct扫描显示没有疾病的进展，转移的代谢信号有一定程度的减少。病情在第一次溶瘤病毒注射后1.5年保持稳定。psa＝41ng/ml。

实施例12

患者a.s.(55岁男性)被诊断患有前列腺腺癌，其在两年前手术移除，并且转移至骨(骨盆，肋骨，颅骨)。psa＝1400ng/ml。

向患者肌内注射1ml的浓缩纯化制剂(10⁹pfu/ml)艾柯病毒1株str4e1。

在第3-4天有温度反应(39.5℃)，肿瘤部位疼痛。疼痛在第3天退去。以三周间隔重复注射。在重复注射之后没有温度反应。

在第51天，ct扫描显示肿瘤尺寸减小，以及骨阻塞修复的证据。psa下降至210ng/ml。

在第65天，以三周间隔对患者四次肌内注射施用浓缩的纯化柯萨奇病毒b5株str14cb5、109pfu/ml。在第一次注射后有温度反应，但随后的注射是无症状的。

在治疗开始后的六个月中，无疾病的进展，并且患者的病情稳定。psa＝105ng/ml。

实施例13

患者f.a.(65岁男性)被诊断患有前列腺腺癌，其被手术移除。将肿瘤样品用于细胞系的传代。前列腺癌细胞不含缔合的成纤维细胞。将细胞系用于测试对一组溶瘤病毒的敏感性。该细胞系对strs1、strr1、str4e1、str8ca7、str14cb5是高度敏感的，但对str7e12、str15cb6和strmesc1是相对有抗性的。

在手术操作后八个月，患者开始抱怨骨盆区疼痛。ct扫描显示在骨盆和肋骨中的骨转移。psa＝1500ng/ml。

向患者肌内注射浓缩且纯化的病毒混合物，各10⁹pfu/ml的str4e1、str8ca7和str14cb15(艾柯病毒1、柯萨奇病毒a7、柯萨奇病毒b5株)。在18小时后(38.3℃)、第二天(37.5℃)和第3天(37.2℃)有温度反应。接着，出现低常温反应，持续三天。患者经历骨盆和肋骨疼痛，持续一周，然后疼痛消退。以三周间隔重复注射五次。

psa动力学为如下：1500ng/ml(开始)，1700ng/ml(开始后10天)，670ng/ml(开始后35天)，205ng/ml(开始后3个月)，以及86ng/ml(开始后5.5个月)。

目前患者的病情(治疗开始后6个月)稳定。患者没有小问题，并且ct扫描提供肿瘤部位中骨修复的证据。

实施例14

患者a.a.(72岁男性)被诊断患有前列腺腺癌，手术移除后四年，转移至肺和肝。激素治疗初始有效，但随后复发，伴有转移的进行性生长。psa＝2500ng/ml。

在5个月时间内，在20个位置处，向患者每两周皮内注射混合了10⁷个第4天鸡胚细胞的浓缩仙台病毒株strs1(109i.e./ml)。在第一次注射期间观察到温度升高(39.2℃)，持续一天。第二次注射导致较低的温度(37.4℃)，持续12小时。在后续几轮的注射期间没有温度反应。psa动力学为如下：2500ng/ml(开始)；2700ng/ml(开始后10天)；930ng/ml(开始后33天)；以及220ng/ml(开始后4个月)。

在开始后第5个月施加第二种病毒。以两周间隔，肌内注射呼肠孤病毒1型株strr1(2×10⁸pfu/ml、2ml)，持续三个月。在第一次注射后，除了持续不到一天的轻微温度升高(37.2℃)之外，没有不良反应。psa：270ng/ml(第14天)；184ng/ml(第31天)；56ng/ml(第105天)。

实施例15

患者e.b.(44岁女性)六年前被诊断患有卵巢癌，伴有转移至脐区、腹膜，腹膜区中的实体瘤(32mm×16mm；52mm×35mm)和胸膜炎。脑中的转移通过射波刀移除。接着，患者经历12轮的化疗。然后，患者经历复发，在此期间在腹部发现两个肿瘤(14mm×9mm和23×16mm)。са-125–299。

在2个月时间内，在20个位置处，向患者每两周皮内注射混合了10⁷个第4天鸡胚细胞的浓缩仙台病毒株strs1(10⁹i.e./ml)。尽管患者总体病情得到改善，但超声研究显示负动力学。

然后，向患者每两周肌内注射纯化的溶瘤病毒混合物：艾柯病毒12型株str7e12，柯萨奇病毒b3型株str12b3和呼肠孤病毒1型株strr1(各10⁸pfu)，持续两个月。

超声检查显示正动力学。目前，患者正在接受肌内注射溶瘤病毒混合物，该混合物含有艾柯病毒1株str4e1、sabin脊髓灰质炎病毒1型株和新城病毒来源株strnh1。患者的病情得以稳定。

实施例16

患者v.s.(42岁女性)四年前被诊断患有乳腺癌并且经过手术切除。该患者还被诊断转移至肝、肺和腹膜。患者经过14轮的化疗并且复发。发现肝中的三个肿瘤部位(22mm×14mm；26mm×18mm；18mm×20mm)和肺中的肿瘤部位(15mm×18mm)。

在3个月时间内，在20个位置处，对患者每两周皮内注射混合了10⁷个第4天鸡胚细胞的浓缩仙台病毒株strs1(10⁹i.e./ml)。超声研究显示正动力学，并且肝中的肿瘤缩小至12mm×6mm；7mm×6mm和5mm×8mm，且肺中的肿瘤缩小至4mm×6mm。

实施例17

患者l.p.(51岁女性)四年前被诊断患有胃癌并且经过手术切除。已显示转移至右肺上叶(32mm×37mm×28mm)以及在整个左右肺上散布的多个小的转移。还显示转移至骨(th9-l2、l4)。cea＝367.2。

在3个月时间内，在20个位置处，向患者每两周皮内注射混合了10⁷个第4天鸡胚细胞的浓缩仙台病毒株strs1(10⁹i.e./ml)。ct扫描显示该过程的稳定和有限的正动力学。即，肺中的主要转移稳定在28mm×25mm×20mm。

在第4个月开始，向患者每两周肌内注射溶瘤病毒混合物，该混合物包括2ml的含有纯化艾柯病毒1株str4e1、呼肠孤病毒1型株strr1和新城病病毒株strnh1的混合物(各2×10⁸pfu)。患者病情稳定。

实施例18

患者k.i.(52岁女性)被诊断患有输卵管癌，转移至淋巴结和腹膜，以及腹水。四年前将肿瘤通过手术移除，并且两年前患者开始复发。十轮的化疗导致正动力学；然而，第二次复发已导致腹水快速积累。

通过穿刺术获得250ml的腹水。腹水中的肿瘤细胞数为2×10⁵个细胞/ml。将细胞用汉克斯盐溶液洗涤并且在补充了10％fbs的dmem/f12培养基中以5×10⁵个细胞/ml的密度接种至板。三天后，大多数细胞附着，且这些板达到汇合。将一部分细胞在液n2中冷冻，剩余的细胞继续在培养物中生长。分离少数单个克隆并繁殖，冷冻用于将来的实验使用以及用于患者的特异性肿瘤抗原的来源。另外，将2×10⁶个由腹水获得的细胞与matrigel混合并皮下注射到裸小鼠中。缓慢生长的肿瘤在接种后四周变得可见。

将腹水来源的癌细胞用于测试其对一组溶瘤病毒的敏感性。将细胞接种至24孔板，达到亚汇合，并且用不同溶瘤病毒以1-5i.e./细胞感染。在感染后三天，对细胞的细胞病理效应评分，然后冷冻-解冻，并且通过在敏感细胞(cv1和mdck，取决于病毒株)的系列稀释滴定对释放的新繁殖病毒进行定量。

发现细胞对以下病毒是高度敏感的：sabin脊髓灰质炎病毒1型株，str4e1，str13cb4，str15cb6，strr1，strnh1和strmesc1。发现细胞对str7e12、str8a7、str14cb5和strr2是部分敏感的。发现细胞对strs1、str17e21、strmuvd1(溶瘤腮腺炎病毒株)和strcdv1(溶瘤犬瘟热病毒株)是抗性的。

基于这些数据，形成两个溶瘤病毒组。第1组由str4e1、str13cb4和strr1组成。第2组由str15cb6、atrnh1和strmesc1组成。将第1组(2ml)以双周间隔肌内注射，2×10⁹。在治疗两个月后，患者病情有显著改善。腹水停止积累并且通过超声检查未再检测到腹水。患者的总体病情也得到改善。

实施例19

患者d.n.(54岁男性)被诊断患有第四期胰腺癌，并且没有施用化疗或手术。肿瘤位于胰体中(38mm×45mm×24mm)，具有清晰边缘。少量腹水、左侧胸膜积水、胆总管梗阻通过支架缓解。ca19-9＝4557u/ml，cea＝8.08ng/ml。

在2个月时间内，在20个位置处，患者接受每两周注射的混合了10⁷个第4天鸡胚细胞的浓缩仙台病毒株strs1(10⁹i.e./ml)。在第2月结束时，ca-19-9升高并且达到9845u/ml。

然后，将溶瘤病毒混合物变为含有艾柯病毒1株str4e1、呼肠孤病毒1型株strr1和柯萨奇病毒a7株str8ca7(各2×10⁸pfu)的溶瘤病毒混合物。每两周肌内注射溶瘤病毒(2ml)。ca-19-9动力学为如下：9845u/ml(开始)；9567u/ml(第32天)；以及5764u/ml(第75天)。

实施例20

患者l.n.(58岁女性)四年前被诊断患有卵巢癌。进行了卵巢和子宫的手术切除。该患者还被诊断为转移至腹膜淋巴结和腹水。

收集腹水并检查。没有检测到活的癌细胞。由于腹水快速积累，通过穿刺术腹膜内注射strs1病毒(10ml，含有10⁹i.e.的病毒)。温度反应为如下：38.9oc(第2天)；37.8oc(第3天)；以及37.2oc(第4天)，然后低常温持续三天。到第4天腹水积累减慢并且到第25天几乎检测不到。患者的总体病情得到改善。从第14天开始，在20个位点，向患者每两周皮内注射施用混合了10⁷个第4天鸡胚细胞的浓缩仙台病毒株strs1(10⁹i.e./ml)。患者病情稳定。

实施例21

患者k.s.(68岁女性)被诊断患有第四期胰腺癌(其中原发性肿瘤在胰头区中)，并且转移至胰旁淋巴结、脾(13个月前切除)、腹膜、纵隔淋巴结和左肾上腺。在治疗开始时ca-19-9标志物为243。化疗使得ca19-9标志物至93u/ml。

在9个月时间内，在20个位置处，向患者每两周皮内注射施用混合了10⁷个第4天鸡胚细胞的浓缩仙台病毒株strs1(10⁹i.e./ml)。在接下来的三个月期间ca19-9继续下降至58.5u/ml。然后，在接下来的三个月中观察到ca19-9逐渐升高至308u/ml，然后在一个月期间升高至940u/ml。在接下来的三周内，ca19-9升高至5962u/ml，然后升高至15888u/ml(五周)。

在两个月时间内，每两周肌内注射含有str4e1、str11cb2和str14cb5的病毒混合物。观察到以下的ca19-9标志物的动力学：16813u/ml(两周后)，12944u/ml(四周后)，以及13121u/ml(六周后)。附图表明，所观察到的ca19-9的指数升高停止，甚至有一定程度的下降。然而，在随后几周中，过程恢复–接下来两周–22876，接下来两周–随后几周、过程恢复：22876u/ml(八周后)，34589u/ml(十周后)，以及100345u/ml(十二周后)。纵隔区中的液体开始积累。将其收集并检查肿瘤细胞。将这些细胞接种至细胞培养物并且繁殖以进一步检查其对溶瘤病毒的敏感性。

实施例22

患者n.s.(76岁女性)四年前被诊断患有结肠癌(乙状)。将肿瘤通过手术移除，伴有结肠与直肠连接的修复。观察到转移至肝和回肠。两年前将回肠部分切除，并且患者经过化疗使疾病稳定。一年前，该患者被诊断患有恶性黑素瘤并且转移至腹膜后和腹股沟淋巴结。考虑到伴随的病理状况(主动脉重度动脉粥样硬化病变、心硬化和肺气肿)，不建议进行化疗。

向患者每两周肌内注射施用溶瘤病毒混合物：艾柯病毒7株str6e7、呼肠孤病毒1株strr1和新城病病毒株strnh1(以下株各10⁹i.e.)。有强烈的温度反应，持续三天，通过止痛剂(布洛芬和双氯苯酸(diclophenac))有效阻断。三周后，超声检查显示腹膜后和腹股沟淋巴结轻微缩小。

实施例23

患者s.e(42岁女性)被诊断患有颗粒细胞卵巢癌，转移至腹膜。一年半前通过手术移除肿瘤。组织学检测证实颗粒细胞癌，成人型，t1anxm0。观察到手术后疾病进展，包括腹膜癌扩散和腹水。

手术后，患者经过5个疗程的化疗(3个月)，包括3天顺铂100mg，依托泊苷200mg3号；卡铂450mg和依托泊苷200mg2号。化疗后，超声检查显示疾病进一步进展。观察到充满液体并用隔膜隔开的大形成物：在小骨盆的左侧高达51mm；在右侧，高达65mm。

将化疗方案改为：四个一天疗程的紫杉醇，260mg。尽管如此，疾病恶化。沿髂血管可见大容量的形成物，呈不规则的囊状生态结构，87mm×57mm，伴有沿着隔膜的供血。在右侧腹膜后间隙，肾下极下方，观察到55mm×35mm的类似大容量囊性结构。

施用三线化疗：施用五个疗程的3天异环磷酰胺(ifosfamidum)2克，mesna2克，顺铂30mg，依托泊苷150mg。化疗看起是无效的。

在手术后一年开始溶瘤病毒治疗。患者经过在背部(椎骨附近)每周皮内注射体外混合了2×10⁶个第5天鸡胚成纤维细胞的strs1(仙台病毒的溶瘤株)(10⁸ie)。对第一次施用的反应是在注射后约20小时温度升高至37.8℃，持续10小时。对第二次施用的反应是轻度温度升高(37.2℃)，持续5-6小时。后续施用没有反应。患者经过溶瘤病毒治疗，持续3个月的时间。

在病毒治疗后，超声检查显示显著改善的迹象。在腹膜腔中没有看到液体。随后的mr断层检查显示显著改善，其中肿瘤结节数量及其体积减少。参见图7。gadovist造影剂不再聚集。

实施例24

患者o.l.(49岁女性)被诊断(两年前)患有脑弥漫性星形细胞瘤，ii级。发现左额叶的一个巨大轴向内肿瘤。

两年前，患者经过清醒开颅手术以部分移除肿瘤。在手术期间，患者经历局灶性和大癫痫发作，这限制了监测语言功能的能力。整个手术过程中进行运动诱发电位(mep)和运动功能的电生理监测。在当观察到mep下降和水肿脑减压时(其在手术开始时处于重大压力)，停止进一步切除并且结束手术。手术后，患者显示右侧轻偏瘫伴有运动言语障碍，这在当向患者提供高剂量类固醇与甘露醇输注几小时后得到改善。术后ct显示，类似于术前mri照片，部分切除腔没有出血和严重水肿。手术之后几天，患者恶化，并且变得昏迷且交流少。提高类固醇剂量以及甘露醇输注的频率，同时控制钠水平。预后不容乐观。

手术后，患者经过一个疗程的远距离适形放射治疗(30次的2gy；总计60gy)。病情稍微改善。

患者随后经过6个疗程的利用替莫唑胺(temozolomide)(250mg)的化疗。发现总的动力学为负的。ct扫描显示在脑中造影物质聚集增多。十三个月前，重复利用temodal的化疗疗程，同样没有显著改善。

一年前，开始溶瘤病毒治疗。肌内注射呼肠孤病毒1株(strr1)10⁹ie。初始反应包括轻度肠道不适和非常温和的温度升高(37.2℃-37.5℃)，持续几小时。随后的施用持续一个月，没有不良反应。mri显示小的正动力学。

每周施加(肌内地10⁹ie)str4e1(艾柯病毒1)持续一个月。没有观察到不良反应。

然后每周施加(肌内地10⁹ie)str14cb5(柯萨奇病毒b5)持续一个月。在第一次施加期间引起疲劳和晕眩。在第二次施加期间没有不良反应。脑mri显示疾病稳定化。观察到中度的正动力学。

每周肌内注射str14cb5(柯萨奇病毒b5)10⁹ie持续两周以上。没有观察到不良反应。mri和pet/ct显示正动力学，减小了造影部分的尺寸。

每周肌内施加str8ca7(柯萨奇病毒a7)10⁸ie持续3周。在第二天在第一次注射后观察到轻度疲劳。第二次和第三次注射没有导致不良反应。

然后，每周肌内施加脊髓灰质炎病毒1型(sabin株)10⁸ie，持续两周。在第一次注射后的第二天观察到轻度寒颤。在第二次施用后未出现不良反应。mri显示进一步正动力学，减小了造影区的尺寸(图8)。

继续肌内注射脊髓灰质炎病毒1型(sabin株)10⁸ie。没有出现不良反应。患者的病情显著改善。患者几乎正常地交流，更可唤醒并且每天行走2-3小时。

实施例25

患者n.d.(59岁男性)被诊断(三年前)患有位于胰体中的胰管腺癌。超声检查显示胰体中的肿瘤-44mm×35mm，肠系膜上动脉和腹腔主干狭窄，脾肿大。a19-9肿瘤标志物水平为125u/ml，cea水平为5ng/ml。腹腔镜辅助穿刺肿瘤活检后，a19-9标记物升高至512u/ml。一年后，ca19-9肿瘤标志物升高至2338u/ml，然后(四个月后)升高至4557u/ml。黄疸是由于胆总管梗阻而发生的。引入支架来治疗该病症。ca19-9＝7416u/ml。

使用strs1(仙台病毒的溶瘤株)(10⁸ie)来开始溶瘤病毒治疗。在患者椎骨附近的背部进行16次每周皮内注射strs1。对第一次施用的反应是温度升高至37.8℃-38℃(可用阿司匹林管理)，持续4小时。跟进施用没有副作用。

病毒治疗后四个月的超声检查显示肿瘤体积从45mm×38mm减小至42mm×32mm，以及腹部游离液体的量和整体正动力学的减少。ca19-9标志物水平为2878u/ml。

三种病毒str4e1(艾柯病毒1(2×10⁸i.e./ml))、strr1(呼肠孤病毒1(5x10⁷i.e./ml))和str8ca7(柯萨奇病毒a7)(10⁸i.e./ml)的混合物通过肌内注射施加。在注射后14小时发热。温度升高至38.5℃并且保持升高持续4-5小时(未服用阿司匹林)，然后下降至37.2℃-37.4℃并且在接下来的24小时期间停留在此水平。在随后的三天经历疲劳。重复三种病毒混合物的注射。反应是温和温度(37.5℃)持续5小时。病情稳定，观察到正动力学。ca19-9标志物水平为1316u/ml。

实施例26

患者i.v.(39岁女性)被诊断(六年前)患有三阴性乳腺癌(右乳)t2n0m0，恶性3级，侵袭性基底细胞表型。患者经历了右乳和局部淋巴结的根治性扇形切除。患者经历了6个疗程的辅助化疗：多西他赛(docetaxel)+阿霉素(doxorubicin)，然后是放射(γ)治疗。该疾病进展，转移至左肺、甲状腺、肝(左叶)和左肾上腺。患者又经历了6个疗程的化疗：贝伐单抗(bevacizumab)840mg，卡铂(carboplatine)auc6，每3周一次加上每周注射紫杉醇(paclitaxel)(120mg)。初步观察到部分缓解，接着观察到整体负动力学。

两年前，利用strs1(仙台病毒)开始溶瘤病毒治疗。在背部椎骨附近施加16次皮内注射。两个月之后，计算机断层检查显示正动力学。肺中的结节从19mm×20mm缩小至10mm×15mm。观察到肿瘤的局灶性钙化，并且还观察到在肿瘤附近形成充气结构(17mm)。

strs1治疗继续，但接着是负动力学。观察到肺转移的尺寸增大至60mm×46mm×55mm。还注意到腹水积累，转移到骨盆区、卵巢、子宫并穿透至膀胱，伴随有腹膜后淋巴结的增大。

提取腹水(830ml)用于检查。该液体含有肿瘤细胞的球状聚集体(1-1.5×10⁵个细胞/ml)。将收集的全部腹水体积进行离心以收集肿瘤细胞。将细胞用dmem洗涤并且在50％fcs、10％dmso中在液氮中冷冻用于进一步测试病毒敏感性。

测试癌细胞的病毒敏感性。它们看起来对strs1(仙台病毒)敏感，然而，发现腹水含有高效价的抗strs1/中和抗体。对癌细胞进一步测试，它们看起来对strnh1(新城病病毒，h株)、str4e1(艾柯病毒1)、脊髓灰质炎病毒sabin株(1、2、3型)和str14cb5(柯萨奇病毒b5)敏感。这些细胞还显示对str15cb6(柯萨奇病毒b6)的中度敏感性并且看起来对str8ca7(柯萨奇病毒a7)和str17e21(艾柯病毒12)不敏感。

患者经历了腹膜内施用2x10⁸i.e.str4e1(艾柯病毒1)。在施用后16小时体温升高至38.5℃(通过阿司匹林管理)，并且在接下来的24小时内回到正常。腹水体积显著减少。患者的总体病情得到改善。

治疗继续，其中静脉内注射200ml的2×10⁸i.e.str4e1(艾柯病毒1)，输注40分钟(每周一次，持续7周)。计算机断层检查显示显著正动力学的迹象。肺转移缩小至26mm×19mm×21mm，腹膜后淋巴结大小减小至4-5mm，在腹腔中没有观察到腹水，并且骨盆内的肿瘤块减小至38mm×41mm×48mm。

治疗继续，其中两个疗程的肌内注射str14cb5(柯萨奇病毒b5)1×10⁸i.e.和两个疗程的静脉内注射200ml的str14cb5(柯萨奇病毒b5)2×10⁸i.e.，输注40分钟。计算机断层检查显示显著正动力学。肺转移缩小至15mm×10mm，腹膜后淋巴结在ct中变得看不见。骨盆中的肿瘤块减小至16mm×17mm。病情稳定。

实施例27

患者t.d.(39岁女性)被诊断(三年前)患有位于左弯区域中的结肠腺癌t4n2bm0。该患者经历腹腔镜辅助左半结肠切除术，接着是八个疗程的辅助化疗(folfox方案)，其是无效的。疾病进展。在原发性肿瘤区域以及另外在胰尾和左肾中都发现代谢活性的肿瘤组织。转移扩散至左卵巢，发生腹膜癌扩散和腹水。

一年前，收集200ml的腹水(细胞计数～4x10⁴细胞/ml)，将肿瘤细胞分离并测试其对病毒的敏感性。肿瘤细胞看起来对以下各项高度敏感：脊髓灰质炎病毒(1、2、3型)sabin株、str6e7(艾柯病毒7)和str7e12(艾柯病毒12)、str15cb6(柯萨奇病毒b6)、strnh1(新城病病毒，h株)和麻疹病毒(埃德蒙顿(edmonston)疫苗株)；对以下各项中度敏感：str14cb5(柯萨奇病毒b5)、strs1(仙台病毒)和str8ca7(柯萨奇病毒a7)；并且对以下各项具有低敏感度：str4e1(艾柯病毒1)、strr1(呼肠孤病毒1)和strr2(呼肠孤病毒2)。

同时(一年前)，该患者经历后续手术，即移除复发肿瘤，切除左肾和肾上腺，远端切除胰腺，切除脾，切除输卵管和卵巢二者，以及切除大网膜。手术后是九个疗程如下施加的xelox化疗：每21天一次，奥沙利铂(oxaliplatine)120mg/m²和卡培他滨(capecitabine)2000mg/m²，在第1天和第14天经口施用。化疗较差耐受，伴有神经病征和大量催吐反应。疾病进展。

六个月以前，病毒治疗从肌内注射str7e12(艾柯病毒12)和str15cb6(柯萨奇病毒b6)的混合物开始，每次2x10⁸i.e.。反应是在注射后22小时温度升高(37.5℃-38.0℃)、有些头痛和发冷(持续2-3小时，二者都被阿司匹林和布洛芬所抑制)。然后是更具侵袭性的治疗方案，通过静脉内施用病毒str7e12(艾柯病毒12)和str15cb6(柯萨奇病毒b6)，每周两次，持续7周，200ml2x10⁸i.e.i.v.输注持续20分钟。

在一个月的病毒治疗之后，进行多螺旋计算机断层扫描。胸部：c2，右肺，少数7、10、12mm的病灶，与病毒治疗前的检查相比，轮廓较不清晰。с6，右肺-8mm；左肺，上叶口旁(paraortal)(c3–直至c1)14mm×15mm，无动力学。肺组织模式可见正常化(之前是被强化的)并且以前见过的病灶的尺寸有所减小-c2，右-从4mm至2mm，c10–作为纤维拉伸；其他病灶不是清晰可见的。没有新的病灶形成。肺的体积保持不变，肺区域是对称的，并且气管和支气管未被阻塞并且没有变形。在胸膜区未见游离液，并且胸膜厚度正常。显示心包腔内有少量液体积累，位于心尖贲门附近。纵隔为正常结构。在纵隔和肺根部中，发现多至8mm的孤立淋巴结。所有组的淋巴结尺寸都缩小到几乎正常值。在腹部，肝尺寸正常，具有光滑且清晰的轮廓。在c2、c4、c5、c6中，存在低密度小病灶，具有液体密度，轮廓清晰，多至10mm。它们没有积累造影物质，无动力学，也没有形成新的病灶。在c7中，在肝动脉和静脉期，可见一个低密度区，具有不均匀轮廓，多至4-6mm，无动力学，没有新的病灶。肝内和肝旁胆管未扩张。胆囊具有均匀轮廓并且具有正常厚度的壁。在胰腺旁组织区中看到一个均匀的圆形构造，具有低密度中心，15毫米，显示除了一个更明显的低密度中心，无动力学。腹部区域未发现腹水。胃小弯区中的淋巴结最多可达8mm(缩小的)，并且在肝门中的淋巴结可达10mm(缩小的)。结论是，病毒治疗导致稳定化和正动力学。

病毒治疗继续。施加脊髓灰质炎病毒1型(sabin株)和str6e7(艾柯病毒7)的混合物，2x10⁸i.e，i.m.注射(每周)。对该混合物的反应是在第一次施用之后有些发冷、疲劳、温度升高至37.2℃-37.6℃。症状进一步改善。患者稳定。

strs的兽医用途

恶性疾病是老年狗和猫死亡的主要病因。来自测试组的一些溶瘤病毒可以有效地感染狗和猫来源的细胞。这些溶瘤病毒包括仙台病毒株strs、新城病病毒株strnh1、犬瘟热病毒株strcdv1(基于活cdv疫苗株开发的)、呼肠孤病毒1、2和3型strr1、strr2和strr3。这些毒株在兽医诊所进行测试用于治疗家养猫和狗。

肥大细胞瘤是狗中最常见且致死肿瘤之一。肿瘤可以局限于皮下并且易于通过手术接近。然而，在手术移除之后，它们趋于导致原发性肿瘤区域和远端区域中极具侵袭性的生长转移。

为了测试溶瘤病毒是否可以用于治疗，利用strs1和strr1溶瘤病毒。

实施例28

赫什(hersh)(一只13岁的贵妇犬)被诊断患有前爪区域的肥大细胞瘤。肿瘤快速生长(在三周内尺寸从5mm×5mm至25mm×30mm)。将肿瘤通过手术移除。在第14天开始，在手术缝合区域中检测到恶性肿瘤生长。向肿瘤区域皮下注射浓缩strs1，间隔为5分钟。总计施用15次注射，每次0.2ml(2×10⁸i.e./ml)。肿瘤生长停止，并且截至第14天，没有可见肿瘤块的迹象。缝合有效地愈合，在接下来的8个月内没有进一步的肿瘤生长。

实施例29

伊斯特拉(istra)(一只11岁的沙皮狗)被诊断患有在左后区的肥大细胞瘤。肿瘤快速生长(34mm×56mm)并且不考虑手术。向肿瘤的10个不同区域注射2ml的strs1。周围皮肤也注射strs1(0.2ml/注射)，总计12次注射。在注射之后两天存在肿瘤的肿胀。在注射之后10天肿胀退去。肿瘤尺寸没有显著减小，但是肿瘤停止生长。在注射后四个月，将肿瘤切除并检查。组织主要含有纤维化区域和一些非典型的圆形细胞。在随后的五个月期间没有观察到肿瘤生长的复发。

实施例30

观察狗中的二十七例肥大细胞癌病例。在狗中利用肥大细胞肿瘤的初步经验之后，观察对其施加利用strs1进行治疗的肥大细胞肿瘤的一些其他病例。在肥大细胞癌的总计27例病例中，15例病例表现出在每两周三次strs1注射之后，一年以上稳定无复发疾病治愈。五只狗代表具有肿瘤细胞的系统性扩散的终末病例，其中主人最终决定安乐死。用于长期评价的七例病例无法追踪。

实施例31

观察猫中的十四例肥大细胞癌病例。十例病例代表局限于皮下的肥大细胞肿瘤，并且四例病例是具有肿瘤系统性扩散的终末期。在局限性肿瘤的病例中，将肿瘤和周围区域每两周用浓缩strs1注射三次。来自该组的八只猫具有阳性响应同时没有疾病的进一步进展达至少六个月。两只猫对治疗没有响应并且死亡。在具有肥大细胞肿瘤的系统性扩散的四例病例之中，两例具有部分响应，在随后两个月期间具有复发生长。这些之中，向一只猫(8岁雌性性)注射strr1到所有六个可见肿瘤中。肿瘤生长停止达至少一个月。该猫的命运未知。

实施例32

杰克(jack)(一只14岁的犬)被诊断患有右后肢骨肉瘤，将其移除。在手术后一个月观察到复发生长。向肿瘤部位注射5ml的浓缩strs1。总计，五次注射渗入肿瘤周围的部位。存在肢体的肿胀，持续三天，伴随明显的局部温度升高。注射后三周的超声检查显示过程稳定并且肿瘤部分缩小。在注射后64天肿瘤生长重新开始。向肿瘤区域注射5ml浓缩strr1(2×10⁸i.e./ml)。同样肢体的肿胀，持续三天。注射后两周的超声检查显示过程稳定。在接下来的两个月没有复发。

实施例33

穆拉(mura)(一只9岁的猫)被诊断患有局部扩散的乳腺癌，将其通过手术移除。在手术后两个月观察到复发生长。向肿瘤区域注射含有strs1、strnh1和strr1的浓缩病毒混合物。存在局部肿胀，持续一周。肿瘤生长停止，并且至少两个月没有复发。

讨论

总体来说，柯萨奇病毒a7/str8сa7；柯萨奇病毒b5/str14св5；以及柯萨奇病毒b6/str15св6已显示对肿瘤生长的阳性治疗效果。

如图1a-1c中所示，较差复制的病毒在来源于裸小鼠中的相同细胞的异种移植肿瘤中不显示溶瘤活性。相反，在异种移植肿瘤中展示强复制活性的病毒能够破坏异种移植肿瘤。即，如在图1a中可见的，向c33a细胞的异种移植肿瘤施加柯萨奇病毒a7/str8сa7导致在50天时间内比对照(单独的c33a细胞)或施加至c33a细胞的柯萨奇病毒b3显著更小的肿瘤体积。类似地，如在图1b中可见的，向aspc1细胞的异种移植肿瘤施加柯萨奇病毒b4导致在50天时间内比对照(单独的aspc1细胞)或施加至aspc1细胞的柯萨奇病毒a7显著更小的肿瘤体积。此外，如在图1c中可见的，相比于对照(单独的mcf7细胞)或施加至mcf7细胞的柯萨奇病毒b6/str15св6，艾柯病毒1在施加至mcf7细胞时已显示更大的效力。

这些结果表明，根据要施用病毒的细胞/肿瘤的类型，特异性病毒具有特异性效果，表明需要确定患者特异性敏感性以确定应该施用什么病毒。

患者特异性敏感性可在比较基础上进行测量。对特定人病毒展现敏感性的肿瘤样品可以产生多至10⁶-10⁷tcid50/ml。然而，一种病毒可以显示比另一种病毒更大的tcid50/ml，表明对一种病毒有更大的敏感性。这样的比较不仅提供了用于选择哪种类型的单一病毒可以被选择的手段，而且提供了选择它们是否可以用于一组病毒的手段。

如上文所讨论的，多组病毒可以顺序或同时施用。同时使用病毒混合物的效力在裸小鼠的异种移植实验中被证实，该裸小鼠带有来源于c33a人宫颈癌细胞系的肿瘤并且注射了在细胞中展现不同传播能力的单一病毒以及两种或三种病毒的混合物(图2)。如所显示的，对于a431细胞最有效的组是艾柯病毒12与柯萨奇病毒b5和柯萨奇病毒b6的组。事实上，这些溶瘤病毒证实了对于a431细胞的加和效果。艾柯病毒12导致在50天内在延缓肿瘤体积方面的单一最大治疗效果；然而，该效果在加入柯萨奇病毒的情况下复合，其相比于单独的柯萨奇病毒b5和柯萨奇病毒b6也显示复合的效果。

以上公开的实施例还表明，生物选择病毒和诱导诱变可产生不与抗血清交叉中和的病毒。这样的技术还可以应用于生物选择以下的溶瘤病毒，其a)将不会彼此发生相互作用和b)将不会与其他癌症治疗如化疗、放射、药物治疗等发生相互作用。

合成/系统性靶向补救措施(str)的制造已导致在人和动物二者中的有效肿瘤治疗。关于溶瘤病毒在人中的应用，所施用病毒的效果是肿瘤特异性的。例如，脐尿管腺癌对于strs1、strr1、strmesc1、str4e1、str7e12、str14cb5、str15cb6是高度易感的，并且对于str8ca7是抗性的。然而，前列腺腺泡腺癌显示对单独的仙台病毒株strs1的易感性，由此表明对患者和癌症特异性溶瘤病毒的选择是最有效治疗的关键。

关于兽医应用，strs1和strr1显示减小肿瘤生长和复发的显著效力。在狗和猫二者中的每两周注射导致严重减小的肿瘤块以及纤维化(瘢痕组织)的形成。

尽管已经描述了特别的实施方案，但是对于申请人或本领域的其他技术人员可以出现未预见到的或可能目前未预见到的替选方案、修饰、变化、改进和实质等同。因此，如所提交的以及如它们可能被修改的所附权利要求书意图涵盖所有这样的替选方案、修饰、变化、改进和实质等同。

序列表

<110>satortherapeuticsllc

<120>优化的溶瘤病毒及其用途

<130>sato200002usp1

<160>2

<170>patentinversion3.5

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<211>6630

<212>dna

<213>脊髓灰质炎病毒sabin株1型

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